抗性基因表达的局部和系统性变化，nb-lrr基因及其推定的microRNA在挪威云母伤害和接种病原体后长喙壳属polonica

背景

Nb-LRR抗性蛋白涉及识别植物中的病原体和其他外源压力。抗性蛋白质是诱导防御反应的第一步，更好地了解他们的监管对于了解植物防御机制非常重要。植物中的大部分转录后调节由microRNA（miRNA）控制。我们研究了五个挪威云杉miRNA的表达，其可能在伤害和接种抗性挪威云杉中的次级验钞（树皮）中的NB-LRR相关转录物，并与虚度养殖的蓝色染色真菌接种长喙壳属polonica．

结果

该无性系的植株均能从病原接种和单独伤害中恢复。我们发现了抗性标记基因的局部和系统诱导PaChi4,教皇和PAPX3.表明了一种有效的宿主防御反应。健康植物和处理植物之间5个mirna和21个nb - lrr的表达有轻微的局部和系统性变化。只有5个推定的nb - lrr (PaLRR1, PaLRR3, PaLRR14, PaLRR15和PaLRR16)的显著增长超过两倍，作为当地的反应C. Polonica.．仅限nb - lrrPaLRR3，最高度差分的NB-LRR，也由于伤口而显着增加。五个miRNA在第1天显示初始局部和系统性下调的迹象，然后在第6天提高到周期级别。然而，最初的下调仅为miR3693和miR3705．

结论

总体而言，只有已建立的抗性标记基因和抗病基因的局部和系统表达变化明显PaLRR3．对于遵循的miRNA和它们预测的Nb-LRR靶标的次要表达变化表明，大多数Nb-LRR基因的表达保持靠近其强调和健康挪威云杉植物中的组成型水平。

单个植物识别病原体的能力取决于植物的抗性基因的补体[1那2]．植物免疫被认为依赖于两个主要的抗性水平[3.[其中参考]。通过诱导Pamp触发的免疫（PTI）的细胞表面定位的图案识别受体（PRRS）识别称为病原体相关分子模式（PAMP）的保守微生物分子（PAMP）来诱导第一级。PRR是具有细胞外LRR结构域的跨膜蛋白。PTI最古典的例子是拟南芥对识别细菌鞭毛蛋白的PAMP的LRR-kinase的抗性基因FLS2编码[4.]，可以被认为是一般或非主体型电阻。但是，宿主适应的病原体演变效果（AVRS）抵消了PTI [3.]．然后，宿主植物可以利用称为效应器的第二级抗性触发免疫（ETI），以识别和抵消来自适应病原体的效果。ETI是通过直接或间接感知病原体效应（AVR）蛋白的抗性蛋白质介导的。大多数ETI受体是抗性蛋白质，具有核苷酸结合位点和富含亮氨酸的重复（NB-LRR）结构域。在亚麻中，TIR-NB-LRRS抗抗抗性蛋白涉及识别来自基因对基因特异性的致病生锈触发ETI的效果3.那5.]．

在病原体识别中最常见的一类抗病蛋白是nb - lrr [1那6.那7.]．Nb-LRR基因编码约200个氨基酸的可变N-末端结构域，以及可变的C末端串联阵列的短LRR图案。依赖于将N-Terminus Nb-LRR中的基序分类为几个亚组，包括Toll /白细胞介素-1受体（TIR）组，卷曲线圈（CC）组和亮氨酸拉链（LZ）组。此外，LRR激酶家族含有与细胞质丝氨酸 - 苏氨酸激酶（Kin）结构域融合的额外细胞质LRR [1那5.那8.]．Nb-LRRS的LRR结构域直接或间接地与病原体AVR基因的效果的产品相互作用，因此认为主要是在病原识别中起作用[1那3.那5.那8.那9.]．在被子植物中，nb - lrr已被证明通过打开下游防御基因在植物抗性中发挥直接作用[1那4.那10]．受体寡聚可能是nb - lrr激活ETI耐药信号的重要步骤[3.]．然而，将NB-LRR激活与下游免疫反应联系起来的信号事件的清晰模型仍然难以捉摸，但可能与转录调控因子(如wrky)直接或间接的相互作用有关[10]．

