正在发育的芝麻种子cDNA文库表达序列标签的分析(芝麻纪录）

背景

芝麻（芝麻纪录）是具有高油含量和富含营养价值高的最重要的油籽作物之一。然而，由于DNA和RNA序列资源差，芝麻中的遗传改善努力无法从分子生物学技术中受益。在该研究中，我们对显影芝麻种子进行了大规模的表达序列标签（EST）测序，并进一步对种子储存产物相关基因进行了分析。

结果

构建和随机测序的归一化和全长富集的cDNA文库，并随机测序，导致产生41,248个表达的序列标签（EST），然后形成4,713个Contigs和27,708个单身，具有44.9％的大学占用长度开放阅读框架。大约26,091名所有这些大学的人最重要的匹配与Genbank NR数据库的对应物，其中21,628分配给一种或多种基因本体（GO）条款。鉴定涉及油脂合成的同源基因，包括调节油脂合成的一些保守转录因子，例如叶状子叶1（LEC1），泡菜（PKL），皱纹1（WRI1）和其中大多数在芝麻籽中被发现。鉴定了一百和17个ests可能参与芝麻木质素，芝麻素和芝麻苷的生物合成。鉴定了总共9,347个推定的函数基因，其鉴定了芝麻基因组中总基因的三分之一。进一步分析了大学的鉴定了1,949个非冗余简单序列重复（SSRS）。

结论

本研究提供了在芝麻籽发育期间表达的基因概述。这种芝麻全长CDNA的集合涵盖了种子中各种各样的基因，特别是患有芝麻油和木质素的生物合成的候选基因。这些EST序列富含全长的序列将有助于对芝麻和其他油籽植物的比较基因组研究，并用作功能性标志性发育和功能基因研究的丰富信息平台。

芝麻（芝麻纪录L.）属于Pedaliaceae的家庭[1]是最古老的自花传粉油料作物之一。芝麻是含油量最高的油料作物之一，芝麻品种和种质种子含油量高达62.7%(平均52%)[2]当种子油含量的其他主要油作物花生（arachis hypogaea.)、油菜籽(芸苔属植物显著）和大豆（大豆）含有高达54.0％（平均50％）[3.]，高达46％（平均39％）[4.]高达27.9％（平均20％）[5.),分别。近红外光谱技术在不损害种子的情况下，对自然变异或杂交后代进行高通量筛选，可使油菜籽粒含油量达到50%以上，但仍低于长期存在的芝麻品种。此外，芝麻的蛋白质含量在干重中具有很高的营养价值(25%)，并具有独特的风味。芝麻油由于含有天然抗氧化剂如木脂素、芝麻素、芝麻素和种子发育过程中产生的芝麻素，因而具有很好的稳定性[6.]．这些天然抗氧化剂有助于提高抑制的健康品质Δ5-去饱和酶在哺乳动物中，增强维生素E生物活性，抑制人癌细胞的增殖[7.-10.]．Sesame Lignans也可能在芝麻抗害虫和微生物病原体中发挥作用[11.]．

高油含量合成和这些抗氧化剂的研究差，部分是因为DNA和RNA序列资源差。目前，Genbank只有约3,000个芝麻EST序列[12.]．缺乏序列信息和对相关合成生物学的理解不良已经阻碍了这些经济特征的遗传改善以及芝麻中的高不饱和脂肪酸含量。因此，我们在本研究中的客观是从芝麻的种子中建造一大集的EST系列。

在构建归一化全长cDNA文库之后，我们对图书馆进行了大规模测序，并从高油含量中国芝麻芝麻中的种子获得了40,000多个EST，并进一步对EST进行了重点进行了生物信息学分析参与石油和木质素生物合成的人。这些序列信息将作为用于生成分子标记，基因组注释，芝麻的基因发现和主要油籽作物油含量的基因发现的公众可接近的基本资源。

生成

为了了解油脂和木脂素的积累情况，确定EST测序的取样开发种子的时间，美国indicum）各种具有高油含量的中珠14及其对比苗qian，具有低油含量和早期成熟，以积累油，脂肪酸和木质血管。结果表明，两种品种具有不同的油含量，但脂肪酸组成的相似曲线（图1）.在授粉后10天开始，两种品种从授粉到成熟，油积累在大约25天内达到峰值。因此，取样时间确定为授粉后的5,20和30天。考虑年生产力（每公顷中志14公顷1321.5公斤，而苗qian每公顷425公斤）和种子的油含量，所以Zhongzhi 14被选为富含全长编码序列的cDNA文库[13.和EST测序。

cDNA文库的初效效价为1 × 10^6.通过X-Gal/IPTG筛选发现了90%以上的重组克隆的cfu/mL，并在开始大规模测序之前进行了小规模质量评估[13.]．从cDNA克隆中自动制备质粒dna，用Sanger法从5'端进行测序。

