富含亮氨酸的重复受体激酶样疾病性抗性基因家族的一对矫正物调节稻米响应升高的温度

背景

大米xa3 / xa26.抗病基因编码富亮氨酸重复(LRR)受体激酶型蛋白Xanthomonas oryzae.pv。oryzae（XOO)，属于多基因家族。然而，这个家族中大多数基因的功能尚不清楚。

结果

在这里，我们报告了这个家族的两个直系亲属NRKE.从水稻品种日本裸和9RKE.综艺93-11驾驶台基因座，虽然编码不同的蛋白质，但功能相似。这对直系亲属不能调解抵抗XOO，但它们通过升高的温度转录诱导。转录激活NRKE.要么9RKE.导致形成温度敏感的病变模拟物，其是与转基因植物的不同器官的超氧化物积累相关的死细胞的斑点。这些植物比野生型对照对高温冲击更敏感。携带嵌合蛋白的转基因植物由NRKE的LRR结构域和XA3 / XA26的激酶结构域组成的XA3 /Xα26的损伤模拟物相同的病变模拟物NRKE.- 植物，而携带另一种嵌合蛋白质的转基因植物，其由Xa3 / Xa26的LRR结构域和NRKE的激酶结构域组成的不含病变模拟物。携带嵌合蛋白的所有转基因植物易受XOO．

结论

这些结果表明驾驶台基因座参与水稻对高温的反应。RKe蛋白的LRR结构域对于感知温度升高很重要。rke参与的温度相关途径与Xa3/ xa26介导的抗病途径可能部分重叠。

抗病性(R.）介导种族特异性抗性的基因对于植物免受各种病原体发作的植物来说是重要的。目前，许多人R.已经对基因进行了描述，其中大多数编码具有共同特征的蛋白质。特征R蛋白最普遍的结构域是富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)，它是病原体识别的主要决定因素[1]．相对较多的含有lrr的R蛋白属于核苷酸结合位点- lrr类[2];大多数的特征R.基因反对magnaporthe oryzae.，导致水稻真菌爆炸，属于这一课程[3.]．第二类是LRR受体样R蛋白，其包括细胞外LRR结构域和跨膜基序[4.];没有米饭R.到目前为止，这类基因的特征已经确定。最后一类包括LRR受体激酶样R蛋白，目前只在水稻中发现[5.那6.]．LRR结构域和激酶结构域是许多信号通路中常见的结构。植物有大量的LRR受体激酶样蛋白[7.]．所有LRR受体激酶样蛋白都包含一个跨膜基序，该基序离开LRR结构域，留在血浆外[7.]．因此，作为细胞表面受体，被认为通过LRR结构域识别特殊细胞外配体的LRR受体激酶样蛋白，并引发通过细胞内激酶结构域的下游信号传导。

大米R.基因xa3 / xa26.具有种族特异性的抗性Xanthomonas oryzae.pv。oryzae（XOO)，引起细菌性枯萎病，这是世界上最具破坏性的水稻疾病之一，它编码一种LRR受体激酶样蛋白[6.]．xa3 / xa26.属于在水稻染色体长臂的串联聚集的多基因家族11 [8.那9.]．积极选择的点突变是这个家庭演变的主要力量[9.]．该家族的两种同源基因(同一水稻品种)和同源基因(不同水稻品种)具有相似的组织特异性表达模式，表明它们可能具有相似的功能[10.那11.]．此外，至少一些该家族的副病剂具有剂量效应，其中它们的抗病函数与其转录量相关[12.那13.]．的表达xa3 / xa26.在发育管制。它在早期发育阶段具有较低水平的表达，但在晚期发育阶段的表达水平较高，导致水稻植物携带xa3 / xa26.容易受到一些XOO菌株在苗期表现出较强的抗性XOO成年阶段的菌株[12.]．水稻植株结构性过度表达xa3 / xa26.具有扩大的电阻谱，抗性水平增加，以及整体生长阶段抗性，而不会影响其形态和农艺性能[12.那14.]．此外，在xa3 / xa26.位点给予持久的抵抗XOO[15.]．另一个帕拉戈xa3 / xa26.家庭，这MRKA.，无法调解抵抗XOO当被其原生启动子调控时，但是MRKA.可以赋予部分抵抗XOO当受到强组成启动子的调控时[13.]．