近年来，在多年生被子植物葡萄和杨树中发生了广泛的r基因复制，并与一年生植物如水稻和杨树进行了比较拟南芥，提示nb - lrr编码基因扩增是一种补偿木本多年生植物世代时间延长的机制[11]．科勒和同事[12]在黑色棉纺上检测到超过400 NB-LRSPopulus Trichocarpa.基因组，这个数字至少是拟南芥．在裸子植物中也发现了nb - lrr，如松树，它们与抵抗白松树水泡锈等紧密相关柱锈菌属ribicola[13那14]．对针叶树nb - lrr的研究大多是在西部白松上进行的Pinus Monticola.，其中刘和ekramoddoullah发现了大量的TIR-NB-LRR以及CC-NB-LRR亚家族的61份转录物[13那14]．因此，Nb-lrrs似乎在长寿的植物中是多种的，例如树木。

坏死性蓝染菌长喙壳属polonica（暹粒）C. Moreau，是欧亚云杉甲克甲虫的毒力助理Ips typographusl . (15]．病原体C。polonica能够杀死宿主挪威云杉，被认为是树木死亡的原因，而不是树皮甲虫大规模爆发时传播它的甲虫。经过机械损伤处理的挪威云杉树比未经处理的树更能抵抗随后接种这种坏死性蓝色染色真菌的挑战[15]．类似地，在对以前真菌接种的反应中观察到获得性耐药性，导致在第二次大规模接种时损伤长度更小，损害更小C. Polonica.接种(16]．云杉与云杉之间的相互作用C. Polonica.很可能是非常古老的，因此这种病原体很可能是高度协同进化的，并且很好地适应了它的宿主。这增加了一种可能性，即存在一套高度精炼的NB-LRR型宿主受体和ETI相关反应。然而，在云杉中，nb - lrr在多大程度上参与了病原体识别和创伤相关反应尚不清楚。

对病原体的识别和其他应激诱导信号通路，这些信号通路再次引起下游基因的表达，如编码致病机理相关蛋白和酶的苯基丙酸通路。调控木质素代谢的基因对被子植物抵抗真菌病原体具有重要作用[17因为植物似乎利用细胞壁木质素化来对抗入侵的病原体。木质素相关过氧化物酶通常在被子植物和裸子植物在病原体入侵后上调，导致宿主组织木质素化和亚木质素化增加，以及活性氧的产生[18-20.]．木质素相关过氧化物酶PAPX3.具有一般的应力诱导的功能，并在挪威云杉树皮上上调，响应根腐菌感染异常的Parviporum和伤害20.]．苯丙氨酸ammonia-lyase (pap）在木质素和苯丙醇蛋白在裸子植物中的形成，例如云杉和肺癌植物（Angiosperm植物）存在关键作用[20.-22]．在挪威云杉，响应于病原体攻击和其他压力源，并且逐蛋白酶呈上调一系列防御相关蛋白质Pachi4.已被证明是挪威云杉和Sitka云杉的本地和系统防御反应特别有用的标记[23-25]．

病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)触发植物先天免疫的microrna (mirna)已被鉴定拟南芥[26]．miRNA是转录后调节剂，其与目标信使RNA转录物的互补序列结合，通常导致转化抑制和基因沉默。这些调节剂是短核糖酸分子，平均仅在松树和挪威云杉中长期核苷酸[27那28]．在荒野松树中松果体taedamirna与纺锤状锈病有关[27]．miRNA在云杉防御对抗病原体的重要性是未知的，但靶向应激相关基因的miRNA在挪威云杉的小RNA文库中持久化。其中5个miRNA诱导靶向NB-LRR转录物[28]．

在云杉中发现了nb - lrr，现在有大量可用的转录序列，使鉴定nb - lrr成为可能在Silico.，但在挪威云杉等针叶树和其他裸子植物中，这些基因的确切数量是未知的。在这里，我们跟踪了21个NB-LRR相关基因和5个针对这些基因的推测mirna以及防御反应标记的差异表达Pachi4，PAPX3.和pap在挪威云杉的空间和时间梯度。这些关键基因的表达谱分析将阐明在挪威云杉的局部和系统抗性反应中，是否eb - lrr或mirna的转录调控是一个关键特征，并揭示是否有不同的宿主对创伤和病原体感染的反应。