从45,569个cDNA克隆的单次5'测序中，总共有41,248条ESTs通过了高可信度碱基呼叫质量控制，平均读长约570 bp(图)2）.总体测序成功率为91%。本研究获得的EST序列保存在GenBank中，登录号为JK045130-JK086377。EST序列GC含量约为42.86%。41248条序列中出现2次以上的约占32.8%。

聚类ests.

筛选低质量的DNA和传染媒介序列的修剪后，PHRAP程序[14.]用于对EST序列进行聚类，并产生一个uniESTs数据集，其中包括4713个暂定的独特contigs (TUCs，见附加文件)1)和27,708个暂定唯一单例序列(TUSs, Table . tss)1）.tcs中ESTs的数量在2 ~ 92个之间，有超过65.5%的contigs具有2个est, 18.2%具有3个est, 15.2%具有4-10个est。

在这些大学中的序列中，80.6％对非冗余蛋白质数据库（NR）中的序列具有显着匹配，其中e值截止等于或小于10^－５．我们使用BLASTN的Genbank中的芝麻EST序列的大学数据集的比较显示，我们的数据集中只有349个最初的大学（1.1％）在Genbank中的903个芝麻Ests（E-Values≤10）^－５）（表中列出了这些大学的相关信息2）.

比较芝麻大学对抗的答:芥使用Blastx的蛋白质组数据库指出了这些大学中的40％，其中有很大的比赛答:芥（E值≤10^－５）.基于鉴定外科蛋白质（COGS）簇[15.] （数字3.)、10575个uniESTs(33.0%)被BLASTX鉴定为COGs。芝麻组与对照组各COG子类的比例分布相似答:芥种子[16.] （数字3.）.在这两组cDNA序列中，只有1360个sesame uniESTs被匹配答:芥种子基因（338基因）[16.其中20%参与翻译、核糖体蛋白合成，17%参与翻译后修饰、蛋白转换、伴侣。这些基因中只有1%与脂质转运代谢类别相关。

蛋白质编码区

识别了大学中的全长开放阅读框架（ORFS）。使用BLASTX的32,421个大学的同源性搜索，识别具有相对高相似性的大学（E-VIPES≤10）^－５）对于已知的基因，其中芝麻序列，各自在类似于Genbank中的蛋白质序列的位置处具有起始密码子，形成推定的全长ORF的数据集（44.9％）。此外，密码子使用表（表3.）对于使用Codonw生成的全长芝麻ORF。芝麻（美国indicum）含有14,669个密码子的密码子使用表显示预测的编码区（46.7％）的GC含量和第三位置的GC频率（46.4％）。分析是芝麻密码子使用表的第一个版本，该表未在Kazusa Codon使用情况数据库中呈现http://www.kazusa.or.jp/codon/．

基因本体论注释

使用BLAST2GO计划使用基因本体（GO）术语成功注释了18,549名的大学学位[17.]．然后使用InterProScan程序对另外3,079个序列进行注释[18.]．总的来说，共有21628个uniest被注释，111600个GO术语分布在三个主要的GO类别中。WEGO对9347个试验性独特基因(TUGs)进行了检测，这些TUGs代表了不同GO术语的21628个uniESTs [19.] （桌子4.）.

根据类别生物过程，分类“细胞过程”和“代谢过程”分别占拖船的注释约49.5％和46.2％，反映了这些过程的活度。在两个子类别中的细胞代谢过程（37.1％）和子类别“代谢过程中，主要代谢过程（36.4％），大分子代谢过程（27％）和生物合成（19.6％）（19.6％）占大比例，表明储存物质如油，木兰和蛋白质的活跃代谢。在对应于这些方法的情况下，在主要类别分子函数中，将41.8％的拖拽注释分组为子类别​​“催化活性”中的子类别“结合”，40.2％（表4.）.

芝麻籽种子中涉及石油生物合成的EST分析

比较分析表明，芝麻中与脂肪酸和油脂生物合成相关的冗余基因主要有酮酰辅酶a硫代酶(KAT)、丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)、塑质长链酰基辅酶a合成酶(LACS)、硬脂酰辅酶a去饱和酶(SAD)、乙酰辅酶a羧化酶(ACC)、酮酰辅酶a还原酶(KAR)、油体油酸苷(OBO)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)等496个uniESTs候选基因同源拟南芥有关的基因（拟南芥脂质基因数据库http://www.plantbiology.msu.edu.）[20.]（附加文件2）.其中71个uniESTs被定位到芝麻基因组序列(附加文件3.只有PDHC、OBO和LACS等12个基因与公开的芝麻ESTs数据库中的同源基因(附加文件)2）.

