在植物营养和生殖发育过程中与转录后和转录调节功能相关的基因转录本中的SSR标记油棕

背景

油棕（油棕Jacq.）是一种多年生单子叶热带作物品种，目前是世界第一大食用植物油来源，也是维生素原a最丰富的膳食来源。虽然传统育种计划中的新精英基因型提供了稳定的产量增长，但选择周期较长（10-12年）分子育种计划有可能对遗传改良率产生重大影响，但有限的分子资源，特别是缺乏感兴趣的农艺性状的分子标记，限制了其应用油棕分子育种方案的研究进展。

结果

在本研究中，我们从发育中的营养和生殖组织cDNA文库中提取了6103条非冗余est，并对其进行了简单序列重复(SSRs)的注释和搜索。对289个EST-SSRs侧翼序列的引物对进行多态性检测。230个PCR扩增产物，其中88个在育种材料中具有多态性。通过对EST-SSRs的详细分析和注释，揭示了转录本内多态性的位置，主要功能类别与转录和转录后调控有关。在AP2-like、bZIP、zinc finger、MADS-box和NAC-like转录因子以及其他转录调控蛋白和一些RNA相互作用蛋白的序列中发现了SSR多态性。

结论

EST-SSRs的鉴定为分子育种策略的制定提供了工具。转录本中SSRs的识别，特别是那些编码参与转录和转录后调控的蛋白质的SSRs，将通过研究与这些标记共分离的表型特征，深入了解这些蛋白质的功能作用。最后，从油棕营养和生殖发育中提取的EST-SSRs将有助于研究油棕科植物功能多样性的进化。

油棕 （油棕（贾克），一种属于槟榔科的多年生单子叶热带作物品种，现在是世界上第一大食用植物油来源，也是维生素原a最丰富的饮食来源。尽管全球对棕榈油的需求每年都在增加，但传统育种计划中的新精英基因型使产量增加了每年只有1%，而漫长的选择周期（10-12年）使得遗传改良缓慢[1]．此外，在生物多样性高的热带森林地区，为了在不扩大油棕种植的情况下提高油棕的整体产量，迫切需要开发分子标记，用于分子辅助育种计划，以促进产量的遗传改良。并作为其他重要农艺性状的标记。

微卫星标记或简单序列重复序列(SSRs)是在真核生物基因组的编码区和非编码区发现的1-6 bp的串联DNA重复序列。非编码SSRs通常具有高度多态性、共显性和易于检测，因此易于用于基于pcr的高通量基因分型。它们还被开发用于许多作物品种，并用于各种重要的应用，如基因组制图、多样性研究和QTL分析[2]．由于其高度多态性，非编码SSRs在指纹或品种鉴定研究中特别有用，但在较远亲缘物种的研究中用途有限[3.]。虽然来自非编码基因组DNA的SSR不被转录，但在转录序列中识别的SSR可与功能相关，并更容易与感兴趣的表型特征相关联，使其可用于功能多样性研究[2，3.]．此外，在基因区域内的ESTs更易于转移，用于较远亲缘物种的多样性研究。此外，转录区域中SSRs的存在可能导致功能、转录或翻译的改变。事实上，导致氨基酸变化的编码区域中的SSRs可以导致功能的获得或丧失，而5'UTR中的SSRs可以影响转录或翻译，而3'UTR中的SSRs可以影响剪接[3.- - - - - -5]．

在油棕的情况下，以前的研究报告了在可用的EST数据中确定假定的SSRs [6- - - - - -8]然而，很少有EST-ssr被检测，也没有将其有效性与从基因组非编码部分鉴定的ssr进行比较[9，10]．事实上，油棕的遗传图谱主要基于匿名非编码SSRs、aflp或rapd [9，11- - - - - -14]．迄今发现的油棕EST-SSRs揭示多态性主要来自与已知序列缺乏相似性的基因或编码功能未知的蛋白质[7，8]．事实上，在这两篇最近发表的oil palm文章中，只有两篇报道的EST-SSRs与已知函数的序列相似。此外，用于产生这些SSR搜索的ESTs的rna主要来自狭窄的组织来源在体外材料(6- - - - - -8]．尽管为油棕开发的EST-SSR标记的数量相对较少，但已被用于种间转移性测试的少数标记表明，在比较基因组研究中有很大的前景[7，8]．因此,策略识别EST-SSRs不仅是重要的多样性研究为基础与油棕分子育种策略,但此外,标记保存编码区域允许简单的可转让性棕榈科家庭内的其他物种进化和功能多样性研究和提供工具(3.- - - - - -5]．