宿主防御基因的诱导

III类过氧化物酶的转录水平PAPX3.和IV类逐蛋白酶Pachi4.在局部和系统上显著增加C. Polonica.接种和伤害(图1）.本地宿主对接种的响应C. Polonica.比单独伤害更快。与局部响应相比，全身增加较低，延迟，对伤口的系统反应强于C. Polonica.．苯丙氨酸氨 - 裂解酶pap对接种和创伤的局部反应增加，但对系统反应没有显著变化。宿主对创伤的反应在第3天达到峰值，所有三种转录本都在局部和系统水平上，然后下降到组成水平，而转录本水平在对创伤的反应中趋于更高C. Polonica.试验期为6d。

云杉NB-LRR基因的组织和系统发育

在NCBI和DFCI数据库中对NB-LRR家族基因的广泛搜索显示了200多个不同的基因云杉包含NB-LRR主题的条目(附加文件1那2和3.:)。在核苷酸和氨基酸序列上均有差异，可分为6个簇(RI family NB-LRR、NB-LRR、cc -NB-LRR、tir - p- loop-NB-LRR、NB-LRR受体样激酶、植物胞内ras -group相关NB-LRR)。这些簇状结构主要基于TIR或CC结构域的存在，以及额外的内部基元，如蛋白激酶结构域、NB-ARC结构域、F-box等。我们没有发现bed -finger- nb - lrr。根据翻译后的氨基酸序列相似性对所选NB-LRR基因模型进行聚类分析3.．

确定了五个推定的NB-LRR靶向miRNA（PamiR950, PamiR9501, PamiR3693, PamiR3697和PAMIR3705.)[28]，基于序列相似性，他们的推定目标被确定为PaLRR25, PaLRR26, PaLRR27, PaLRR28和PaLRR29，分别（附加文件2：表S.1．2和表年代1．2）.在这五个nb - lrr中，PaLRR27预计是CC-NB-LRR，而其余4个预计是tir - nb - lrr(附加文件3.：补充3）。将二十一个Nb-lrrs和五种miRNA遵循实时RT-PCR（QRT-PCR），并且使用的引物对具有相应的单个PCR产物，每个目标相应的单熔点（附加文件1那2和4.）.

推定Nb-LRR的差异表达响应接种和伤口

大多数已量化的NB-LRR转录本仍然非常接近本构水平，或在不同处理和时间点上仅显示轻微的转录本变化(Palrs 2,5,6,7,8,11,12,13,17,18,19,25,26,27,28和29;图2和3.）.只有5个nb - lrr (PaLRR1 PaLRR3那PaLRR14, PaLRR15和PaLRR16)显示出两倍以上的显著变化之间的对照和处理(图2）.CC-NB-LRR相关的PaLRR3表达的奇异最大增加，全身增加高达20倍，响应伤害的响应单独，局部增加高达25倍c . polonica。

mirna在接种和创伤反应中的差异表达

对于miRNAs，转录本丰度的变化是以PCR循环数(ddCt)的相对差异来表示的，所以这里1的值等于2¹，即增加两倍。这种方法略微不同于Nb-LRR样转录物给出的绝对定量值。五学习的miRNA在伤害和真菌接种的反应中表达了很大类似的表达趋势（图3.）.在第1天伤员和真菌接种样品中的miRNA的快速下调对于PamiR3693和PAMIR3705.．由于生物重复之间的差异，一些mirna在第3天和第6天观察到的增加不显著。5个假定的miRNA靶点PaLRRs 25来29没有显示与相应mirna共同变化的表达模式，即当mirna水平在第1天下降时，假定的靶palrr没有一致的增加。

这项工作是首次尝试调查云杉中nb - lrr的多样性，并跟踪植物中可能靶向抗性基因的mirna的表达模式。宿主防御标记基因的表达在局部和系统的反应，无论是单独的伤害和与病原体接种c . polonica。这些植物似乎从治疗中恢复得很快，证实了这种克隆的高抗性。我们研究的大多数nb - lrr在健康、受伤和接种挪威云杉的病原体中都保持接近其组成水平。然而,PaLRR3(CC-NB-LRR型抗性基因)对创伤和接种的反应表现出广泛的局部和全身的增加。我们发现，推测的靶向NB-LRR的mirna数量迅速下降，但只有两种mirna的变化显著，它们推测的NB-LRR靶标没有相应的变化。

