没有纤毛的植物中睫状蛋白的保护

背景

真核生物纤毛是一种复杂、高度保守的微管细胞器，具有广泛的系统发育分布。纤毛存在于真核生物的最后一个共同祖先中，许多与纤毛功能有关的蛋白质通过真核生物的多样性得以保留。然而，纤毛在不同的世系中也有多次丢失，至少有两次丢失发生在陆生植物中。然而所有的非种子植物都产生纤毛以促进雄性配子的运动，一些裸子植物和所有的被子植物都没有纤毛。在这些进化过程中，具有祖先纤毛功能的蛋白质可能会丧失或被吸收成不同的功能。

结果

在这里，我们鉴定了一组核心蛋白与推断的纤毛功能，在纤毛真核生物物种中被保守。我们研究了这一基因组数据集，以确定在非纤毛陆生植物中具有预测祖先纤毛作用的蛋白质。为了支持我们的预测，我们证明了这些蛋白质中的一些在原生动物锥虫中具有鞭毛定位。这些基因在陆生植物中的系统发育分布表明了亚功能化或新功能化的进化情景，表达数据分析表明这些基因在陆生植物中高度表达拟南芥花粉细胞。

结论

大量蛋白质具有指示睫状体功能的系统发育睫状曲线。值得注意的是，许多具有祖先睫状体作用的基因在非纤维的土地上维持。这些蛋白质已经共同选择进行新功能，最有可能在纤毛丧失之前，其中一些与雄性配子的形成有关。

Centrioles和Cilia /鞭毛是涉及细胞运动和信号的基于微管的细胞器（用于审查参见[1])。这些古代细胞器的超微结构形态在现存的真核生物中显着保守，其系统发育分布模式表明，最后一次真核共同的祖先（LECA）具有制作厘米加上纤毛的能力，具有感官和运动功能[2- - - - - -4］．尽管这种普遍的系统发育分布，谱系特异性的修饰已经显示出现和独立的纤毛脱落的许多事例已经报道5- - - - - -9］．

近年来，在不同物种中进行的多项高通量蛋白质组学研究和生物信息学分析已经确定了一组与中心粒和纤毛功能相关的蛋白质[2，3.，10.- - - - - -16.］．这些蛋白包括具有纤毛特异性作用的蛋白(如纤毛内运输蛋白、外动力蛋白和内动力蛋白以及径向辐条蛋白)，以及也参与其他细胞功能的微管蛋白(详细数据库见Cildb [17.])。然而，到目前为止，当纤毛发生进化转变时，涉及纤毛功能的基因会发生什么，我们知之甚少。

陆地植物谱系是研究纤毛丧失过渡的一个很好的模型，原因有几个。首先，这个古老的单系类群是有纤毛的，但在类群中至少发生过两次独立的损失事件，一次发生在裸子植物中，一次发生在被子植物的基部[18.- - - - - -20.］．第二，存在对纤毛损失过程中的蛋白组成的变化进行了深入的分析足够的基因组信息。第三，陆生植物有一个妹妹血统的绿藻，一组，其中包括充分研究的纤毛模式物种Chlamydomonas Reinhardtii.．因此，叶绿素为纤毛功能基因的鉴定和分析提供了一个很好的外群。

在纤毛基础陆生植物，纤毛只生产在专门的精子细胞[4］．这些细胞发生纤毛发生新创，而不是在动物谱系中看到的典型模板途径[21］．因此，可以假设，在植物生命周期的这一受限阶段，有调节机制确保纤毛功能所需基因的正确时空表达。在失去产生纤毛的能力后，尚不清楚这些调节机制是否也会失去。

在这里，我们描述了一种方法，该方法使用系统发育分析来鉴定核心功能蛋白的核心函数蛋白。通过将评分系统应用于45种真核物种内的直言蛋白，我们旨在鉴定具有祖先睫状体功能的蛋白质，这些蛋白质保持在非纤毛植物。然后我们在鞭打的原生动物中测试了这种祖先睫状体功能锥虫瘤布鲁斯群，并通过基因表达数据和系统发育推理的分析调查潜在植物的作用。我们的结论是，至少在一些非种子植物的纤毛形成特定的基因的保留雄配子体发育的种子植物的作用。