目前的研究目的是鉴定油棕est中的ssr，并评估其作为分子标记在遗传改良项目中的应用价值。我们特别关注了来自发育营养和生殖组织的est中SSRs的鉴定，并探讨了它们在测绘和分子育种中的应用潜力，以及槟榔科的功能多样性和基因组学分析。

油棕est提取SSRs的特征

从代表油棕生殖和营养发育不同阶段的组织(包括茎尖、胚性细胞、体细胞和合子胚胎、雄性和雌性花序)中构建了12个cDNA文库，分析了SSRs的存在(表)1） [15- - - - - -17]．另外，两个库，包括茎尖库(A1)和雄花序库(M2)，是由表现出被盖异常表型的油棕材料衍生而来的[15，16]．总数为7376个EST冗余，库间聚类分析产生的6103（83％）个Unigenes识别由4967个单身和1136点的重叠群（表2）.在全长2652262 bp的EST序列中，共发现465个SSR，占总数的8%，相当于每5.7 kb的EST序列中有1个SSR。这高于先前发现的油棕的频率分别为7.7 kb、8.2 kb及9.6 kb [5，7，8]．本研究共检测到25个化合物SSRs，其中24个为双份，1个为三份。先前报道的油棕中最丰富的是di(36%)，其次是tetra (29%)， tri (24%)， hexa(7%)和penta (5%)1a）.在之前的一项研究中，含有四元基序的EST-SSRs也很丰富[6]，而在其他研究中很少观察到[7，8]．这些研究之间差异的原因尚不清楚，但可能是由于在EST序列中搜索SSRs所选择的参数不同。几乎90%的二核苷酸SSRs具有ga/ag/tc/ct基序，这证实了先前在油棕中所显示的[6- - - - - -8)(图1b）.对含ssr的ESTs进行注释，共得到264个unigenes的538个GO注释，其中201个与公共数据库中已知序列无相似点(表2)2）.GO术语注释显示，具有SSRs的ESTs与多种假定的生物学过程、分子功能和细胞定位相关(图)2)EST的最大部分由代谢（分别为32%和21%）和细胞（分别为31%和20%）过程的GO生物过程注释和分子功能注释注释，主要定位于细胞内（19%）颗粒（17%）或细胞器（16%）。

从早期的研究中，共从378个单序列中鉴定出544个基因组SSRs，或243,943 bp [9，10]．est -SSR和SSR之间SSR核苷酸重复序列的分布不同(图)1c）.事实上，在est - ssr序列中发现了6个重复的峰值(搜索SSRs的最小重复数截断参数)，而基因组SSRs的分布峰值出现在17-18个重复。与基因组SSRs相比，编码部分中较高的低重复数可能反映了基因组编码部分比非编码部分更高的选择压力。

SSRs检测LM2T和DA10D杂交的多态性

在发现的465个EST-SSRs中，有316个在侧翼序列中鉴定并设计了可能的引物。LM2T和DA10D亲本目前被用于硬脑膜×pisifera为油棕而制订的互惠轮回选择计划中的杂交品种[18]，并作为基于SSR的油棕基因组遗传图谱的参考杂交[9]．因此，我们将本研究鉴定的289个EST-SSRs(包括所有带注释的est)的多态性与之前描述的非编码SSRs揭示的多态性进行了测试和比较[[9]，利用LM2T和DA10D定位亲本及其后代。从EST-SSRs中设计的230对(79%)引物(附加文件)1表S1)扩增一个PCR产物，其余为零等位基因[19]在这230个EST-SSR基因座中，88（24%）在双亲（LM2T和/或DA10D）中显示多态性，在两个杂合子亲本之间的这种杂交类型中，有9个预期的1到4个分离SSR等位基因（图1）3.)相比之下，从之前测试的391对基因组SSR引物中，在同一参考交叉上有278个（71%）位点多态，在两个已定位的亲本上有更多的4-9类位点杂合（43%比27%）。这一结果表明，在单基因中发现的相对较小比例（7.6%）的SSR中，后者很少，与基因组SSR相比少得多，实际上可以使用SSR标记在给定的基因组上作图，至少在本研究测试的遗传物质中是这样。因此，在EST资源中使用ssr可能不是开发大量基因内标记的最有效方法。然而，SSR仍然是一种重要的多态性标记，特别是对于缺乏基因组序列数据的物种，以及与潜在可用的一系列新多态性标记相结合[20.，21]．