令人惊讶的是，我们对诸如树木等长寿植物的nb - lrr及其相关基因在病原体攻击和其他胁迫后是如何调控的知之甚少，这甚至包括那些已经被充分研究过的植物杨树树种(6.]．以前的研究已经确定，挪威云杉树抗病性病原体具有快速诱导防御相关基因（例如过氧化物酶，IV类章节酶等）[24那29，而且似乎比易感基因型具有更有效的系统防御信号。在目前的研究中，我们发现了一个相对抗性的挪威云杉克隆的迹象，不仅是下游基因，比如papPAPX3.和PaChi4,但也有一些nb - lrr样转录本和两种推测的调控mirna，在真菌接种和创伤后，在局部和系统中受到不同程度的调控。然而，大多数nb - lrr似乎受到非常严格的转录控制，并且在健康和应激植物中都维持在低而稳定的本构水平，这一发现掩盖了这一发现。大多数NB-LRRS维持稳定的低水平可能与保存这些大蛋白和相关信号通路的成本有关，而且即使是低水平的组成蛋白也可能足以有效应对外来入侵者。

Nb-LRR基因似乎在针叶树挪威云杉中丰富，但由于我们没有挪威云杉的基因组序列，我们现在不能确定存在的抗性基因。在可用的云杉数据库中发现了200多种含有含有含量的抗性等基因，这类似于其他植物物种。在Col-0中已识别出超过160个NB-LRR编码基因拟南芥基因组(30.]，已知250个NB-LRR全长基因和560个NBS序列[31]并且已经确定了超过400个抗性等基因杨树[12]．在针叶树树中，在松树中最多研究了NB-LRR基因。Western White Pine显示抗病抗性对白松锈病生锈和抗核苷酸和CC-NB-LRR基因的遗传变异[13那14]．刘和ekramoddoullah [13]提出针叶树有一个庞大而多样的NB-LRR基因家族，针叶树的抗性基因与被子植物的R基因同源。nb - lrr在包括火炬松在内的几种针叶树中均有报道松果体taeda(l) [32),柳杉日本柳杉粳稻[33]，挪威云杉[29)、糖松松果体lambertiana西部白松[34那35]．现在从云杉和其他针叶树中可以找到大量的转录本。在DFCI云杉基因指数(Sgi, Release 5.0, dt)中发现259条LRR匹配序列。30.03.2011) (http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=spruce.）.在Silico.这些分析证实云杉具有相当大的防御和抗性类基因库，在我们的研究中，我们发现了LRR基因的所有主要亚群，除了报道的BED-finger LRR蛋白基因杨树[6.那36]．

NB-LRRS已与针叶树的抗性相关联。在白皮中TIR-NB-LRR同源物PmTNL1是与白松氏泡沫锈的部分抗性有关的抗性基因c . ribicola．的PmTNL1转录本在不同的组织中以低水平表达。在亲和和不亲和的相互作用中，表达保持不变c . ribicola在接种后的早期阶段，但在相互作用的后期阶段，症状植物中发现了较高的水平[35]．我们发现RI家族NB-LRR也有类似但不太明显的上调PaLRR15,也为PaLRR1PaLRR14和PaLRR16，尤其是CC-NB-LRR班PaLRR3．然而，我们研究的大多数TIR-NB-LRS和其他NB-LRS在伤害或接种后仍然在稳定的水平下保持稳定。这与先前的研究同意，表明，诸如Nb-LRR的抗性基因通常在低基础水平下组成型成分，并且在病原体攻击后不会显着增加[35-37]．在NB-LRS的综合研究中发现了类似的结果杨树．科勒和他的同事，研究了NB-LRR基因的多样性Populus Trichocarpa.在锈病和未锈病的叶片中，400个已知的NB-LRR同源物中仅检测到34个，而且在接种两天后，34个NB-LRR的表达均未发生变化[12]．因此，我们对挪威云杉的研究结果支持了nb - lrr通常保持在其组成水平附近的假设。然而，不能排除至少有一些R-like基因在攻击后数小时内在转录或转录后水平受到调控，也可以想象，单个nb - lrr的构成水平可能在启动植物中被提高[38]．