用系统发育分布鉴定睫状蛋白

为了更深入地了解跨越真核生物中涉及睫状体功能的关键蛋白质的蛋白质，我们分析了在45种的基因组中编码的正交蛋白的分布（附加档案1)．选择该种代表跨越六大群体广泛流传的进化真核生物的（即：原始色素体生物，Excavata，囊泡藻界，Holozoa，真菌和变形虫）。对于每一个物种，一个完整的或近乎完整的基因组序列是公开可用的。分析品种包括生物产生纤毛/鞭毛在其生命周期中的一些时间点（即我们这里为“纤毛类”）和那些不这样做（这里称为“无纤毛物种”）。它们在系统发育上保守的纤毛，但不是在非纤毛物种的蛋白质，被认为是具有一个“纤毛轮廓”和被预测执行纤毛功能。

要识别与睫状肌轮廓的蛋白质，我们使用的预测蛋白质组进行了倒数最佳BLAST（RBB）分析Chlamydomonas Reinhardtii.鉴定其他44种真核生物基因组中假定的同源基因。绿色的海藻Chlamydomonas Reinhardtii.被选为查询基因组由于姐姐谱系到其系统发生位置（在基准）的陆生植物。对陆生植物的比较短的进化距离，相比于真核系统发育的传播时，减少了序列差异将防止同源基因的准确鉴定的机会。此外，衣藻是一种被广泛研究的纤毛模型种。

预测的蛋白质组衣藻有15,143个蛋白质。其中，6,982个蛋白质具有多于一个推定的正轨。为了减少数据集中的误报的噪声，仅保留了分析中至少5种具有可识别命中的蛋白质。这种截止导致最终定义的4,802蛋白的数据集（31.7％的蛋白质衣藻预测蛋白质组)(补充文件2)．在这个数据集中，772个蛋白(16.1%)在分析中使用的每个主要真核生物组中都有假定的同源性。对于这772种蛋白质的系统发育分布，最简单的解释是，这些蛋白质存在于最后的真核共同祖先(LECA)中，随后通过进化分歧在某些谱系中消失。

我们发现，在纤毛和非纤毛物种中，简单的存在或不存在的蛋白质系统发育分布分析过于严格，因为假阴性而无法识别具有纤毛功能的蛋白质。因此，我们在数据集中考虑了假阳性和阴性的情况，在有纤毛的物种中应用了阳性评分，在非纤毛物种中应用了阴性评分(见方法)。通过使用这个评分系统，我们发现在数据集中的4802个蛋白质中，有213个(4.4%，附加文件3.）蛋白质具有一个得分表示睫状轮廓（在图示例1)．在这213个蛋白中，有157个(73.7%)在蛋白质组学分析中被检测到，这表明该方法鉴定纤毛蛋白是准确的。这相当于在纤毛蛋白质组学分析中发现的所有蛋白质(472)的33.3%。其余56个具有纤毛轮廓的蛋白质目前没有已知的功能。我们假设这些代表了一组新颖的蛋白，具有一种尚不明确的纤毛功能。

睫状轮廓蛋白定位于锥虫的鞭毛

大多数睫状肌轮廓的蛋白质已经在一个或纤毛的多个蛋白质组学研究[被检测10.，12.，14.，22］．为了测试之前在蛋白质组学研究中未发现的56种蛋白质是否可能在纤毛功能中发挥作用，我们研究了单细胞挖掘中其中一种蛋白质的细胞定位布氏锥虫。布氏锥虫是纤毛研究的一个显着的模型生物体，具有许多转基因的实例对本地化研究。具有已知功能的许多睫状型蛋白质已经局限性布氏锥虫(检讨请参阅[23])。

