GmPHD5在大豆对盐胁迫的响应中是组蛋白H3K4二甲基化和H3K14乙酰化串扰的重要调控因子gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

越来越多的证据表明，组蛋白翻译后修饰(ptm)的特定模式及其串扰可能决定转录结果。然而，这些“组蛋白编码”在植物中的调控机制在很大程度上仍然未知。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们首次证明了盐胁迫诱导的含有GmPHD5蛋白的PHD(植物同源结构域)手指结构域可以读取甲基化H3K4的“组蛋白密码”。GmPHD5与其他DNA结合蛋白相互作用，包括GmGNAT1(一种乙酰转移酶)、GmElongin A(一种转录延伸因子)和GmISWI(一种染色质重塑蛋白)。我们的研究结果表明，GmPHD5可以识别特定的组蛋白甲基化的H3K4，优先于二甲基化的H3K4。在这里，我们证明GmPHD5和GmGNAT1之间的相互作用是由GmGNAT1的自乙酰化调节的，GmGNAT1也可以乙酰化组蛋白H3。GmGNAT1表现出对乙酰化组蛋白H3K14的偏好。这些结果表明甲基化的H3K4和乙酰化的H3K14之间存在组蛋白串扰。与其在盐胁迫下基因调控中的作用一致，我们发现GmPHD5可以结合大豆中一些已确认的盐诱导基因的启动子。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在这里，我们提出了一个模型，表明核蛋白GmPHD5能够调节不同赖氨酸残基的组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化之间的串音。然而，GmPHD5还可以募集盐胁迫诱导基因的染色质重塑因子和转录因子，调控盐胁迫诱导基因的表达。gydF4y2Ba

先前的研究表明，H3、H4乙酰化和H3S10磷酸化等组蛋白修饰参与了植物盐胁迫[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。染色质免疫沉淀(ChIP)研究表明，干旱胁迫应答基因的编码区H3K4me3、H3K9ac、H3K14ac、H3K23ac和H3K27ac的水平发生改变，包括RD29A (gydF4y2BaRgydF4y2Baesponsive-to -gydF4y2BaDgydF4y2Ba胰脏蛋白29A)、RD29B (gydF4y2BaRgydF4y2Baesponsive-to -gydF4y2BaDgydF4y2Ba胰脏蛋白29A)和RD20 (gydF4y2BaRgydF4y2Baesponsive-to -gydF4y2BaDgydF4y2Ba在干旱胁迫条件下，它们被激活[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。此外，盐反应蛋白的蛋白质谱分析表明，盐耐受性可能部分受谷胱甘肽s -转移酶控制，该酶在抗氧化防御机制中起关键作用[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。然而，这些过程的详细分子机制仍然难以捉摸。gydF4y2Ba

有人提出，在HeLaS3细胞中，核蛋白可以通过PHD手指结构域读取组蛋白密码[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。例如，含有TFIID蛋白的PHD指可以通过H3K4me3选择性地锚定在核小体上[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。甲基化的H3K4被广泛认为是积极转录基因的标记物，因为它能够招募其他核蛋白[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在植物中，含有PHD指结构域的蛋白可能参与植物春化介导的表观遗传沉默和花期调控等不同的生理过程gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。其他含有PHD指结构域的蛋白，如ORC1(起源识别复合体的大亚基)可以与H3K4me3结合，调节H3K4me3的复制起始和转录过程gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

也有证据支持PHD指结构域蛋白与盐胁迫之间的密切关系。alfin样蛋白的博士手指gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba可以结合组蛋白H3K4me3/2 [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和苜蓿的表情gydF4y2BaAflin1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAlfin1gydF4y2Ba盐胁迫诱导AL类基因[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

最近的一项研究表明，大豆中PHD同源蛋白(GmPHD)定位于细胞核中，并在盐度胁迫下被上调[j]。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在本研究中，我们发现GmPHD中的一个蛋白(GmPHD5)可能作为甲基化H3K4的“读码器”，调控乙酰化H3K14，从而控制盐胁迫下靶基因的表达。gydF4y2Ba