在“质体途径中的脂肪酸合成”[20.]，除了重要的酶丙二酰基-COA（MCMT）之外，在我们的数据集中发现了大多数关键酶，例如PDHC，ACC，血浆酰基载体蛋白（ACP）和KAR除外。在对整个芝麻组合组件爆炸后，我们发现大多数这些基因具有比那些更低的拷贝数拟南芥，除了编码β-酮酰基-ACP合酶I（KAS I）的一种基因，而具有2份的β-酮酰基-ACP合酶I（KAS I），而基因组拟南芥有1份副本(见附加文件2和额外的文件3.）.KAS I催化碳链从C4到C16脂肪酸合成的延长，在叶绿体分裂和胚胎发育中发挥了关键作用[21.]．芝麻油的主要成分油酸和亚油酸不断增加，达到成熟种子总脂肪酸的80%左右(图)1）.这些脂肪酸伸长和相关uniESTs稀释在芝麻首次报道在这项研究中,如公认的长篇uniESTs编码ketoacyl-ACP合酶II (ka II)悲伤和内质网(ER)油酸desaturase (FAD2),在转换的过程中发挥了重要作用的16:0-18:0和稀释。

在ER中发生三酰基甘油（标签）生物合成，并且可能涉及油体中的反应[20.]．仅检测到DGAT1、磷脂酰胆碱:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、OBO和caleosin四个主要基因，它们参与了油脂合成和储存途径中TAG合成反应的最后一步和油体的形成。DGAT1和PDAT被认为是影响油体形成和含油量的非常重要的基因[22.]．据信obo和亚莱多辛可以促进动员标签储备[23.那24.]．

在361个(3.9%)注释的具有转录因子活性的uniest中，有8个被鉴定与石油积累有关，并且它们与石油积累有关答:芥分别转录因子（TF）叶状葡萄糖1（ATLEC1），泡菜（ATPK1）和皱纹1（ATWRI1），表明它们在脂肪酸生物合成途径的转录调节方面的守恒和重要性。这些TFS，推定的芝麻LEC1（Silec1）和Siwri1，如那些拟南芥，在爆破整个芝麻组合组件后，单份副本（附加文件3.芝麻和拟南芥的基因序列相似性分别为47%和43%(附加文件4.）.AtLEC1正调控AtWRI1及大量脂肪酸合成基因和若干糖酵解基因[25.]．拟南芥中ATWRI1的过度表达增加了转基因植物中的标签含量[26.atlec1的过度表达及其在油菜中的矫形器（显著）转基因植物中的脂肪酸水平增加[27.]．在芝麻中鉴定的这些同源物可能在油脂合成中具有类似的功能。

参与芝麻种子中Lignan生物合成的EST分析

两种主要的油溶性木质素，芝麻素和芝麻苷[28.测定了2个品种(中植14号和苗前)种子的含油量。总木脂素(芝麻素和芝麻素)含量在授粉后15天检测到，并不断积累，直到种子成熟(图)4.）.有趣的是，从授粉后15天到种子成熟，芝麻素含量持续增加，芝麻素含量在授粉后20天达到最高水平，授粉后30天芝麻素含量几乎是芝麻素含量的两倍(图)4.）.在这两种品种中，显然伐木人的形成是发育调节的[29.那30.——木脂素积累与种子发育(成熟)同步。随着种子发育，转化为芝麻素的比例降低，而芝麻素的积累增加(图)4.）.

抗氧化剂木脂素，芝麻素和芝麻素，是通过苯基丙素生物合成途径生物合成的[29.那30.]．在途径中，首先将酪氨酸或苯丙氨酸转化为Coniferyl醇，然后经历立体选择性偶联，得到Pinoreinol，并且在将种子中成熟的种子，以哌啶醇，SESAMIN和SESAMOLIN来代谢，其被催化剂，SESAMIN和SESAMOLIN在催化剂中代谢。₂/ NADPH细胞色素P450S在形成亚甲基氧桥的反应10,11和14中（图5.）[29.那30.]．