的88 EST-SSR侧翼检测多态性的引物对，48个EST没有相似之处在可用的数据库34个具有序列相似性的序列，并且可以被分配之前描述的根据类别假定功能[22]，而有6个est序列与未知、未命名、假设或表达的蛋白序列相似(表3.）.对序列的详细注释显示，最具代表性的功能基团(40个中的13个，或32%)是转录和转录后调控，其次是5个与蛋白质目的地和存储序列相似的est，以及3个与信号转导相关的est。分别是细胞结构和疾病防御。GO注释证实，与核酸结合相关的est所占比例最高，其次是与蛋白结合相关的est(图)4）.其他多态性参与细胞生长和分裂，细胞结构，疾病和国防，能源，细胞内运输，蛋白质合成和传输序列被发现（表3.）.

考试成绩单中的SSRs的位置显示,大部分(18)在开放阅读框(ORF)的成绩单,而11中5’非翻译区(UTR),八个在3 ' UTR和3 5 ' UTR起始密码子之间的重叠和羊痘疮。因此,大多数SSRs识别影响基因产物的氨基酸序列,从而可能改变基因功能通过移码突变,而其余SSRs UTR区域中发现可能影响转录,翻译或剪接基因产物(5]．

考试EST-SSRs发现的分布的营养和生殖库用于目前的研究显示五EST-SSRs来自先端(A01和A11),三个女性的花序(F01), 14岁的男性花序(M01, M11公路和M21),从体细胞胚18 (E11 E21,S31和S41)文库，合子文库中未发现SSRs(见表)1和3.）.与营养或生殖阶段相关的EST-SSR标记可能有助于研究槟榔科植物组织的种间和种内功能多样性。

众所周知，转录调控，特别是通过转录因子的活动，在植物的生长发育和植物形态的进化中发挥着中心作用[23，24]．一项对水稻和拟南芥基因组SSRs的调查表明，最常见的GO类别是与细胞核、转录因子活性、核苷酸结合和DNA结合有关的那些[4]此外，一项针对人类的研究还发现，在涉及转录调控和发育的转录本中，可变重复序列丰富[25]．在本研究中，SSR多态性检测到6个转录本编码类似于RNA相互作用的蛋白(剪接体或RNA结合蛋白)，5个类似转录因子(TF)，包括AP2-like、bZIP、锌指、MADS-box和NAC-like转录因子，和两个转录调节蛋白，包括一个PHD手指家族蛋白和一个视网膜母细胞瘤结合蛋白。有趣的是，转录调控因子不仅是植物形态进化的核心，而且与作物物种的驯化有关[23，26]．特别是MADS-box基因是玉米驯化过程中常见的选择靶标[27]．在油棕优良育种材料中，编码转录调控蛋白的转录本中有大量的多态性，这提出了一个问题，即这可能与油棕互惠轮回选择方案所获得的改进有关。然而，必须考虑到相对较少的ESTs检测数量，并等待油棕基因组序列的可用性进行结论性分析。未来的目标包括检验这些SSRs在不同油棕遗传材料中的表型后果，以及在槟榔科作为一个整体来确定它们与所观察到的功能多样性的相关性。

SSRs记录编码的蛋白质参与转录调控和其他函数从当前的研究发现为应用程序提供相关标记映射等分子育种、QTL分析,除了潜在的使用功能多样性研究在油棕和其他棕榈物种之间。特别是，在转录控制相关的转录本中识别出SSRs，将有助于研究这些基因在油棕驯化过程中的功能作用。然而,应该注意的是,由于有限的比例多态SSRs出现在编码区域,是非常重要的开发全系列的其他潜在的多态标记为了结合结构和功能基因组学研究在大公司允许在油棕分子标记辅助选择。

植物材料生产

胚胎发生悬浮细胞的制备和RNA提取用于抑制消减杂交(SSH)文库的构建，从30天增殖周期和16天液体预处理后启动体细胞胚胎发生已进行，并在前面进行了描述[17]．另外，将部分经预处理后开始发生体细胞胚发生的胚性悬浮细胞置于含有或不含6-苄基胺嘌呤(合成细胞分裂素)的基础培养基的固体琼脂平板上进行进一步的体细胞胚发育，并于7 d后采集用于RNA提取和SSH文库构建。茎尖、雌花和雄花花序以及合子胚所收集的材料已在以前描述过[16]．正常和异常雄性花序SSH库的材料已在前面描述和执行[15]．分离出发育3-5.5个月的合子胚胎Tenera.从树上采集棕榈种子（德利X喇么原点）在CRAPP波贝站，贝宁栽培。