我们的转录数据不足以在mirna的表达之间建立明确的联系PamiR950那PamiR951那PamiR3693那PamiR3697和PAMIR3705.，他们的NB-LRR候选人PaLRR25来29以及下游挪威云杉的防御诱导标记。然而，预计会出现快速且统计上显著的下调PamiR3697和PAMIR3705.将通过推定的NB-LRR目标的更大表达来反映。缺乏MiRNA表达与其预测的NB-LRR靶序列之间缺乏明确的对应有几种解释;（1）这里检测到的miRNA水平的变化可能只是对Nb-LRR靶标产生重大影响，（2）MiRNA可以优先于其他Nb-LRR谬论上的作用，而不是这里鉴定的Nb-LRR谬论。（3）推定的Nb-LRR靶也可以是miRNA的起源，使得同样是进一步的问题，（4）Nb-LRR靶基因的表达可能是紧密控制的阳性和阴性调节剂，从而覆盖效果MIRNA或更少可能（5）这些miRNA可能抑制Nb-LRR的翻译而不会导致RNA转录物的分解。最可能的解释可能是我们在miRNA水平中检测到的小变化，并在这些基因的推广器中的转录因子进行调节因子，以保持稳定的NB-LRR转录水平。我们也可能看看miRNA和他们的NB-LRR目标的变化，在治疗之后的比赛时间比第1至6天在治疗之后的较早时间点，并且优先于接种的附近的宿主细胞上集中在宿主细胞上伤口部位。但是，我们的合并结果不排除MiRNA可能参与挪威云杉的本地和系统防置响应，但表明必须与其组合研究大量的小RNA（比NB-LRS延伸到其他目标）通过最新一代测序方法对所有靶标的转录组和降解研究。

组织中的特定细胞类型可能在病原体识别和系统防御信号传递中具有特殊的作用，当从组织的大部分(如树皮)采集样本时，这些作用是无法解决的。针叶树的树皮含有特化的组织(韧皮部、皮层和周皮)，这些特化的细胞按规则的模式组织[39例如穿过树皮进入木材的光线可以在防御中发挥特殊作用。因此，防御反应可能是高度细胞类型特异性的，或在病变组织中以微妙的梯度表达，强调需要使用高分辨率的方法，如原位杂交和激光显微解剖(LMD)方法。已在白云杉树皮的单个细胞类型(树脂管和形成层)上进行了针叶树茎组织的LMD，以用于转录分析、酶活性和代谢物的单个细胞类型[39]．为了更好地确定挪威云杉耐药基因、mirna和信号转导的作用，现在需要这种基于LMD的实验，以便更好地了解在单细胞类型水平上对病原体及其效应体的识别。

从我们的数据可以得出两个结论。首先，挪威云杉裸子植物中的大多数nb - lrr维持在较低的组成水平，这表明这些基因产物的基础水平足以作为外界挑战(如病原体)的受体(或易位体)发挥其假定的抗性基因功能。因此，nb - lrr在耐药性中的作用可能是组成性的存在，以检测病原体效应物(直接或间接)，而不受挑战后的差异调控[6.那8.那11那26那35-37]．

其次，在这项推测的NB-LRR靶向miRNAs的研究中，我们观察到miRNAs及其预测的NB-LRR靶点的表达相对轻微的变化。这并不一定排除mirna在耐药中的作用，但表明它们可能与其他调控因子共同促进nb - lrr的紧密组成性表达，以检测外部挑战。

植物材料和取样

实验材料包括21个相同的2岁幼树体细胞胚胎发生从一个挪威云杉无性系。该克隆(AL15886-B10)由一个全同胞杂交(♀#2650 ×♂#2707)的单粒种子衍生而来，幼树由挪威Biri苗圃和种子改良中心培育[40]．Al15886-B10对真菌感染相对抗性，因为它含有在树皮中非常短的坏死病变内的真菌，并在与坏死性接种后一个月内恢复异常的Parviporum和长喙壳属polonica[25]．如前所述在自然光照条件下形成芽并越冬后[41]将遗传相同的树苗暴露于晚泉条件下，并在环境日长度（20-22°C）下在环境日长度的最佳温度（20-22°C）中，具有200-250μmolm^－2S.^－1光照条件。接种和伤害植株的时间是在主芽已经伸长(活跃生长)和任何新芽形成之前。在整个实验过程中，这些植物都得到了充足的水分和肥料。25]．