GmPHD5是一种含有PHD指结构域的蛋白gydF4y2Ba

为了阐明PHD蛋白在大豆中的功能，我们获得了PHD蛋白的全长编码区gydF4y2BaGmPHD5gydF4y2Ba(见材料和方法)，包含756 bp，编码由251个氨基酸组成的蛋白质(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1A)。智能分析gydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.de/gydF4y2Ba证实在其C端存在一个PHD指结构域(具有典型的C4HC3模式)(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(图S1B)。此外，氨基酸序列比对分析(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(图S1C)表明GmPHD5的PHD手指结构域也包含与组蛋白修饰相互作用相关的特征。它含有保守的芳香氨基酸，对于PHD手指结构域识别组蛋白甲基化H3K4通过形成凹槽非常重要[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]和带负电荷的氨基酸，这些氨基酸对保持H3R2甲基化在另一个槽中很重要。结果与其他PHD指结构域蛋白一致[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

GmPHD5在大豆中的表达gydF4y2Ba

用合成肽免疫家兔产生GmPHD5抗体(见材料和方法)。抗gmphd5抗体能识别分子量约为35 kD的大豆蛋白提取物蛋白和重组GST-GmPHD5蛋白。免疫前血清作为阴性对照(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，图S2)。检测到的GmPHD5分子量略大于预期值(28 kD)，这可能是翻译后修饰所致。由于在表达时没有翻译后修饰gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba，发现重组GmPHD5分子量为28kd，与预期一致(见附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，图S2)。gydF4y2Ba

采用western blotting技术研究了GmPHD5在大豆中的表达规律。发现GmPHD5蛋白在叶片和根中普遍表达(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。此外，在盐度胁迫下，两种组织中GmPHD5蛋白水平均升高(图2)gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

GmPHD5与组蛋白甲基化的H3K4相互作用gydF4y2Ba

序列比对分析表明，GmPHD5可能与组蛋白甲基化的H3K4相互作用(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，图S1C)。为了验证我们的假设，我们表达了GST-GmPHD5融合蛋白gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，用大豆叶中提取的组蛋白孵育。我们的结果清楚地表明GST-PHD5可以共同沉淀组蛋白H3和H2A(图2)gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)和甲基化组蛋白H3K4也在这些共沉淀组蛋白H3中得到证实(图2)gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

由于H3K4可以存在于单甲基化、二甲基化或三甲基化状态，我们继续确定GST-GmPHD5融合蛋白相互作用对这些修饰的偏好。本研究中的肽拉下实验表明，GST-GmPHD5对二甲基化的H3K4表现出优先的相互作用(图2)gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。然而，GST-GmPHD5也能同时识别H3K4me和H3K4me3，亲和力很低(图2)gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)，这一结果在其他含有PHD指结构域的蛋白(如ING蛋白和BPTF)中并不常见[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与GmPHD5相互作用的非组蛋白的鉴定gydF4y2Ba

我们将GST-GmPHD5融合蛋白与大豆核提取物孵育，以确定GmPHD5是否可以招募其他核蛋白(图2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。抗甲基化H3K4的Western blotting结果显示，组蛋白H3被成功拉低(图3)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)，验证了GmPHD5可以识别组蛋白甲基化的H3K4的概念。我们随后用质谱法鉴定了这些蛋白。两个非组蛋白的身份被成功地确定为拉长蛋白A和GNAT (gcn5相关的n-乙酰转移酶家族蛋白)(见附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，图S3A和S3B，表S1)。gydF4y2Ba

从大豆基因组草图中，我们成功鉴定出GmGNAT的两个亚型，即GmGNAT1和GmGNAT2 (GmGNAT1是上述质谱鉴定的亚型)。这两种异构体的编码区核苷酸序列同源性为89%，氨基酸序列同源性为87%，均含有保守的乙酰转移酶结构域(见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，图S4)。GmElongin A是RNA聚合酶II转录因子SIII(长链蛋白)的一个亚基，其N端具有特征特征结构(见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，图S4)。gydF4y2Ba

随后将这两个基因的cDNA克隆到MBP载体中，生成融合蛋白(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这两种MBP融合蛋白被用于研究gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba蛋白与GST-PHD5的相互作用结果显示MBP-GNAT1和mbp -拉长蛋白A融合蛋白均被抗GST-PHD5抗体拉低(图2)gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，这证实了我们之前的总核蛋白拉下结果。gydF4y2Ba