互补脱氧核糖核酸图书馆建设

非标准化库(A0, A1, F0, M0和Z0)已在前面构建[16]， SSH库的构造如前所述[17]．利用RNAeasy脂质(Qiagen)提取的合子胚RNA cDNA构建合子胚归一化SSH文库(见表)1）.驱动程序库和测试程序库的标准化使用相同的cDNA。

EST的生成、分析、注释和数据挖掘，识别SSR标记

est来源于SSH cDNA文库(表1使用标准高通量测序通过GATC Biotech公司AG，德国产生文库E1，E2，M1，M2，S3，S4和Z1）。DNA模板进行使用ABI3730仪（Perkin Elmer，福斯特城，CA，USA）的单程自动测序。然后将序列进行一个自动过程来验证清洗，存储和分析的序列如先前所述[16]．自动化分析允许通过同时聚类分析识别潜在的unigenes (contigs + singleton)。最后，将假定的功能分配给ESTs, BLASTXhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/将序列与GenBank非冗余蛋白序列数据库进行比较，如前所述[28]。EST是根据以前的目录系统手动分配到功能类别的[22]．此外，基因本体论(GO，http://geneontology.org/)-使用Blast2GO进行基于GO的注释，以分配GO分子功能、生物过程和细胞成分术语[29]．使用BLASTX靠着具有10的E值截留基于GO-植物UNIPROT数据库中的序列进行了分析^－10.使用在线SSR分析工具（SAT）；http://sat.cirad.fr/sat)，使用SSRIT程序的默认参数[30]．全部的油棕EST-SSR位点与它们的EST GenBank登记号，衍生的引物对，熔化温度和预测的PCR产物的大小被包括在其他文件1：表S1。的52℃和氯化镁的退火温度₂如前所述，0.6 mM的浓度用于进行PCR反应[9]．将E1、E2和Z1文库的ESTs提交到GenBank，分别为JK668500-JK669437、JK669438-JK669618和JK668122-JK668499。

美东时间：

表达序列标签

去：

基因本体论

ORF：

开放阅读框

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

SSH:

差减杂交

TF:

转录因子

UTR:

未翻译。

我们感谢法国移民协会、法国驻泰国大使馆、泰国教育部、泰国国家遗传工程和生物技术中心(BIOTEC)参与了法国/泰国双边PHC泰国2007-2008项目(代码16589YK)，允许进行这项研究。机构经费也由税务局和CIRAD提供。我们感谢Frederique aberlence - bertossi的合子和Thierry Beulé的体细胞胚胎，分别用于构建cDNA文库，CRAPP Pobé油棕榈研究站，贝宁的遗传物质和后勤支持，Stéphane Jouannic为构建抑减杂交cDNA文库提供技术支持。我们还要分别感谢Christine Tranchant和Virginie Pomiès提供的出色的生物信息学和技术援助。

隶属关系

1. IRD，UMR二单元组（IRD，UM2），911路Agropolis BP 64501，蒙彼利埃CEDEX 5，34394，法国

   Timothy John Tranbarger和W James Tregear

2. 国家基因工程和生物技术中心(BIOTEC)基因组研究所，113泰国科学园，phhonyothin路，Klong 1, Klong Luang，巴吞他尼，12120，泰国

   Wanwisa Kluabmongkol, Duangjai Sangsrakru & Somvong Tragoonrung

3. CIRAD, UMR DIADE，蒙彼利埃，F-34394，法国

   Fabienne Morcillo

4. CIRAD, UMR AGAP，蒙彼利埃，F-34398，法国

   诺伯特Billotte

通讯作者

对应于蒂莫西·约翰·特兰巴格．

作者的贡献

TJT和WK对ESTs进行了编辑和注释，并进行了SSR搜索。FM和WK设计并验证了EST-SSRs侧翼序列中的引物对。WK、DS和NB检测EST-SSR引物序列，检测精英材料的多态性。JWT和FM参与了cDNA和SSH文库的构建。TJT撰写了手稿，并与ST一起参与了研究的构思和协调。所有的作者阅读并批准了最终的手稿。

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