一百和17个EST，对应于7个EC编号（EC1.1.1.195，EC 1.14.13.-，EC 1.14.13.11，EC 1.2.1.44，EC 1.6.2.4，EC 2.1.1.68，EC 6.2.1.12）（数字5.），在根据KEGG BLAST结果的情况下，可能涉及芝麻木质素的生物合成。与这一点相比拟南芥数据库，94个EST对32种基因同源拟南芥．在Genbank数据库中，只有12个芝麻ESTS与我们数据集的4个大学，编码三种酶基因（咖啡因O-甲基转移酶，COMT;肉桂醇脱氢酶，CAD;两个P450家族成员）。对应于芝麻木质的生物合成途径中的酶反应的大多数候选者，例如反式肉桂酸酯4-单氧基酶（Ca4H），氧化还原酶，COMT，4-香豆素 - COA连接酶（4CL），肉桂酰基 - COA还原酶（CCR）首先从芝麻中识别CAD等（附加文件5.）.4CL基因具有最丰富的ESTs(45个公认的单ESTs)。芝麻基因组中有5个编码COMT的基因副本(附加文件)6.这些基因的DNA序列)，但这种基因在人类的基因组中是不存在的拟南芥和大豆。令人惊讶的是，在芝麻ESTs中既没有检测到苯丙氨酸解氨酶，也没有检测到酪氨酸解氨酶。我们鉴定了35个nadph -细胞色素P450氧化还原酶的ESTs，这些ESTs参与芝麻木素生产的重要步骤，包括一个编码CYP81Q1的基因，它可以在松脂醇上形成双甲基二氧桥来生产芝麻素通过哌啶醇[31.]．因为关于从芝麻素到芝麻素素和从胡椒醇到芝麻素醇反应的酶的信息很少[32.，这些酶的ESTs无法被识别。

EST-衍生的简单序列重复（SSR）标记

简单序列重复（SSR）已成为人口遗传分析和标记辅助育种的主要标志物之一[33.那34.]．芝麻分子标记特别是EST-SSRs (EST-SSRs)的缺乏限制了芝麻分子育种的效率[35.]．因此，开发大量EST-SSR文库将是非常重要的资源来源。从32421条uniESTs中共鉴定出1688条uniESTs，其中包含1949条非冗余SSRs。uniest约为17.428 Mb的基因序列。226条序列中含有1个以上SSR。est衍生的NR SSRs由单、二、三、四、五核苷酸重复基序表示。在5.2%的NR EST序列中，SSR的总体密度约为每8.9 kb 1个，或包含SSR的序列1个。大约8.3%的SSRs是复合SSRs，定义为两个相邻重复序列之间的距离小于10个核苷酸。从32,421个uniest中鉴定出的SSR基序的频率见表5.．基于SSR主题的分布，AG / CT基序代表最丰富的二核苷酸重复基序（约68％）。最常见的三核苷酸重复基序是AAG / CTT（21％）和最丰富的四核苷酸重复基序是AAGT / ATTC（13％）（图6.）.

该研究提供了一系列富含显影种子的全长编码序列的EST。这些EST的数量超过Genbank中芝麻总数的12.4倍。从这套EST中，鉴定了来自显影种子的9,347个推定的功能基因，占基因组中总基因的三分之一。大多数成绩单是来自芝麻种子的第一个代表。在我们的数据中发现了涉及脂肪酸代谢的大多数关键酶和调节因素，尤其是负责主要不饱和脂肪酸合成的酶，标签合成反应和油体形成。还确定了一些保守的TFS显着调节油合成。这些为不同油籽油生物合成的未来比较分析提供了基础。鉴定了与芝麻木质素，芝麻素和芝麻酰胺的生物合成酶相关的大学，这些信息将有助于进一步研究芝麻木质人的生产。这个大量的EST，其中一半具有全长，已用于我们芝麻组胺测序项目中的芝麻基因组注释，并将是功能基因分析和分子标记的特性的有用资源，如油，脂肪的含量，脂肪芝麻酸和木兰和不同油籽种油生物合成的比较基因组学研究。

植物材料

芝麻品种的种子(美国indicum）中志14和Miaoqian来自石油作物研究所，中国农业科学院在学院农场的两个邻近地块中播下。花在花开放日的清晨标记。在5-50天或30天内收获显影胶囊，在早期成熟的Miaoqian授粉后立即分离出种子并在液氮中冷冻RNA提取或干燥以进行种子化学方法。将冷冻的种子储存在-70℃直至使用。