我们选择了一个候选蛋白FBB17作为内源位点，该蛋白可能与锥虫同源基因Tb10.406.0130编码的TbFBB17同源TY-YFP- 涂上布氏锥虫．TbFBB17是一种假定的锌羧肽酶，迄今为止在任何纤毛蛋白质组学研究中都未检测到[10.，12.，14.，17.，22］．标记策略保证了YFP-TbFBB17嵌合体被内源性基因启动子转录。此前已有研究表明，这种策略可以产生与野生型基因座相似的蛋白质水平[24］．的正确结合YFP通过PCR(数据未显示)和针对短表位TY-tag的单克隆抗体对细胞裂解液进行免疫印迹检测[25)(图1)．

为了确定TBFBB17的细胞内定位，通过荧光显微镜检查转化的细胞。数字1表明TBFBB17沿着鞭毛（白色箭头）的长度。该观察支持预测所识别的纤毛型蛋白质确实在睫状体功能中发挥作用。为了确定TBFBB17是否与细胞骨架稳定相关，我们评估了被清洁剂提取的细胞中标记蛋白的定位以除去非细胞骨架组分。在这种单元格中，删除了TBFBB17鞭毛信号（数据未示出）。这解释了蛋白质组纤毛蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶缺乏鉴定TBFBB17，因为蛋白质素来自细胞骨架细胞级分[5］．类似的解释可能适用于本研究中鉴定的其他55种蛋白质，但在纤毛蛋白组学筛选中未发现。

在无纤毛陆生植物和真菌纤毛蛋白的鉴定

在陆地植物中，纤毛至少消失两次，一次在裸子植物中，一次在被子植物的基部[18.- - - - - -20.］．这样的进化转变提出了一个问题:当产生纤毛的能力丧失时，祖先纤毛蛋白会发生什么变化?为了研究这一现象，我们定义了一个评分系统，用于识别在纤毛物种和陆生植物中都保守的、但在其他非纤毛物种中不保守的蛋白(CCP, forconserved在c和P.移植,见方法)。该分析从4802个蛋白数据集(0.44%)中鉴定出21个CCP蛋白，这些蛋白被保留在不具备产生纤毛能力的陆生植物中(图)2，附加文件4)．在与我们的预测一致，这些蛋白质（BUG22）的一个先前已在睫状蛋白质组学研究[检测12.，26］．其余的蛋白质没有特征性的纤毛功能。在非纤毛真菌谱系中(存在于纤毛物种和非纤毛真菌中)进行了类似的分析，确定了两种蛋白质(数据集中4802个蛋白质中的0.04%)。这两种蛋白在CCP中均不存在，也没有在任何蛋白质组学研究中检测到。在真菌分析中发现的较低数量的蛋白质可能反映了该谱系中基因组流线型的高水平[27］．

CCP蛋白定位于锥虫鞭毛

为了验证CCP蛋白具有祖传纤毛功能的假设，研究人员对这一亚群中的三个蛋白进行了定位布氏锥虫细胞。这三种蛋白，命名为TbCCP1（katanin的推定的p60亚单位），TbBUG22（BUG22的锥虫直向同源物），和TbCCP2（假想功能的蛋白质）由基因分别Tb11.02.1370，Tb10.70.5560和Tb927.8.5380，被编码．没有以往任何纤毛蛋白质组学研究中检测到CCP1和CCP2的同源基因，而BUG22已的蛋白质组学分析已确定衣藻纤毛(12.］．使用内源基因座N-末端研究每种蛋白质的定位TY-YFP标记为TBFBB17。通过PCR（未示出）检查标签的正确插入，并通过针对TY标签的单克隆抗体的细胞裂解物免疫印迹（图2)．

转化细胞的荧光显微镜表明，所有三种蛋白质都具有与睫状函数中作用一致的定位模式。tbccp1和tbbug22都定位到鞭毛布氏锥虫整个细胞周期（图2,白色箭头)。有趣的是，研究发现TbCCP2在细胞周期调控下定位于与鞭毛基底体一致的位置(图)2,白色箭头)。锥虫经历形态变化，可用于在细胞周期内定位细胞(见图中的卡通)2)．早期在细胞周期，亲基体的成熟以形成第二基体从其中一个新的鞭毛将延伸。此后不久，动基体划分（包含所有线粒体DNA的细胞器），耦合到所述两个基体从后基体的分离和扩展名的新鞭毛。一旦新的鞭毛完全伸展，核分裂产生最后胞质分裂。在这个位置信息的光TbCCP2荧光的检查表明，TbCCP2不仅仅是前动基分工，亦无以前期间发生核分裂检测到，但它是存在于或接近整个细胞周期的其余部分基体（图2)．总之，这些数据表明，所识别的CCP蛋白确实在可以产生鞭毛的物种中进行睫状体功能。