树苗接种C. Polonica.(没有隔离。NISK 93-208:115) (Cp)或茎部受伤(W)。用手术刀在离地5cm处切一个约5mm宽的树皮瓣，接种植株。将少量含有活跃生长菌丝体的麦芽琼脂(1%麦芽和1.5%琼脂)置于皮瓣下方，将皮瓣紧紧压在茎上，用护膜封闭创面。伤口采用同样的方法，但使用不含真菌的麦芽琼脂。未受伤的对照植株(C)也在茎的相应位置用薄膜包裹。在处理后1、3和6天，从每个处理和时间点至少2个分株中采集局部和较远的树皮样本(1厘米长)。样品在液氮中速冻，−80°C保存至分析。为了区分局部和全身的基因表达，分别对局部和远端样本进行分析。局部标本(W1/Cp1)包括接种/创伤部位和延伸到伤口上缘0.5 cm以上的ca。 The distal sample (W2/Cp2) included the entire bark region 2–3 cm above the inoculation/wounding site. The unwounded controls were sampled at the corresponding positions.

NB-LRR基因注释、肽结构和系统发育分析

利用NB-LRR家族保守催化结构域对NB-LRR基因进行初步搜索云杉（TATID：3328）国家生物技术信息中心的序列（NCBI）数据库使用BLASTP算法。保守的结构域衍生自NCBIGegank获得的一系列Nb-LRR基因序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）.我们获得的所有唯一序列都是使用与NCBI Genbank和保守域数据库（CDD）的NCBI Blast Server进行验证的NCBI Blast Server [41]．选择包含NB-LRR基序的基因模型进行进一步研究。此外，我们搜索了DFCI云杉基因指数(发布5.0,2011年3月30日http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl?gudb=spruce.)，使用关键词“LRR”选择临时注释为NB-LRR基序基因的单基因列表。

我们使用Mega4软件对所选Nb-LRR基因模型的翻译氨基酸序列进行系统发育和分子进化分析[42]．利用邻域连接法推断其进化历史。从500个重复中推断出的自举共识树代表了分析类群的进化史。在不到50%的引导复制中复制的分区对应的分支崩溃了。系统发生树被线性化，假设所有谱系的进化速率相同。树是按比例绘制的，树枝长度与用来推断系统发育树的进化距离相同。进化距离采用泊松校正法计算，并以每个位点的氨基酸替换数表示。包含对齐间隙和缺失数据的位置仅在成对序列比较中被消除(成对删除选项)。

推测靶向nb - lrr的mirna的选择

我们鉴定了5种推测的靶向NB-LRR转录本的mirnaPaLRR25PaLRR26PaLRR27PaLRR28和PaLRR29(表s1.2)。这些mirna具有在Silico.mirna参与挪威云杉表观遗传调控和气候适应的早期研究中鉴定的microRNA特征[28]．假定靶向nb - lrr的mirna的GenBank登录号在附加文件中给出2;表S2和NB-LRR序列的登录号在附加文件中给出1：表S1.1，附加文件2:表s1.2和附加文件3.：补充3。

总RNA提取和cDNA合成

使用砂浆和杵在液氮中研磨树皮样品（100-150mg），然后转移到2ml Eppendorf管中，在RetSch 300磨料（Retsch GmbH，Haan，Germand）中进行精细研磨1.5分钟。将设备和组织样品保持冷冻₂整个磨削过程。按照制造商的建议，使用Master Pure™RNA纯化试剂盒(Epicentre, Madison, WI, USA， #MCR85102)从100mg的粉碎样品中提取总RNA(包括小RNA片段)，并在−80°C下存储，直到进一步使用。使用微体积分光光度计(Nano Drop 2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)对RNA进行定量。