为了研究GmPHD5的哪个部分负责与GmGNAT1和GmElongin A相互作用，我们表达并检测了截断的GmPHD5类似物gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．将不含PHD指结构域的N端多肽和只含PHD指结构域的C端多肽分别与GST融合(图2)gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba下拉实验表明，GmPHD5的N端多肽比PHD手指结构域对GmGNAT1具有更强的亲和力(图2)gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。另一方面，截断的GmPHD5会严重损害其与GmElongin A的相互作用(图2)gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)，表明GmPHD5全长在其与GmElongin A相互作用中的重要性。gydF4y2Ba

GmGNAT1是一种乙酰转移酶gydF4y2Ba

在GmGNAT1中存在乙酰转移酶结构域，表明它可能将乙酰基从乙酰辅酶a转移到底物上。然而，它的底物仍然难以捉摸。gydF4y2Ba

由于GmGNAT1与GmPHD5相互作用，它可能通过GmPHD5被募集到组蛋白H3。为了检验GmGNAT1是否能乙酰化GmPHD5和组蛋白H3，我们利用特异性识别乙酰化赖氨酸的抗体检测这一事件。结果表明，GmGNAT1处理后，提取的大豆组蛋白H3的乙酰化程度增加gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。由于组蛋白H3中有几个相邻的赖氨酸位点(例如H3K9、H3K14、H3K18)发生乙酰化，我们使用了能够区分每个位点的抗体。虽然组蛋白H3赖氨酸9和赖氨酸18的乙酰化程度没有太大变化(数据未显示)，但GmGNAT1处理后，乙酰化的H3K14显著增加(图1)gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。然而，在类似的实验中，GmPHD5未观察到明显的乙酰化信号(图2)gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，这表明GmPHD5可能不是GmGNAT1的底物，尽管它们可以直接相互作用。gydF4y2Ba

更有趣的是，我们发现GmGNAT1可以自乙酰化，因为只有当GmGNAT1存在时才能检测到乙酰化信号(图1)gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。虽然GmGNAT1上乙酰化的确切位置尚不清楚，但我们发现，GmGNAT1的乙酰化会损害其与GmPHD5的相互作用(图5)gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

GmPHD5也与GmISWI相互作用gydF4y2Ba

ISWI (gydF4y2Ba我gydF4y2BamitationgydF4y2BaWSI公司gydF4y2BaTch)是一种高度保守的蛋白质，存在于哺乳动物的酵母中[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。ISWI包含几个生物学上重要的结构域，如DEXDx、HELICs和SANT，并通过水解ATP来重塑染色质结构。先前的报道表明，一些含有PHD指结构域的蛋白，如ING1和ING2，可以与ISWI相互作用以促进基因转录[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们获得了大豆ISWI (GmISWI)的截断类似物的克隆:DEXDx结构域(MBP-ISWI1，残基1至残基436)和GmISWI的其余部分(MBP-ISWI2，残基437至残基974)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。在GST下拉实验中，我们发现只有MBP-ISWI1能被GST- gmphd5下拉，而MBP-ISWI2不能被GST- gmphd5下拉(图2)gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)，说明GmISWI的N端可以与GmPHD5相互作用。gydF4y2Ba

为了进一步证实GmISWI和GmPHD之间的相互作用，我们合成了GmPHD5和GmISWI1的肽段，培养抗体进行共免疫沉淀实验(图2)gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。用anti-GmPHD5免疫沉淀大豆叶片核提取物，沉淀剂中抗gmiswi1抗gmiswi1抗体检测GmISWI蛋白(图2)gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。相反，当第一步使用抗gmiswi1沉淀大豆核提取物时，抗GmPHD5抗体可以检测到含有GmPHD5结构域的蛋白。gydF4y2Ba

GmPHD5位于一些盐胁迫诱导基因的启动子和编码区gydF4y2Ba

采用抗gmphd5抗体和大豆染色质进行染色质免疫沉淀(ChIP)。我们检测到GmPHD5与两个盐度诱导基因(gydF4y2BaGmRD22gydF4y2Ba和gydF4y2BaGmGSTgydF4y2Ba;参见附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，图S4、S5和S6)。引物集(见附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba、表S2和图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)对应于两个盐度诱导基因的启动子和编码区(gydF4y2BaGmRD22gydF4y2Ba和gydF4y2BaGmGSTgydF4y2Ba)，用于本次ChIP实验。这些引物集合预测的扩增区域位置如图所示gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．发现GmPHD5与两个基因的启动子区域结合(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。为gydF4y2BaGmRD22gydF4y2Ba， GmPHD5也结合在其5'端附近的基因区域。作为阴性对照，GmPHD5与肌动蛋白基因和3' UTR区均无明显结合gydF4y2BaGmRD22gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，说明GmPHD5在基因组中的分布并不均匀，而是优先定位于盐胁迫诱导基因的调控区域。gydF4y2Ba