CCP蛋白的进化史

为了研究CCP蛋白在非纤维的土地植物中的可能功能，我们进行了鉴定的蛋白质套的系统发育分析。了解CCP蛋白的进化关系提供了洞察新的新功能机制的洞察力。蛋白核经系统蛋白质的蛋白核发育蛋白蛋白蛋白蛋白质发育推理（图3.）建议在土地植物的基础上复制基因，因为Physcomitrella金属盘基础土地植物具有生产纤毛的能力，具有四个基因的副本，可在2个植物中分解。然后，可以使用一个拷贝保持祖先睫状体作用的子功能，另一个副心复虑的副心化以及其他共同选择用于替代角色。随后，祖先副本丢失在非剥削的土地植物中（由此代表）拟南芥，水稻和Populus Trichocarpa.)．相比之下，其他中共直系同源物的贝叶斯系统发育与在进化过渡的能力丧失，产生纤毛祖先纤毛蛋白的neofunctionalisation /增选的假设是一致的，因为基因解析成一个单一的陆生植物进化枝（图3.)．

CCP蛋白在雄性花器官和成熟花粉中高度表达

虽然CCP蛋白在纤毛物种中具有纤毛作用，但在非纤毛陆生植物中它们的功能仍然是一个问题。为此，我们分析了从公共数据库中挖掘的非纤毛开花植物的微阵列数据拟南芥［28］．各基因在不同发育阶段的表达模式如图所示3.，（其他文件中的表达数据5)．对CCP表达数据进行倍数聚类分析表明，该基因在成熟花粉中高度表达，平均倍数增加2.8倍。相比之下，一些控制基因的表达模式表现出更普遍的表达模式。我们采用蒙特卡罗估计分析，计算了21个基因的22,640个随机组的花粉表达数据的总和fold change拟南芥基因组，以确定在表达增加倍数是如何可能这样。这表明，中国共产党蛋白质的花粉表达水平是非常高的显著（P.= 0.0006）。

超过300种蛋白质先前已经与睫状体功能相关联（例如，参见[17.])，大多数是通过分离纤毛的蛋白质组分析鉴定的(例如[10.，12.，14.，15.])。然而，这些研究未能检测到其不能稳定地与所使用的蛋白质制剂相关的蛋白质。在这里，我们已经确定了新的一套56个的蛋白质具有一个纤毛的个人资料，通过进化分布分析和实验验证中布氏锥虫(图1)．此外，我们还鉴定了21个在非纤毛陆生植物中具有祖传纤毛作用的蛋白(见图)2，3.)．

开花植物虽然失去了产生纤毛的能力，但仍保留了CCP蛋白

陆生植物中纤毛的系统发育分布表明，纤毛的丧失至少发生过两次:一次发生在裸子植物中，一次发生在针叶树和麻类植物中银杏和苏铁的分化处，一次发生在开花植物的基部[18.，19.］．所有其他陆生植物产生只能在专门的精子细胞纤毛（[29- - - - - -32]，在审查[20.])。在纤毛丧失的进化过程中，许多纤毛功能蛋白也丧失了(附文件)3.)．然而，我们已经确定了21个蛋白质具有可识别直向是conserved在ciliated种类和土地P.lants（CCP蛋白）。至少这些蛋白质的一个子集在鞭毛拥有纤毛功能锥虫瘤布鲁斯群，但在非纤毛陆生植物中，同源物的功能可能已经发生了分歧。有趣的是，对真菌谱系中纤毛进化丢失过程中保存的蛋白质进行的类似分析只发现了两种蛋白质，这两种蛋白质都不存在于CCP集合中。如此低的数字(21和2)表明，虽然蛋白质的损失在进化转变中是普遍存在的，但一个蛋白质在没有显著序列差异的情况下被选择到不同的功能是相对罕见的。