芝麻脂肪酸含量测定方法

从胶囊中分离出新鲜芝麻种子，将其干燥并研磨后进行溶剂萃取(索氏法)。油脂脂肪酸组成按国家标准方法GB14489.3-1993-T、GBT 17376-2008、GBT17377-2008(中国官方方法和推荐规范)采用气相色谱法测定。在每个样品中加入十七烷酸(17:0)作为内标。油脂含量由总脂肪酸含量计算。

木脂素的高效液相色谱分析

采用高效液相色谱法测定木脂素，方法参照中国NY/T 1595-2008国家标准方法。以芝麻酚为内标计算木脂素的回收率。

RNA提取

从芝麻种子中分离到总RNA。中植14)分别在授粉后5、20、30天，并按相同比例与TRIzol试剂(Gibco-BRL)按厂家说明混合。PolyA + RNA的分离使用PolyA Tract isolation System (Promega, USA)，按照厂家说明书进行。

生成ests.

报道了富集在全长序列中的标准化cDNA文库的构建[13.]．未复杂的cDNA文库的滴度约为1.0×10^6.cfu /毫升。重组体百分率为100%。凝胶电泳结果显示片段长度为700 ~ 2000 bp，平均长度为1800 bp。人工培养cDNA克隆，制备质粒DNA。使用T3通用引物和大染料终结者(Applied Biosystems，美国)或ET终结者(Amersham Pharmacia Bioscience，美国)的Sanger法进行自动循环测序。

聚类分析与注释

通过使用PHRED程序进行原始DNA序列的质量控制[14.]http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html.以删除不符合标准的读、向量和适配器序列，然后是EST-trimmerhttp://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trimmer.pl消除3'Polya和100 BP EST读数。Phrap程序用于将重叠的EST集聚到Contigs中。包含一个序列的群体被归类为单身人士。编辑的est被翻译成六个阅读框架，并与国家生物技术信息中心（NCBI）中心的非冗余蛋白质数据库相比拟南芥蒂利亚纳数据库在拟南芥信息资源(TAIR)http://www.arabidopsis.org/使用BLASTX程序具有默认设置（NCBI，ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast.）.BLASTN程序用于将我们的核苷酸序列与GENBANK中EST数据库中的序列进行比较。BLASTX和BLASTN导致E值截止1E-10^－５被视为“重要匹配”，而没有匹配或e值超过10^－５对Genbank的蛋白质被归类为“没有显着比赛”。

GO条款的分配

基因本体（GO）术语通过使用BLAST2GO将术语分配给大学[17.并根据其分子功能、生物过程和细胞成分进行了综述。该软件对GenBank非冗余蛋白(Nr)数据库进行BLASTX相似性搜索，检索BLAST结果前12位的GO项，并根据定义的标准对序列进行注释。基于默认的Evidence Code Weights的权重也用于确定GO术语注释。为了增加GO术语标注的序列数量，使用InterProScan工具将序列与InterPro数据库进行比较，获得额外的信息和GO术语[18.]．通过将临时独特基因（TuGS）映射到基因本体联盟结构来进行更详细的功能注释，其提供了结构化和受控词汇，以根据三种本体描述基因产物：细胞组分，生物过程和分子功能。计算每个GO术语中的拖船的分布和百分比。使用Wego比较GO术语和可视化http://wego.genomics.org.cn.[19.]．100的百分比被定义为分配GO条款的拖船总数。然而，子类别的百分比没有增加100％，因为许多基因涉及不同类别的功能，因此由多个GO条款注释。

中国国家基础研究计划（2011CB109300），育种生物育种主要项目（2009ZX08004-002B），中国农业部农业部重点实验室开放式项目（2009ZX08004-002B）的经济型技术支持200703年），以及非营利性政府研究机构的核心研究预算。CDNA文库测序由BGI-北京进行。

作者笔记

从属关系

1. 中国农业部石油作物生物学重点实验室。中国农业科学院石油作物研究所，武汉武汉市徐东第二路2号

   柯涛，董彩华，毛晗，赵英忠，陈红，刘红艳，董旭燕，佟朝波，刘胜义

2. 南阳师范大学生命科学与技术系，南阳武龙路，473061

   陶克

相应的作者

对应于刘胜毅刘．

作者的贡献

SYL对这项研究的构思、设计和协调作出了贡献。HM和CHD参与了芝麻ESTs的生成。TK对数据进行分析并起草手稿，SYL对手稿进行修改。HC和XYD对芝麻脂肪酸进行了测定。YZZ和HYL制备芝麻品种材料。CBT对芝麻基因组序列进行组装，并参与序列分析。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

柯涛、董彩华、韩茂等对这部作品贡献良多。

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