GmPHD5具有含有PHD指结构域蛋白的所有基本特征和特征(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，图S1)。当植物受到盐度胁迫时，GmPHD5的水平升高(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，提示GmPHD5在应激反应中的功能作用。这一观察结果与先前的发现一致，即GmPHD5在耐干旱和耐盐大豆品种中比敏感品系表达更高[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。顺便说一下，在大豆中有6个PHD5的同源物，它们对盐度、寒冷和干旱等非生物胁迫的响应不同，这表明虽然这6个gmph5是高度保守的，但它们的功能可能不同[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。本研究表明，GmPHD5可能采用与ING (Growth INhibitor)家族成员相似的机制，通过招募核蛋白复合物来实现相应的生理功能。gydF4y2Ba

GmPHD5可以与甲基化的H3K4相互作用，其氨基酸序列与苜蓿中的Alfin1和Alfin1样蛋白同源gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba．Alfin1是一种结合盐诱导子启动子的转录因子gydF4y2BaMsPR2gydF4y2Ba基因在苜蓿根中转录水平的表达增强[j]gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。一种大豆PHD型转录因子也能与之结合gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-element " GTGGAG "直接[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。甲基化的组蛋白H3K4可能不会启动GmPHD5与其靶DNA区域之间的相互作用。然而，甲基化的H3K4，特别是二甲基化的H3K4，肯定可以稳定或增强这种相互作用。gydF4y2Ba

研究表明，PHD手指结构域可以区分赖氨酸甲基化的状态。例如，BPTF、ING超家族成员和RAG2主要识别二、三甲基化组蛋白H3K4，而DNMT3L和BHC80结合H3K4me0 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。然而，显然没有发现表明PHD手指蛋白能够区分H3K4me2和H3K4me3。在本研究中，我们发现GmPHD5与三种H3K4甲基化组蛋白具有亲和力，其优先顺序为:二甲基化>单甲基化>三甲基化。因此，GmPHD5可以区分H3K4上所有甲基化状态的细微差异。gydF4y2Ba

我们目前的研究还发现了几种可以与GmPHD5相互作用的非组蛋白，包括GmGNAT、GmElonging A和GmISWI。GmGNAT属于GNAT家族，它催化乙酰辅酶A将乙酰基转移到伯胺。例如，酵母GNAT选择性地将乙酰基转移到组蛋白H3的K14和组蛋白H4的K8和K16上[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。我们的研究结果表明，GmGNAT1具有乙酰化H3K14的能力，也可能具有乙酰化自身的能力。这表明GmGNAT和GmPHD5可能在不同氨基酸残基上组蛋白甲基化和乙酰化的串扰中起重要作用。然而，GmGNAT的自乙酰化途径尚不清楚，需要更深入的结构分析才能得出确凿的答案。gydF4y2Ba

组蛋白乙酰化是转录调控系统的重要组成部分[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。乙酰化可以中和组蛋白的正电荷，减弱dna与组蛋白的接触，导致染色质结构松动，从而诱导基因转录[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。同时，组蛋白乙酰化也影响氨基末端尾部与其他非组蛋白染色质蛋白之间的相互作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们的研究报告了甲基化H3K4和乙酰化H3K14之间的一种新型组蛋白修饰串扰，这可能导致基因转录的协调调节。为了进一步探索上述组蛋白串扰的基因激活机制，确定所有能与GmPHD5相互作用的转录因子和染色质重塑因子是很重要的。我们的工作提供了证据表明GmPHD5可以招募GmElongin A [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。据报道，长链蛋白复合物是由a、B和C亚基组成的异源三聚体。其中亚基A具有激活转录的功能，提示GmElongin可能起到类似的作用。此外，GmPHD5还可能募集染色质重塑因子GmISWI，该因子利用ATP水解产生的能量来改变核小体的位置和/或结构。gydF4y2Ba

GmPHD5蛋白在组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化、募集基因转录因子和染色质重塑因子等相互作用中起关键作用。这表明组蛋白甲基化-乙酰化串扰系统(包括组蛋白PTMs、GmPHD5、GmGNAT1和GmISWI等元件)构成了基因激活机制的基础。例如，由于GmPHD5在盐胁迫下增加，并且可以与选定的盐胁迫诱导基因的启动子相互作用，这种串扰系统可能有助于大豆在胁迫下形成独特的转录调控机制。gydF4y2Ba