所有三种测试的CCP蛋白质的鞭毛定位在锥虫中（图2)支持他们假设的祖先纤毛作用，并验证了我们用于CCP识别的评分系统。虽然关于21种CCP蛋白在非纤毛植物中的假定作用的数据有限，但值得注意的是，在可获得的信息中，它们通常与细胞骨架/微管的作用有关。例如，CCP1是一种假定的katanin，已知的AAA+微管切割蛋白[33]当突变CCP基因时tonneau2 / fass1显着影响细胞形状和布置拟南芥，由于细胞骨骼异常[34］．另一种CCP蛋白，融合蛋白，已经被证明参与了hedgehog信号通路果蝇，许多物种的hedgehog受体定位于纤毛[35］．总之，这些观察表明，CCP蛋白发挥着与纤毛相关的调节作用，但现在在非纤毛植物中维持着细胞骨架功能。检查Pfam结构域的CCP蛋白[36其中包括泛素酶、含有AAA+结构域的蛋白、蛋白激酶、管状-tryosine连接酶和磷脂酸磷酸酶，支持祖先纤毛功能蛋白在陆地植物中发挥细胞骨架作用的说法。Picket-Heaps [37]提出纤毛自体来源从祖先参与细胞质和有丝分裂的微管的调节微管组织中心[4］．如果是这样的话，同样有可能的是，纤毛的丧失导致了细胞骨架功能向相反方向的选择。

也可以从观察结果推断CCP蛋白功能，即CCP基因在成熟花粉中高度表达[28] （数字3.，附加文件5)．考虑到这些蛋白质在基部陆生植物精子细胞纤毛形成中的祖先作用，以及花粉中的精子细胞没有纤毛的事实，这种表达模式是令人好奇的。可以想象，在基生陆生植物中，参与纤毛细胞特异性形成的基因可能在纤毛丧失之前在配子中获得了额外的(新的)功能，并因此在纤毛丧失后的花粉中得以保留，在非纤毛环境中执行类似的细胞特异性(可能是细胞骨架)作用。这种专一性可以解释为什么在种子植物纤毛丧失的进化过程中，纤毛功能基因只保留或增选了少量的基因，而绝大多数的纤毛丧失或分化。

本文的工作表明，在非纤毛陆生植物中存在一组祖先纤毛蛋白，并提示纤毛的丧失过程可能伴随着纤毛功能蛋白的选择进入新的环境。

蛋白质组的生物信息学定义

每一个预测蛋白的编码衣藻基因组作为一个最佳反向BLAST (RBB-见下文)搜索的查询，e值阈值< 10^－5针对45种真核生物的每一种预测的蛋白质组。在RBB期间，使用针对目标基因组的查询序列执行BLAST搜索。如果来自目标基因组的最高命中确定了反向BLAST中的查询序列，则确定的序列为RBB命中。分析中使用的物种具有广泛的系统发育分布，包括29个在其生命周期的某个点产生中心粒/纤毛/鞭毛的生物(称为“纤毛”)和16个不产生中心粒/纤毛/鞭毛的生物(称为“非纤毛”)。重要的是，这些物种中的每一个都拥有一个完整或接近完整的基因组序列。如果RBB的top hit是初始查询序列衣藻，将所识别的靶序列推断为正序，因此包括在数据集中。丢弃非往复序列。睫状型蛋白质被确定为那些蛋白质，其在10种以上的45种物种内的矫形器的进化分布为公制β- 10α, (α.是拥有正轨和含有正轨和的非纤毛物种数量β为具有同源性的纤毛物种的数量)。CCP (conserved in ciliated species and plants)蛋白组是指与植物同源的蛋白β> 18.和μ< 2, (μ.为具有同源性的非纤毛种(不包括植物种)的数量。

系统发育推断

系统发育分析中，使用MAFFT6.24对各蛋白组序列进行比对[38采用L-INS-I策略，并通过眼睛修剪到良好的对齐块。使用程序MRBAYES3.1.2中实施的MATROPOLIC耦合的MARKOV链蒙特卡罗（MCMCMC）方法从蛋白质对准推断出贝叶斯语法，其中2个独立于随机开始树的独立运行，使用WAG替换矩阵具有伽马分布式变化以替代率近似为4个离散类别[39］．