确定其他帕拉戈尔科克的功能xa3 / xa26.家族，我们表达了这个家族的两个直系，NRKE.和9RKE.，来自两种稻米品种，在驾驶台轨迹。这一对直系亲属不能调解抵抗XOO他们的谬误也一样xa3 / xa26.和MRKA.在目前的实验条件下。然而，它们与水稻对温度升高的反应有关。

质粒构建与水稻转化

过度表达9RKE.和NRKE.在水稻中，利用聚合酶链反应(PCR)引物NRKe-F和NRKe-R扩增这两个基因(附加文件)1和籼稻品种93-11(表S1)的基因组DNA奥雅萨苜蓿l . ssp。籼稻）来自粳稻品种Nipponbare的细菌人工克隆（BAC）OSJNBA0004O15（o.苜蓿l . ssp。japonica.)作为模板。PCR产物经酶切BAM嗨并连接到转化载体pu1301中，含有玉米泛素基因启动子以驱动插入的基因[12.]．

研究不同领域的功能NRKE.，两种突变NRKE.是生成的。激酶domain-deletedNRKE.， 这NRKe——ΔK，利用引物NRKe-F和B+E-3进行PCR扩增，删除lrr跨膜基序NRKE.， 这NRKE-K.，利用引物RKe-6F和NRKe-R进行PCR扩增(附文件)1、表S1)。以Nipponbare BAC OSJNBa0004O15为模板，扩增两个截断的基因。PCR产物在玉米泛素基因启动子的调控下连接到pU1301。两个嵌合基因,BE1和BE2，由不同的碎片组成NRKE.和xa3 / xa26.，通过重叠扩展PCR扩增[16.]．PCR引物MKB-F，B + E-1，B + E-2和NRKE-R用于构建BE1利用引物NRKe-F、B+E-3、B+E-4、MKb-R进行构建BE2（附加文件1、表S1)。利用BAC 3H8扩增出两个嵌合基因xa3 / xa26.，由水稻品种明恢63 (o.苜蓿l . ssp。籼稻)和Nipponbare BAC OSJNBa0004O15为模板。PCR产物在玉米泛素基因启动子的调控下连接到pU1301。

所有构建体分别转移到农杆菌肿瘤术电穿孔法分离菌株EHA105。水稻转化是通过农杆菌属水稻品种牡丹江8号(o.苜蓿l . ssp。japonica.）[17.]．

病原体接种

用菲律宾疫苗接种植物XOO通过叶片剪切方法在引导（胰穗发育）阶段进行PXO61，PXO86，PXO71和PXO99 [18.]．在接种后2周，通过测量疾病面积百分比(病变长度/叶长)来对病害进行评分。

温度处理

在分蘖期，在温室中生长的水稻植株被转移到生长室进行温度试验。生长室条件控制在湿度70%、光照14小时和黑暗10小时(24°C或35°C)。对于热休克，转基因和野生型植株在同一花盆中生长，转移到42°C的生长室中32 h(直到花盆中一组植株的叶片几乎全部卷起来，部分叶片死亡)。然后在室温下保存3 d恢复植株，并记录表型。

基因表达分析

RNA凝胶印迹分析如前所述[19.]．一个343-bp的探针NRKE.和9RKE.,消化使用BAM你好,囊I取自引物NRKe-F和NRKe-R扩增的PCR产物(附加文件)1，表S1)，用于杂交。使用基因特异性引物进行定量逆转录- pcr (qRT-PCR)(附加文件)1，表S1)，如前所述[20.]．首先利用肌动蛋白基因的表达来规范每个qRT-PCR的RNA样本。每个基因qRT-PCR检测至少重复2次，每次重复3个重复。当重复实验得到相似的结果时，只给出一次重复的结果。表达水平相对于对照被提出。

启动子序列分析

在假定的独联体的启动子区域的作用元素NRKE.和9RKE.在PlantCAREhttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/和地点http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/数据库。

过度表达驾驶台导致了水稻植物中类似病变的形成

帕拉洛克驾驶台的R.基因xa3 / xa26.家庭只存在于一些稻米品种中[9.]．的驾驶台水稻品种93-11和日本晴的基因，命名为9RKE.[GenBank登录号：JN176871]和NRKE.[JN176870]分别具有99.6％的序列同一性。两种基因都借助于由1097个氨基酸组成的蛋白质，但具有五分之差差异（图1A）.