我们的ChIP结果表明GmPHD5位于启动子区近端区域，甚至位于编码区。这与之前的研究结果一致，甲基化的H3K4位于类似的区域[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。我们认为GmPHD5和组蛋白甲基化-乙酰化串扰系统可能广泛分布于盐胁迫诱导基因中，并调控其表达。在图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，我们提出了一个模型来描述表观遗传效应(甲基化组蛋白H3K4)对大豆对盐胁迫的反应。在高盐度条件下，大豆植物组蛋白二甲基化H3K4可能显著增加。随后，组蛋白编码H3K4me2被GmPHD5识别，GmPHD5同时存在于盐度诱导基因的启动子和编码区。gydF4y2BaGmRD22和gstgydF4y2Ba，请参阅附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(图S5和S6)，并可能在这些基因的激活过程中起到调节作用。该调控复合体可以招募基因表达辅助因子，包括染色质重塑因子GmISWI和基因转录延伸因子GmElongin a。同时，该调控复合体还可以通过招募组蛋白乙酰转移酶启动邻近残基的乙酰化，进一步激活盐诱导基因。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，“组蛋白编码”H3K4me2可以被盐胁迫诱导的PHD(植物同源结构域)指结构域蛋白GmPHD5识别，该结构域存在于盐胁迫诱导基因的启动子区和编码区。gydF4y2BaGmRD22和gstgydF4y2Ba)，并可能在这些基因的激活过程中起到调节作用。我们的数据还使我们提出了GmPHD5和组蛋白甲基化-乙酰化串扰系统的模型。我们相信我们的研究可以为核小体复合体中组蛋白和其他核蛋白之间串扰的分子基础提供见解。尽管如此，在分子水平上仍有许多其他问题需要解决，需要进一步的研究来解决这一假设的有效性。gydF4y2Ba

分子克隆gydF4y2Ba

总RNA从大豆(gydF4y2Ba大豆gydF4y2Bal .稳定。简历。结合)，并进行反转录，制成cDNA样本进行分子克隆，如先前报道的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。用于克隆的基因特异性引物和PCR设置的详细信息见附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba表S3。对于亚克隆到表达载体，agydF4y2BaBamHgydF4y2BaI (GGATCC)和agydF4y2Ba萨尔gydF4y2BaI (GTCGAC)位点分别添加到正向引物和反向引物的5′端。gydF4y2Ba

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上分离，纯化，用特异性限制性内切酶酶切gydF4y2BaBamHIgydF4y2Ba或gydF4y2Ba萨利·gydF4y2Ba(New England Biolabs)，并将其亚克隆到表达质粒载体(GST: pGEX-4T-1, GE healthcare, Wisconsin, USA，产品编号28-9545-49;MBP: pMAL-C2, New England Biolabs, MA, USA)用相同的限制性内切酶预消化。gydF4y2BaGmPHD5gydF4y2Ba插入GST表达载体，而其他克隆基因，gydF4y2BaGmISWI1, GmISWI2, GmGNATgydF4y2Ba,gydF4y2BaGmElongingydF4y2Ba，连接到MBP表达载体上。所有克隆均使用ABI PRISM™dRhodamine终止周期测序Ready Reaction试剂盒(Perkin Elmer, Connecticut, USA;产品编号:402078)，详见制造商手册。gydF4y2Ba

重组蛋白的表达gydF4y2Ba

将含有目标克隆的重组质粒转化到菌株DE3中。将转化后的细菌接种于添加100 μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani (LB)肉汤中，37℃孵育2.5 ~ 3 h，至600 nm处光密度达到0.6 ~ 0.8左右。然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，在25℃下诱导重组蛋白表达。隔夜表达后，收集细菌，悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，用1 mg/ml溶酶体在冰上裂解至少1小时。在21,500 g下，4°C离心15分钟后收集上清，-80°C保存待用。gydF4y2Ba

多肽合成和抗体生产gydF4y2Ba

多肽(GmPHD5: GKNERKRLFQMINDLPT，残基116 - 132和TPAKAEHIKQYK，残基230 - 241);GmISWI: GEEATAELDAKMKKFTEDAIK，残基596至残基616)采用Applied Biosystems 433A固相肽合成器的F-moc固相肽合成方案的标准程序合成。将合成的肽溶解于ml - q水中，用标准反相高效液相色谱法纯化，在ABI 4700蛋白质组学分析仪上用MALDI-TOF质谱法测定纯化肽的均匀性。gydF4y2Ba