Endogenous-locus标签

内源性基因座标记采用顺环型锥虫瘤布鲁斯群李斯特427个细胞[40］．如Brun和Schӧnenberger所述，细胞在添加了10% v/v胎牛血清(FCS)的SDM79中以无菌培养方式维持在28℃[41］．序列在内源性基因位点整合，采用[42］．简言之，对于PCR的基因组DNA，由菌株利斯特427分离布氏锥虫前循环细胞如在[43］．含有PCR扩增子〜从靶cDNA序列的5'末端（CDS）与添加到引物的5' 3' 末端线性化位点200bp的，和〜200从5' 间隔区的3'末端为与掺入5' 引物为这个片段相同的线性化位点的靶CDS，克隆一起放入的下游的XbaI-BamHI位点TY-YFP在pEnT6P向量，使得所述CDS的N末端是在帧与YFP．该载体然后在CDS和基因间区域的片段的5'末端之间的位点转染到procyclic形式利斯特427之前线性化布氏锥虫如前所述的细胞[44］．电穿孔后，细胞在正常生长培养基中恢复14 h，之后加入1 μg ml筛选稳定的转化菌群^－1嘌呤霉素。

荧光显微镜

为了分析固定整个细胞中的YFP标记的蛋白质，通过离心从中木蛋白培养物中收获了加糖蛋白酶体，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，并粘附在PBS中5分钟的乙醇洗涤的普通玻璃载玻片5分钟在〜2×10⁷细胞毫升^－1．然后细胞在2% w/v甲醛的PBS中固定5分钟，然后在-20°C甲醇中渗透10分钟，在PBS中再水化。样品用1% w/v 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷值，90%甘油，50 mM磷酸钠，pH 8.0，含0.25 μg ml^－14' ，6-二脒基-2-苯基吲哚。

免疫印迹分析

对于全细胞蛋白样品，收集细胞，在PBS缓冲液中洗涤，成球并立即在沸腾的Laemmli缓冲液中重悬(2%十二烷基硫酸钠(SDS)， 10%甘油，400 mM β-巯基乙醇，50 mM Tris-HCl pH 7.2)。sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳和浸液转移到硝基纤维素膜使用其他描述的标准技术[43］．免疫印迹法中，用5% (w/v)脱脂奶粉阻断膜，用抗ty BB2单克隆抗体标记TBS-T (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20) [25在TBS-T/1%脱脂奶粉中，并与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)发展。作为加载对照，用抗pfr2 (L8C4)单克隆抗体重新检测膜，并如上所示发展。

LECA：

最后的真核生物共同祖先

爆炸:

基本的局部对齐搜索工具

非本征基极电阻:

友情最佳BLAST

中国共产党:

在纤毛和植物中保存。

我们要感谢Nicole Scheumman（Dunn病理学学院，牛津大学），了解改造的专家指导布氏锥虫．我们感谢罗伯特苏格兰和吉姆Fouracre（系植物科学，牛津大学）进行有益的探讨。我们要感谢史蒂芬·凯利的建议和帮助信息学和计算资源。这项工作是由威康信托基金会和BBSRC（BB /天/ 1），KG和盖茨比慈善基金JAL的资助。MEH是由BBSRC研究生助学金的支持。

从属关系

1. 英国牛津大学植物科学系，牛津南公园路，OX1 3RB

   Matthew E Hodges和Jane A Langdale

2. 英国诺丁汉大学遗传学和基因组学中心，诺丁汉，NG7 2UH

   比尔Wickstead

3. 威廉·邓恩爵士病理学院，牛津大学，南公园路，牛津，OX1 3RE，英国

   Matthew E Hodges，Bill Wickstead＆Keith Gull

相应的作者

对应于简一个Langdale．

作者的贡献

MEH进行生物信息化分析和分子实验。Meh，BW，Jal和Kg设想了这项研究，并参与了其设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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