至少有一些副科目xa3 / xa26.家庭在水稻互动中具有剂量效应[12.那13.]．确定是否NRKE.和9RKE.同样在水稻疾病抵抗力中运作，我们在易感水稻品种牡丹江8中构成它们的过度表达它们，其中驾驶台没有检测到。与之变换的22和17个独立的变换子NRKE.和9RKE.和命名NRKE.oe和9RKE.-oe分别得到。一些T_0.植物表现出NRKE.要么9RKE.（附加文件1，图S1）。所有的T._0.植物被接种了XOO在引导阶段的菌株PXO61和所有植物都易受野生型牡丹江8.毕竟是_0.在收获种子后，植物在接地水平上方约12厘米处切割，从残留物中的再生植物接种其他XOO菌株PXO86，PXO71或PXO99。转基因植物易受这些植物XOO菌株为野生型植物。两个独立的T₁从两个t产生的家庭_0.植物中NRKE.注射XOO菌株PXO61进行进一步分析，但两个家庭没有与野生型牡丹江8的差异。这些结果表明NRKE.和9RKE.米中可能没有角色 -XOO交互。

有趣的是，22人中有11人NRKE.oe T_0.17种植物中的12种9RKE.oe T_0.在成虫期，植株在叶片、叶鞘和圆锥花序梗上发育出类似的棕色病变(即类似感染的斑点)1B.）.在植物生长的任何阶段，都可以出现类似病变的小病变，并在生长过程中逐渐发育为大病变，但局限于起始点附近的区域。当转基因植物在无菌试管或烧瓶中生长时，病变也可能自发形成(附文件)1,图S2)。这些结果提示病变的形成与病原体感染无关。

使用台盼蓝的可见病变模拟染色转基因植物的叶子，死细胞的指示器[21.]，病灶周围呈深蓝色斑点;这种深蓝色斑点在野生型植物的叶片中没有观察到(图)1C）.自荧光，一种在超敏反应细胞死亡过程中产生的酚类化合物的指示物[22.]，在紫外线刺激后显微镜下的转基因植物叶片的病灶模拟部位也被检测到;在野生型植物的叶子中检测到自发荧光（图1C）.具有可见病变模拟物的叶子也用3,3-二氨基苯胺蛋白和硝基蓝四唑鎓染色，H₂O.₂和超氧化物分别[23.]．3,3-二氨基苄啶和硝基蓝四唑染色后，转基因植株的叶片在病变模拟部位的暗染明显增加，表明H₂O.₂和转基因植物中的超氧化物(图1C）.这些结果表明病变的病变NRKE.oe和9RKE.-oe植物与细胞死亡有关，细胞死亡可能与H₂O.₂．因为NRKE.oe和9RKE.-oe植物发育出类似的病变模拟物，只有NRKE.- 植物用于一些进一步的分析。

以确定病变模拟的发展是否由于过度表达NRKE.，两个t.₁家庭 （NRKE.-oe6和NRKE.-oe15）衍生自两个t_0.进一步研究了发生病变模拟的植物的表型和是否存在NRKE.oe构造。病变拟象在叶片上的发育与胚芽的存在共分离NRKE.在两个家庭（图1D）.这些结果表明过表达NRKE.导致了水稻自发病变的形成。

病变形成类似于NRKE.- 植物是温度敏感的

病变模拟形成是植物复杂的生理反应，可能由多种生物或非生物因素引起。因为NRKE.-oe植物似乎与水稻无关XOO在这些植物中，病变拟态的形成可能受到其他环境因素的影响。实际上，有两批NRKE.在我们的实验中产生了-oe植物。第一批转基因植株于初夏大田种植，在植株生长至孕穗期时，叶片上观察到明显的病变模拟。约50 d后产生第二批转基因植株，于夏末田间种植。第二批植株在秋季生长到孕穗期时，未见明显的类似病变。但当第二批植株转移到温度高于田间条件的温室后，它们的叶子上形成了明显的病变模拟物。这些观察使我们推断温度可能影响病变模拟的形成。