CDNA合成和靶量转录物的实时RT-PCR

利用Primer3设计基因特异性引物[43]的标准为熔化温度70°C和产品尺寸&120 bp。所有研究的nb - lrr样同源物及其引物序列列于表s1.1。RT-PCR扩增后，PCR产物在2%琼脂糖凝胶上运行，检测所有引物的特异性。RT-PCR实验中只使用了能产生清晰单链的引物(附文件)4.：图S4）。用于量化的引物PaChi4,教皇和PAPX3.已获核实[23]．用TaqMan逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA， # 8080234)对总RNA进行逆转录(每次1 μg)，反应体积为50 μl，稀释至200 μl。PCR扩增量为25 μl，以2 μl稀释的cDNA溶液为模板，12.5 μl 1x SYBR Green master mix，每条引物200 nM。采用标准循环参数的7500 Fast Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Carlsbad CA, USA)进行rt -PCR。所有反应都是重复进行的，每个引物对都进行无模板对照。为了进行数据分析，计算了两个生物重复的算术平均数。目的基因表达归一化到肌动蛋白的转录水平(pa）.在我们之前的工作中pa转录本已被证明是挪威云杉RT-PCR的最佳内源参考，因为与alphaTubulin (PaTub), Polyubiquitin (PaUbq)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(PaGAPDH)[44]．进一步确保PaAcT是一个稳定的参考，我们比较了稳定性pa在所有一天的表达水平一个样品PaTub和翻译启动因子（pat）并发现使用pa单独作为RT-PCR的内源性参比与结合三种参比具有同样的意义paPaTub和pat（数据未显示）。

采用7500系统SDS软件进行绝对定量，数据用MS Excel进行进一步处理。

量化的microrna

如Yakovlev et al.(2010)所述，通过相对实时RT-PCR测定所选mirna的转录本丰度。利用NCode miRNA第一链cDNA Synthesis Kit (MIRC-50;Invitrogen公司)按照制造商的建议。采用NCode SYBR GreenER miRNA qRT-PCR Kit (MIRQER-100;以2μl稀释的cDNA水溶液为模板，引物长度为200 nM，反应体积为25μl。使用Invitrogen公司推荐的循环条件，在7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上进行反应。PCR后做解离曲线，验证扩增的特异性。每个样品有两个技术和两个生物学的重复。所有miRNA表达水平归一化到三个选定的核糖体和转移RNA基因的几何平均值。基于成熟miRNA序列设计了正向引物。 If Tm of the mature miRNA was&60°C, it was adjusted by adding Gs and Cs to the 5-end and/or the 3-end of the miRNA sequence. To verify the specificity of the miRNA amplification we analysed several PCR samples for each miRNAs on 2% agarose gels with ethidium bromide (EtBr) visualization of bands. Reverse primers was supplied with the NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (MIRC-50; Invitrogen). The miRNA primers used are listed in Additional file2:表s1.2和附加文件2表S2。

mirna采用基于临界循环阈值的相对ddCT定量方法，使用7500系统SDS软件。数据在MS Excel中进一步处理。

统计分析

相对转录量由real-time PCR获得的原始数据以miRNA数据的临界阈值(dCt)的形式计算，如[25]．对于Nb-LRRS和抗性基因标记，获得了基于标准曲线的绝对定量值[23]．由于数据集中的所有植物都在同一株植物上进行了多次基于qRT-PCR的观测，因此使用SAS软件系统(SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)的GLM和Mixed程序对转换后的值进行重复测量方差分析。在这些程序中，通过使用lsmeans语句中的pdiff选项进行治疗方法之间的计划比较。

我们感谢Lars Dalen在样品收集期间帮助，并持有样品准备的帮助。我们还感谢两个匿名评论员，用于改进稿件的建设性评论和输入。该工作得到了挪威研究委员会的支持（授予136001年）。

从属关系

1. 挪威森林与景观研究所，Høgskoleveien 8, As, NO-1431, Norway

   Carl Gunnar Fossdal, Nadeem Yaqoob, Paal Krokene, Harald Kvaalen, Halvor Solheim & Igor A Yakovlev

2. 挪威生命科学大学生态与自然资源管理系，Høgskoleveien 12, As NO-1432, Norway

   纳迪姆Yaqoob

相应的作者

对应到卡尔贡纳Fossdal．

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

CGF和PK构思和设计研究，IAY、PK、CGF和NY进行实验并收集数据，HK、IAY、CGF、PK和NY进行数据分析。CGF, PK, HK, IAY, HS, NY起草稿件。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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