纯化后的多肽与KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)偶联;美国密苏里州西格玛;产品编号:H8283)，如我们之前的工作所述[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。等量的完全弗氏佐剂(Sigma, Missouri, USA;产品编号:F-5881)与纯化肽- klh溶液(含约100 μg肽)混合，人工乳化。6 ~ 8周龄家兔皮下注射这些乳剂免疫。启动免疫后，兔接种不完全Freunds佐剂乳化抗原100 μg的增强剂(Sigma, Missouri, USA;产品编号:F-5881)(1:1)每隔两周三次。最后采集血清进行免疫印迹检测。在启动免疫前采集对照血清。所有兔子均在香港中文大学动物中心按动物伦理饲养。gydF4y2Ba

核酸蛋白提取gydF4y2Ba

将大豆叶片组织在液氮中磨成粉末，悬浮在含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM KCl、10 mM MgCl的分离核缓冲液(NIB)中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 6%蔗糖，0.6% Triton X-100, 0.05% β-巯基乙醇，1毫米苯基甲基磺酰氟(PMSF)，如前所述[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba做了一些修改。组织在冰上均质后，通过孔径为30 μm的滤纸。得到的细胞核部分在4000℃离心后收获gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后用NIB洗涤2次。gydF4y2Ba

分离的细胞核在低盐缓冲液(20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM KCl, 2.5 mM MgCl)中膨胀gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2 mM DTT和0.5 mM PMSF)，然后用高盐萃取缓冲液(500 mM NaCl, 25%甘油在低盐缓冲液中)提取总核蛋白[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。将提取的蛋白溶液中的NaCl浓度稀释至250 mM后使用。gydF4y2Ba

组蛋白提取gydF4y2Ba

核分离方法遵循上述核酸蛋白提取方案[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。白色细胞核在40%盐酸胍中重新悬浮。然后用0.4 M HCl提取核心组蛋白，12000 g离心10 min，上清液中的核心组蛋白在高速真空系统上干燥。gydF4y2Ba

GmPHD5与其他核蛋白相互作用gydF4y2Ba

GST- phd5融合蛋白首先结合到GST柱(GE healthcare, Wisconsin, USA;产品编号:17-0756-01)，与GST琼脂糖球室温孵育30min。选择的核酸蛋白涂于球上，4℃孵育过夜。用洗涤液(25 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 10%甘油，1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100)洗涤10次，然后用SDS-PAGE凝胶上样缓冲液在99℃下煮沸10分钟，然后进行凝胶分离。SDS-PAGE凝胶用银染色[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]将目标蛋白条带切除、分离、消化，然后进行MALDI-TOF/TOF鉴定[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba蛋白-蛋白相互作用研究，GST- phd5融合蛋白与MBP-ISWI、MBP-ISWI2、MBP-GNAT或MBP-elongin在GST柱中4°C独立孵育过夜。每个平衡柱用含有25 mM Tris (pH 8.0)、10%甘油、1 mM EDTA、500 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT、1% Triton X-100的缓冲液洗涤两次，然后用含有25 mM Tris (pH 8.0)、10%甘油、1 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT、0.1% Triton X-100的缓冲液洗涤6次。最后，分别回收每一柱的珠粒，用SDS page凝胶加载缓冲液在99°C下煮沸10分钟。按照所述进行Western blotting [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba使用抗mbp抗体。gydF4y2Ba

共免疫沉淀(co-IP)和肽拉下试验gydF4y2Ba

使用针对目标蛋白的特异性抗体进行共免疫沉淀(co-IP)测定。核蛋白提取物的复合物采用抗二抗的方法进行免疫沉淀，第二抗体通过免疫印迹法检测相互作用的伙伴。gydF4y2Ba