为了测试这一推理，两组相同的植物，包括NRKE.oe和9RKE.- 植物，野生型牡丹江8，水稻品种Nipponbare（捐赠者）NRKE.)和93-11 (9RKE.）在每个组中，在分蘖期的不同温度下生长。本套植物分别在24℃和35℃下生长10至18d。在24℃下生长的所有植物都没有病变模拟。对于在35℃下生长的植物组，NRKE.oe和9RKE.- 在35°C分别在10和18d的情况下形成的植物在叶子上形成标记的病变模拟，而控制牡丹江8，Nipponbare和93-11没有病变（图2A）.当24°C-PRETREATED时NRKE.-oe和对照植株转入35°C，转基因植株而非对照植株在35°C生长后，甚至在3 d时叶片上也出现了病变模拟(图)2B.）.这些结果表明，较高的温度可能会诱导损伤模拟物的形成NRKE.oe和9RKE.oe植物。

温度影响了表达NRKE.和9RKE.

以确定温度是否受到转录的影响NRKE.和9RKE.，我们相比分析了表达NRKE.和9RKE.在不同温度的野生型植物中。在35°C时，表达NRKE.和9RKE.在温度处理12 h后显著诱导，在1 d后恢复到基础水平;与未经处理的对照植物相比，35°C处理后12小时，转录本增加了约2- 2.5倍(图)3A）.将温度提高至42℃进一步增加了表达NRKE.和9RKE.；的成绩单NRKE.和9RKE.在处理后12小时分别增加约30倍和7倍。然而,NRKE.和9RKE.在24℃条件下，表达量只有轻微的增加。

启动子区（大约2 kB的翻译起始密码子ATG）NRKE.和9RKE.有98%的序列一致性。对这两个序列进行推测分析独联体通过搜索不同的数据库来实现热应激响应的元素。最大规范的热休克元件（HSE）由交替定向以NgaAn的重复核序列（'表明任何核苷酸）组成[24.]．在启动子区域NRKE.和9RKE.，确定了两个不完美的Ngaan重复。第一个ngaan重复是'ActcaattCaggaat'NKRe和'ActcaattCaggata'的9RKE.，第二个是两种基因的“AgaatggagaactcataAATCTCA”（图3B.；额外的文件1,图S3)。这两个基因的启动子区域还含有另一个推定的HSE，与的HSE“AAAAAATTTC”互补芸苔属植物oleracea（数字3B.；额外的文件1,图S3)。在启动子区域也发现了四个CCAAT盒(图)3B.；额外的文件1,图S3)。据报道，CCAAT盒与HSEs协同作用以增加启动子活性[25.]．推定热响应的发生独联体- 和热诱导的表达表明NRKE.和9RKE.可能是对温度升高的早期反应。

激活NRKE.和9RKE.表达影响水稻对温度升高的反应

检查推理NRKE.和9RKE.参与水稻响应来增加温度，NRKE.oe或9RKE.-oe植物及其野生型植物在42℃下处理。治疗后,NRKE.oe和9RKE.-oe植物似乎对热冲击比相应的野生型植物更敏感（图4.）.与野生型植物相比，转基因植物的存活率较低。这些结果进一步表明驾驶台矫形器会影响水稻对温度的反应。

Xa3/Xa26的激酶结构域可替代NRKe的激酶结构域促进病变模拟

NRKE.推测编码一个受体激酶型蛋白，由两个结构域组成，一个LRR结构域和一个激酶结构域，它们通过一个跨膜基序连接。通常，这两个域在信号转导中以复杂的方式共同作用。一个例外是水稻XA21D，它是LRR受体激酶XA21的截短形式，具有抗性XOO．XA21D只有XA21的LRR结构域，但其功能与水稻中的XA21相似XOO相互作用(26.]．为了分析NRKe的不同域之间的关系，截断了两个域NRKE.片段分别在牡丹江8号水稻品种中过表达。一截NRKE.是NRKe——ΔK编码的蛋白没有NRKe的激酶结构域;另一个截NRKE.是NRKE-K.，只编码NRKE的激酶域（图5）.18和18个独立的变换子NRKe——ΔK和NRKE-K.,名叫NRKe——ΔKoe和NRKE-K.-oe分别得到。在同样的环境下，nrke-大江植物在其叶片上发育出明显的类似病变，但NRKe——ΔKoe和NRKE-K.- 植物没有病变（图5 b）.这些结果表明，完整的NRKE对病变模仿的发展很重要。

NRKE.是帕拉戈尔R.基因xa3 / xa26.这就产生了种族特异性的抵抗力XOO在水稻[6.]．NRKe和Xa3/Xa26蛋白的LRR和激酶结构域的序列同源性分别为68%和85%1，图S4）。为了确定LRR或激酶结构域是否对病变模拟的发展至关重要，我们构建了两种嵌合基因BE1和BE2，使用不同的片段NRKE.和xa3 / xa26.并在牡丹江8号水稻品种中过表达。的BE1由编码LRR，LRR，Juxtamembrane区域和XA3 / XA26的跨膜区的区域的序列和编码NRKE的激酶结构域的序列;这BE2由NRKe的LRR前区、LRR前区、近膜区、跨膜区编码序列和Xa3/Xa26激酶结构域编码序列组成(图)6）.

十一和13个独立转化体转变为BE1和BE2,名叫BE1oe和BE2-oe分别得到。所有的BE1-oe植株与野生型对照植株相比无病变，但13株中有8株无病变BE2- 植物在引导阶段在叶子上发育病变模仿（图6 b）.以确定病变模拟的发展是否由于过度表达BE2，两个t.₁家庭 （BE2-oe2和BE2-oe9)源自两个T_0.进一步研究了发生病变模拟的植物的表型和是否存在BE2构造。病变模拟的发展与存在的COSEGREGETEDATEDBE2在两个家庭（图6摄氏度）.这些结果表明XA3 / XA26的激酶结构域可以代替NRKE的激酶结构域诱导损伤模拟的形成。

因为xa3 / xa26.调解水稻抗性XOO，T._0.BE1oe和BE2分析了植物的响应XOO．大部分的T_0.BE1oe和BE2- 植物易受XOO菌株PXO61为野生型。两个BE1oe T₁家庭和二BE2oe T₁进一步接种PXO61。耐药性或易感性的增加与BE1oe或BE2-oe结构₁家庭（附加文件1，图S5）。这些结果表明激酶域NRKE.不能取代Xa3/Xa26激酶结构域在抗病中的功能。

LRR受体激酶样血浆膜蛋白是植物中最大的受体样激酶，并且该类蛋白质是不同生理活性期间信号转导的众所周知的成分[27.]．例如，Clavata1调节拟南芥中的干细胞维持和分化[28.]．BRI1通过芸苔类药物信号传播参与拟南芥生长和发展的调节[29.]．米Xa3 / xa26和xa21调解种族特异性和主要疾病抵抗力XOO[5.那6.]．RPK1在拟南芥萌发、生长和气孔关闭相关的脱落酸信号通路中的作用[j]。30.]．ERECTA指定拟南芥成熟器官的大小和形状[31.]．LRR受体激酶样基因可能与抗性相关异皮线虫属甘氨酸在大豆和抵抗力h·甘氨酸温度敏感[32.那33.]．这里提出的结果添加了另一个例子，即这种类型的蛋白质，米NRKE和9RKE似乎参与了水稻对增加的温度。此推断得到了以下证据的支持。首先，两者NRKE.和9RKE.与对照相比，是由更高的温度诱导的。第二，这对同源基因的激活导致水稻对高温更加敏感。

RKe的LRR域对温度升高的感知至关重要

作为受体，LRR受体激酶样蛋白的胞外定位LRR结构域在信号转导中识别并结合配体，包括蛋白质、多肽或非蛋白成分[7.]．例如，BRI1的LRR结构域通过与芸苔属相互作用，芸苔类固醇的活性形式介导芸苔类固醇信号传导[34.]．拟南芥FLS2介导的免疫通过将细菌鞭毛蛋白衍生的肽FLG22结合到其LRR结构域来引发[35.]．水稻xa21调控的小种特异性抗病是通过结合由XOO到其LRR域[36.]．中直系亲属的构成表达驾驶台位点导致病变模拟物的形成，这与温度升高有关(图2）.因此，病变的外观类似于NRKE.- 要么9RKE.转基因植物是水稻对高温反应的标志NRKE.- 要么9RKE.- 尽管病变模拟物的出现没有代表生理条件的表现。不同嵌合基因携带植物的病变模拟或病变的可自由表型表明RKE蛋白的LRR域对病变模拟的诱导至关重要（图6.）.这些结果反过来表明，病变模拟的形成可能与温度相关配体与LRR结构域的结合有关。

自发形成的病变模拟在叶NRKE.-，9RKE.- - - - - -,BE2在组织培养期间观察到在灭菌容器中培养的转发植物，这表明与NRKE和9RKE的LRR结构域结合的配体，以诱导温度敏感病变模拟物的形成不是来自改变的环境。因此，我们认为配体可以源于水稻。当温度上升时，出现的配体或其浓度增加，并且RKE与配体相互作用以引发下游反应。然而，需要进一步研究来检查该假设。

RKE和XA3 / XA26的下游路径可能部分重叠

LRR受体激酶的细胞内局部激酶结构域是通过LRR结构域识别的信号转导的表演者[7.]．先前的报告揭示了一种完整的LRR受体激酶样蛋白，包括XA3 / XA26家族中的LRR和激酶结构域对赋予疾病抵抗很重要;该家族中寄生虫的激酶结构域可以部分地替换抗性蛋白XA3 / XA26的激酶结构域的功能响应于XOO[13.]．与此前一份报告一致，我们的目前的结果表明，缺少激酶结构域（NRKE-ΔK）的截短NRKE的激活也不是NRKE（NRKE-K）激活的激活可以促进病变模拟的形成。XA3 / XA26的激酶结构域（在BE2的情况下）可以恢复NRKE-ΔK在促进损伤模拟的形成方面的功能。然而，NRKE的激酶结构域不能取代XA3 / XA26的激酶域（在BE1的情况下）XOO阻力。这些结果表明，Xa3/Xa26的激酶结构域可以提供NRKe激酶结构域在病变模拟形成中的所有功能，但后者不能提供前者在抗病中的功能。因此，NRKe和Xa3/Xa26下游通路的某些组分可能是共享的。

以上推论也得到了事实的支持NRKE.和xa3 / xa26.属于串联集群R.基因家族;该家族基因编码的LRR结构域的一些氨基酸位点受到正向选择的影响，而这些基因编码的激酶结构域具有进化保守性，提示该家族激酶结构域的功能受限[9.]．然而，并非该家族的所有拟同源基因都具有抗疾病能力，尽管它们有相似的组织特异性表达模式[11.那13.]．目前的结果表明，一些谬误R.基因家族可能还参与了其他的生物过程，比如NRKE.和9RKE.．

单倍型的串联重复谬误及其在不同单倍型中的同源性R.基因家族提供了不同的抗性特异性和一个序列库，为进化力量迅速产生新的R.基因(37.]．前一份报告显示，番茄的一个副宫R.基因美国专利商标局家庭，这分，对一种有机磷杀虫剂——倍硫磷具有敏感性[38.]．我们的结果进一步表明，“被打败的”R.基因，就像NRKE.和9RKE.除了作为创造新基因的结构库之外，还可以参与水稻对温度升高的反应。

该工作得到了中国国家自然科学基金的补助金（30930063,30921091）。

隶属关系

1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，国家植物基因研究中心(武汉)，武汉430070

   海涛张，盈龙曹，京钊，仙华李，京华萧＆运输王

通讯作者

对应于运输王．

作者的贡献

HZ进行了功能互补和基因表达分析并起草了手稿。YC和JZ提供生物化学和转基因技术支持。XL和JX提供分子分析支持。SW对数据解释和手稿的撰写做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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