对于肽拉下试验，生物素偶联肽含有H3K4me, H3K4me2或H3K4meme3购买[Millipore, Massachusetts, USA;目录号:12-563(单-)，12-460(二-)，和12-564(三-)]。含有H3K9三甲基化的生物素偶联肽(Millipore, Massachusetts, USA;目录号:12-568)作为对照。将肽固定在亲和素琼脂糖珠上(Pierce, Illinois, USA;产品编号:20219)。重组GST-GmPHD5类似物与这些微球在4℃下孵育过夜。然后用含有25 mM Tris缓冲液(pH 8.0)、10%甘油、1 mM EDTA、500 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT、1% Triton X-100的缓冲液洗涤2次，然后用含有25 mM Tris缓冲液(pH 8.0)、10%甘油、1 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT、0.1% Triton X-100的缓冲液洗涤6次。最后，用SDS-PAGE凝胶上样液在99℃下煮沸10分钟，用抗gst抗体(Sigma, Missouri, USA;产品编号:G7781)。gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀(ChIP)测定gydF4y2Ba

ChIP检测使用染色质免疫沉淀测定试剂盒(Millipore, Massachusetts, USA;目录号:17-295)，请按照用户手册中的说明操作。大豆叶片首先在1%的甲醛中固定15分钟，加入终浓度为125 mM的甘氨酸终止固定。然后从固定的叶片中提取细胞核，重新悬浮在SDS裂解缓冲液中，在冰上孵育10分钟。对裂解物进行超声处理，将基因组DNA剪切至200-1000 bp之间。之后，样品在21,500 g下在4°C下离心10分钟。然后将收集的上清液用ChIP稀释缓冲液稀释10倍，并将这些收集的上清液中的1%作为输入样品。其余上清液随后用蛋白A琼脂糖/鲑鱼精子DNA(50%浆液)预清，在4℃搅拌1小时。然后加入免疫沉淀抗体，在4°C下旋转孵育过夜。随后，用蛋白A琼脂糖/鲑鱼精子DNA(50%浆液)珠状物沉淀抗体/蛋白/DNA复合物。然后依次用低盐、高盐、LiCl、TE缓冲液清洗头/抗体/蛋白/DNA复合物。 Bound protein/DNA complexes were then eluted from the beads with freshly prepared elution buffer (1% SDS, 0.1 M NaHCO_3.gydF4y2Ba)。为了逆转蛋白质-DNA交联，洗脱后的样品中加入5 M NaCl至终浓度为200 mM，在65℃下加热4 h以上。通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，最终从样品中回收总DNA。gydF4y2Ba

ChIP-PCR反应建立如下:4 ul模板(~ < 0.1 nmol)与0.4 ul dNTP (10 mM)、0.4 ul正向引物(10 uM)、0.4 ul反向引物(10 uM)、2 ul 10 × PCR缓冲液、0.25 ul Taq聚合酶(Promega, Wisconsin, USA)和1 ul MgCl混合gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(25毫米)。用蒸馏水将最终体积调整为20 ul。引物和PCR设置信息汇总在附加文件中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表2。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上溶解。gydF4y2Ba

体外乙酰转移酶活性测定gydF4y2Ba

MBP-GNAT重组蛋白与125 μM乙酰辅酶A (GE healthcare, Wisconsin, USA;产品编号:27-6200-01)，从大豆中提取组蛋白(或其他被测蛋白)60 μg, DTT 1.5 mM, 10%甘油，EDTA 0.15 mM，丁基钠15 mM，烟酰胺15 mM, PMSF 1 mM，蛋白酶抑制剂1 mM, 30℃孵育过夜。然后浓缩反应，用抗乙酰k抗体(Millipore, Massachusetts, USA;目录号:05-515)。gydF4y2Ba

我们感谢邵桂华教授(中国农业科学院)和黄福玲小姐(香港中文大学)对大豆种植的帮助。本研究获香港教资会卓越学科领域植物及农业生物科技计划AoE- b -07/09(致H.-M.;Lam S.S.-M。Sun和s.m。Ngai)，香港研资局一般研究基金468409(发给H.-M.;Lam)。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 香港中文大学生物学系及农业生物技术国家重点实验室，香港沙田gydF4y2Ba

   吴涛，皮二旭，蔡秀娜，林汉明，孙世明，倪世明gydF4y2Ba

2. 香港中文大学生物医学学院，中国香港沙田gydF4y2Ba

   姚华关gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaSai-Ming NgaigydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

PE和WT设计了研究，进行了实验，进行了组蛋白修饰分析，并起草了稿件。TSN进行质谱分析。SSM帮助起草了手稿。LHM和NSM构思和设计了这项研究，并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

吴涛、彼尔胥对这项工作也作出了同样的贡献。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba