质膜蛋白OsMCA1参与低渗透休克诱导钙的调控^{2 +}水稻培养细胞中活性氧的流入和调节

背景

机械感测及其下游反应可能与含钙的感觉复合体有关^{2 +}-渗透性机械敏感通道。在识别渗透信号时，植物细胞启动广泛的信号转导网络，诱导第二信使和触发诱导防御反应。典型的早期信号事件包括Ca^{2 +}内流，蛋白质磷酸化和活性氧(ROS)的产生。药理分析显示钙^{2 +}机械敏钙介导的内流^{2 +}通路来影响渗透信号的诱导，包括ROS的产生。然而，早期渗透信号事件的分子基础和调节机制仍然很不清楚。

结果

我们在此鉴定并研究了已知Ca的唯一水稻同源物OsMCA1^{2 +}拟南芥(MCAs)的-渗透力敏通道。OsMCA1特异性定位于质膜。启动子-报告子实验表明OsMCA1在水稻中，mRNA广泛表达于种胚、芽的近端和根尖、叶和根的叶肉细胞中。Ca^{2 +}摄取增强OsMCA1表明OsMCA1参与了Ca^{2 +}通过质膜流入。NADPH氧化酶介导的低渗透冲击诱导ROS生成也增强OsMCA1 -overexpressing细胞。我们也生成和描述OsMCA1-RNAi转基因植物及培养细胞;OsMCA1 -受抑制的植株生长迟缓，株系缩短OsMCA1-抑制细胞携带Ca^{2 +}-敏感的光蛋白aequorin在胞质游离钙中表现出部分受损的变化^{2 +}浓度([Ca^{2 +}］_cyt)由低渗透休克和三硝基酚(一种机械敏感通道的激活剂)诱导。

结论

我们在水稻基因组中鉴定了唯一的MCA同源基因，并开发了过表达和抑制系。这种假定钙水平改变培养细胞的分析^{2 +}-渗透性力敏通道表明OsMCA1参与了质膜钙的调控^{2 +}低渗透胁迫诱导水稻细胞内流和ROS生成。这些发现揭示了我们对机械传感途径的理解。

植物需要感知和响应机械压力，如风、触摸和渗透压的变化[1- - - - - -3.］．胞质游离钙升高^{2 +}浓度([Ca^{2 +}］_cyt)是对各种刺激的反应，如化学、物理和机械刺激[2，4- - - - - -7］．在这个过程中，[Ca^{2 +}］_cyt关卡通过Ca的开放而上升^{2 +}位于质膜和内膜上的通道。电生理和生物信息学研究揭示了质膜钙的存在^{2 +}-机械刺激激活的渗透通道，尽管所涉及的结构实体及其生理功能在很大程度上尚不清楚[8- - - - - -12］．

分子和电生理研究表明拟南芥MSL9和MSL10是细菌力敏通道MscS的同源物，是根细胞质膜中力敏通道活性所必需的，并且对Cl的渗透性更强^-比Ca^{2 +}［13，14］．我们最近鉴定了两种质膜蛋白为推定的Ca^{2 +}拟南芥中-渗透力敏通道MCA1 (At4g35920)和MCA2 (At2g17780) [15，16的异位过表达MCA1增加钙^{2 +}对[Ca .]的吸收^{2 +}］_cyt低渗透性休克后升高。然而，MCA蛋白直接影响渗透诱导的Ca^{2 +}通过质膜的内流和渗透信号通路尚不清楚。

在识别渗透信号后，植物细胞启动广泛的信号转导网络，诱导第二信使和触发诱导防御反应。典型的早期信号事件包括Ca^{2 +}内流、蛋白质磷酸化及活性氧的产生[17- - - - - -20.］．当Ca^{2 +}流入受到Ca^{2 +}螯合剂，如乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N N N’N’-四乙酸(EGTA)，或Ca^{2 +}-通道阻滞剂，如La^{3 +}［21］．据报道，在烟草细胞中，低渗透冲击诱导的ROS生成需要激活机械敏感钙^{2 +}渠道(22］．这些结果表明Ca^{2 +}机械敏钙介导的内流^{2 +}通道参与渗透信号的诱导，包括ROS的产生。然而，在渗透反应中，分子基础和调控机制仍然很不清楚。

在目前的研究中，我们已经在水稻基因组中发现了唯一的MCA同源基因，并开发了过表达和抑制系。这些系的研究改变了这种假定的力敏钙的水平^{2 +}OsMCA1参与了质膜钙的调控^{2 +}低渗透胁迫诱导水稻细胞内流和ROS生成。

OsMCA1的鉴定及其表达模式

全长cDNAOsMCA1通过快速扩增cDNA末端(RACE -PCR)方法获得。它编码了一个含有418个氨基酸残基的多肽，计算分子质量为47,417 (GenBank Accession No. 417)。AB601973)。预测蛋白与拟南芥MCA1和MCA2的氨基酸序列一致性分别为66.7%和57.6%;TopPred项目http://www.sbc.su.se/~erikw/toppred2/表明OsMCA1有两个潜在的跨膜段(S1和S2)(附加文件)1)，而其他跨膜段预测程序给出了不同数量的假定跨膜段(数据未显示)。通过TMpred预测发现了PLAC8基序http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html在c端区域(附加文件1)．全基因组数据库搜索(Rice BLAST;http://riceblast.dna.affrc.go.jp/)表明大米没有其他的同源物OsMCA1．

定量逆转录酶(RT -PCR)分析结果显示OsMCA1mRNA在成熟叶、嫩枝、根和悬浮液培养细胞中均有表达OsMCA1mRNA在整个植物的幼苗和培养细胞中表达(附加文件2)．我们还查阅了微阵列表达数据库(Rice XPro;http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP/index.html，OsMCA1轨迹ID;Os03g0157300)，表达OsMCA1整个发育阶段的mRNA，包括根、叶片、圆锥花序、花药、雌蕊和子房以及胚胎(数据未显示)。的空间格局OsMCA1表达被检查使用OsMCA1启动子:β葡萄糖醛酸酶(格斯)融合报告基因构建(OsMCA1p::格斯)．数字1显示OsMCA1p::格斯在种子中表达，在胚中表达量较高。在苗期，OsMCA1p::格斯在茎部近端和顶端高度表达(图1 b-g)．叶子的横截面说明了这一点OsMCA1p::格斯在叶肉细胞中高度表达，但在维管组织中表达水平相对非常低(图1 h-j)．OsMCA1p::格斯在根中也有表达，在主根中心和侧根原基中表达量较高(图1 km)．这些结果表明OsMCA1转录在整个发育阶段都可能受到调控。的表达模式OsMCA1和拟南芥相似吗MCA2．

OsMCA1蛋白的细胞内定位

为了研究OsMCA1蛋白的胞内定位，我们将融合于OsMCA1 n端编码序列的绿色荧光蛋白(GFP)构建物引入烟草BY-2细胞，并使用共聚焦激光扫描显微镜检测其胞内定位。当GFP单独表达时，它定位于细胞核和细胞质(图2 i, j)．相比之下，GFP-OsMCA1融合蛋白特异性定位于质膜(图2 a, b)．用高渗透溶液(1 M甘露醇)处理后，这种模式得到加强，其诱导了质水解(图2 e, f)．此外，GFP-OsMCA1在质解前后的荧光图像和行为与细胞内染色标记物FM4-64不同(图4-64)2c g k而且2d h l)，说明OsMCA1定位于质膜。

OsMCA1过表达对Ca^{2 +}在培养水稻细胞中的吸收

测试OsMCA1是否在Ca中起作用^{2 +}在转运过程中，我们产生了过度表达的培养细胞OsMCA1并分析了是否表达水平OsMCA1影响钙^{2 +}吸收的活动。如图所示3 a, B、钙^{2 +}的吸收活性较高OsMCA1-过度表达的细胞格斯表明OsMCA1参与了Ca^{2 +}水稻在质膜上的吸收。我们还生成了OsMCA1-过表达的植物，没有显着的可见表型(数据未显示)。

OsMCA1抑制对植物生长发育的影响

为了阐明OsMCA1的生理作用，我们在OsMCA1中培养了转基因植物OsMCA1RNA干扰抑制表达(RNAi)使用基因特异性序列(400 bp的区域OsMCA1)．5个独立的转基因植株农杆菌属介导的转换。同时研究了非转基因植物作为对照，通过杂合分离去除转导基因。RT-PCR分析显示OsMCA1mRNA水平与对照组比较(图4)．

的OsMCA1-抑制系在成体植株中生长较慢(图4 b, C)．虽然在Murashige和Skoog培养基(MS培养基)中，抑制系的发芽率(数据未显示)和幼苗生长与对照相当(附加文件)3.)，移栽到温室土壤后，抑制系生长明显受阻OsMCA1压抑会导致对环境压力的极度敏感。该表型在5个独立T中均有表现₂转基因RNAi行;表型的严重程度与基因的表达水平密切相关OsMCA1成绩单(图4 a, C)．此外，与拟南芥不同mca变种人，种族OsMCA1 -抑制线明显短于对照组(图4 d, E)，表明OsMCA1在某些发育阶段与拟南芥MCAs发挥不同的作用。

osmca1抑制对细胞生长和Ca^{2 +}培养水稻细胞的敏感性

我们测试了OsMCA1抑制Ca^{2 +}对水稻细胞生长的敏感性。在含有3mm钙的常规介质中^{2 +}的增长率OsMCA1-抑制线与对照组相当(图5)．相反，当Ca^{2 +}培养基浓度降低至0.1 mM(图5)、增长OsMCA1与对照组相比，OsMCA1基因的表达明显受限，提示OsMCA1基因可能参与了Ca的获取^{2 +}钙对细胞生长的影响^{2 +}限制。

OsMCA1参与机械应力诱导[Ca^{2 +}］_cyt变化

检测OsMCA1是否参与钙的调控^{2 +}各种刺激诱发的涌入，我们产生了OsMCA1-抑制线港Ca^{2 +}-敏感的生物发光蛋白aequorin(图6)．低渗透冲击诱导的瞬态[Ca^{2 +}］_cyt在培养水稻细胞中的变化(图6 b)被Ca^{2 +}螯合剂,以叔——(2-aminophenoxy)乙烷-N N N’N’-四乙酸(BAPTA)和Ca^{2 +}通道阻滞剂(GdCl_3.和LaCl_3.)而不是通过维拉帕米，一种电压依赖性钙抑制剂^{2 +}通道(图6摄氏度)，表明质膜Ca^{2 +}Gd介导的内流^{3 +}Ca^{2 +}-渗透通道是由低渗透冲击引起的。低渗透冲击诱导[Ca^{2 +}］_cyt变化在OsMCA1-抑制细胞(图6 e)，与的水平成正比OsMCA1表达方式OsMCA1抑制细胞。另一方面，增加[Ca^{2 +}］_cyt引发的N乙酰壳寡糖，一种水稻质膜受体识别的主要微生物相关分子模式[23，24]，不受影响OsMCA1表达水平(图6 d)．这些结果表明OsMCA1参与了质膜Ca^{2 +}低渗透休克而非mamp引起的内流。

三硝基酚(TNP)是一种有效的化合物，可产生膜扭曲，激活机械敏感通道，模拟植物的机械刺激[15]和动物细胞。我们研究了TNP对[Ca^{2 +}］_cyt以及OsMCA1可能参与了其在培养水稻细胞中的调控。TNP诱导的瞬态[Ca^{2 +}］_cyt变化，BAPTA、GdCl抑制_3.，和LaCl_3.而不是维拉帕米(图7 a、B)．[Ca^{2 +}］_cyt低渗透休克和TNP触发的瞬态基本相似(图6摄氏度，7 b)．TNP-induced (Ca^{2 +}］_cyt变化也被削弱OsMCA1-抑制线(图7 c)，提示OsMCA1可能参与了一个假定的机械敏感Ca^{2 +}-渗透通道在机械应力触发的质膜Ca^{2 +}涌入。

我们也试图检查过表达的影响OsMCA1机械应力触发Ca^{2 +}涌入。然而，我们观察到，在所有过表达的转基因细胞系中，aequorin的总发光强度都有很强的降低OsMCA1(数据未显示)。因此不可能测量[Ca^{2 +}］_cyt使用OsMCA1-overexpressing线。Real-time RT-PCR分析结果显示aequorin基因的表达水平OsMCA1-过表达线与对照组相当(数据未显示)。的本构过表达OsMCA1不影响马蹄素蛋白的表达，但可能影响马蹄素蛋白的稳定性或抑制马蹄素化学发光。

osmca1过表达对低渗透休克敏感性和活性氧产生的影响

低渗透性休克已被证明可在[Ca^{2 +}］_cyt培养烟草细胞增加[18，22］．由于OsMCA1被认为影响低渗透休克诱导的Ca的调节^{2 +}涌入(图6 e)，我们利用两种对超氧阴离子自由基敏感的方法(^•O₂^-)和过氧化氢(H₂O₂)．

低渗透休克在5分钟内触发ROS生成(图8)， Ca^{2 +}通道阻滞剂(GdCl_3.和LaCl_3.)，表明Ca在其中发挥了重要作用^{2 +}低渗透休克诱导的ROS生成(图8 b)．二苯碘(DPI;10 μM)，一种NADPH氧化酶抑制剂，显著抑制ROS的生成(附加文件4)．过氧化物酶催化的反应也被提出用于渗透冲击诱导的ROS生成的培养烟草和拟南芥细胞(19］．然而，过氧化物酶抑制剂水杨酸羟肟酸(SHAM, 3 mM)几乎不影响低渗透休克诱导的ROS生成(附加文件)5)，表明低渗透冲击诱导ROS生成的主要原因是培养水稻细胞中产生ROS的NADPH氧化酶。低渗透休克诱发的世代^•O₂^-(图8 c, D)和H₂O₂(附加文件6)，要么显著增强，要么更快OsMCA1-比对照组多表达了几行。体内ROS的生成OsMCA1-抑制线与对照组相当(图8)．

有人认为Ca^{2 +}在机械传感中起着至关重要的作用[7，25］．然而，钙的分子机制却知之甚少^{2 +}动员。的功能特征OsMCA1-RNAiOsMCA1参与了低渗透休克诱导的Ca^{2 +}内流和ROS生成。

OsMCA1在水稻生长发育调控中的可能功能

OsMCA1-抑制的植物表现出生长迟缓和缩短的racu(图4 d, E)．这些表型经常在干旱胁迫条件下观察到[26］．压制OsMCA1可能影响了对干旱的适应。众所周知，干旱胁迫会导致细胞水平的渗透胁迫。由于低渗透冲击诱导[Ca^{2 +}］_cyt的变化受到损害OsMCA1-抑制系，这些系可能在渗透感应/反应和适应干旱胁迫能力方面存在缺陷。未来的研究将描述干旱的生理反应和机械信号OsMCA1 -抑制植物将进一步阐明OsMCA1在完整植物体内的作用。

在拟南芥中mca1 mca2双突变体在土壤中生长缺陷，钙的积累减少^{2 +}以及增强对Mg的敏感性^{2 +}［16］．Ca的余额^{2 +}和毫克^{2 +}是植物正常生长的重要因素[27］．自成长起OsMCA1与对照相比，Ca处理显著限制-抑制系^{2 +}限制(图5)，生长迟缓OsMCA1钙含量降低可能是导致植物钙含量降低的原因^{2 +}摄取，导致低钙^{2 +}毫克^{2 +}比率。

OsMCA1可能参与水稻细胞的渗透信号传导

GFP-OsMCA1融合蛋白特异性定位于质膜(图2)，表明OsMCA1是一种质膜蛋白。在培养的水稻细胞中，低渗透休克和tnp诱导的[Ca^{2 +}］_cyt瞬态，这是由La抑制^{3 +}和Gd^{3 +}，在OsMCA1-抑制线(图6而且7)．mamp诱导的[Ca^{2 +}］_cyt瞬态是类似的(数据未显示)，但不受影响OsMCA1抑制(图6 d)．这些结果表明OsMCA1影响Ca的调控^{2 +}在人工培养的水稻细胞中，机械刺激对质膜的反应。

低渗透性休克触发ROS生成[Ca^{2 +}］_cyt增加(18，20.，22］．细胞外钙^{2 +}Ca^{2 +}低渗透休克引起的内流和NADPH氧化酶介导的ROS生成(图6摄氏度而且8 b，附加文件4)，表明ROS的产生需要Ca^{2 +}通过质膜流入。过度的OsMCA1增强ROS的生成(图8 d，附加文件6)．绑定Ca^{2 +}到植物NADPH氧化酶细胞质调节结构域的ef手区直接激活它们[28- - - - - -30.］．据报道，一种功能性NADPH氧化酶AtrbohC/RHD2影响机械应激诱导的活性氧生成^{2 +}-依赖方式[31］．质膜钙过量^{2 +}-渗透性通道可诱导过量钙的动员^{2 +}对机械刺激的反应，这可能会导致NADPH氧化酶的增强激活。

在OsMCA1低渗透休克挑战的-抑制系，Ca^{2 +}内流部分受损(图6 e)，但在我们的实验条件下，没有检测到损伤对后续ROS生成的显著影响(图8)．类似的过表达和功能缺失突变也观察到另一种推定的钙^{2 +}-渗透通道，OsTPC1 [32］．一定量的钙^{2 +}对NADPH氧化酶介导的ROS生成可能足够。或者，其他Ca^{2 +}低渗透休克激活的-渗透性通道可能在绕过OsMCA1中起冗余作用。研究表明，拟南芥MSL9和MSL10是细菌力学敏感通道MscS的同源物，是根细胞膜力学敏感通道活性所必需的，能够转运包括Ca在内的阳离子^{2 +}［13，14］．因此，水稻MSL同源物可能是这种Ca的候选者^{2 +}透水通道。

本研究表明OsMCA1参与了质膜钙的调控^{2 +}低渗透胁迫诱导水稻细胞内流和NADPH氧化酶介导的ROS生成。这些发现揭示了我们对机械传感途径的理解。

植物材料及细胞培养

表面杀菌的水稻种子，水稻．简历。日本枯草，在MS培养基上萌发[33]含0.8%琼脂，在长昼条件下(光照16小时/黑暗8小时，28°C)生长室中生长10天。幼苗移栽到土壤中，在温室(光照16小时/黑暗8小时，28°C，湿度60%)中生长。愈伤组织在25℃液体L培养基中悬浮培养[34]含有2,4- d (0.5 mg L .^－1)，并在新鲜培养基中传代培养。每2周用20目筛网对细胞进行过滤，形成细团聚物。传代后5 d的细胞进行渗透胁迫和防御反应实验。N-乙酰壳寡糖由Naoto Shibuya教授(明治大学)提供。

OsMCA1 cDNA的分离

的估计编码区域OsMCA1采用两种引物进行PCR扩增:OsMCA1向前,5“-GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCCGAGTAG-3”;OsMCA1相反,5‘-TATTTATGCTTACCCTGCATTGTTTGTGTT-3’。使用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从水稻叶片中分离总RNA，并按照制造商的方案进行分光光度法定量。用oligo-dT引物和逆转录酶(Invitrogen)从3 μg总RNA合成第一链cDNA。获取全长cdnaOsMCA1为了确定开放阅读框，按照制造商的协议，使用3'-full RACE核心试剂盒(Takara, Ohtsu, Japan)和5'-RACE系统(Invitrogen)进行3'-RACE PCR和5'-RACE PCR。

RNA分离和RT-PCR分析

使用Trizol试剂按照制造商的方案分离总RNA，并使用分光光度计定量。用寡核苷酸dt引物和逆转录酶从3 μg总RNA合成第一链cDNA。PCR扩增在95°C初始变性3 min，然后在94°C孵育30 s, 55°C孵育90 s, 72°C孵育1 min，使用特定引物进行OsMCA1。肌动蛋白用作定量对照[35］．用琼脂糖凝胶电泳分析各PCR产物的等分，并用溴化乙锭染色和紫外线照射进行观察。

实时RT-PCR定量

实时RT-PCR检测如Kurusu等人(2010)所述[36］．用寡聚- dt引物和逆转录酶从3 μg总RNA合成第一链cDNA。实时PCR使用ABI PRISM 7300序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和SYBR Green实时PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)进行OsMCA1特异性引物OsMCA1-RealF, 5'-TGGTCTCAAGCAGAGGATCATACA-3';OsMCA1-RealR 5“-CTCTGAACAGCAACCAAGCAAA-3”。使用标准曲线法计算相对mRNA水平，并归一化到相应的水平OsActin1基因水平。已知模板量的标准样品用于定量PCR产物。

OsMCA1p:: gus表达植物OsMCA1表达的空间格局

一个DNA片段OsMCA1通过聚合酶链反应合成5'-非编码区，制备启动子区^-从1.5到0 KBOsMCA1起始密码子，以水稻(Nipponbare)基因组DNA为模板，引物:OsMCA1pF, 5'-中国商用飞机有限责任公司AACAACCCCTAACATGCCTAA-3 ';OsMCA1pR, 5'-TGCCGTCGTCTACTCGGCTTCTTCT-3' (Gateway系统使用的CACC序列)，亚克隆到pENTR/D-TOPO克隆载体上，然后克隆到ti基无启动子上格斯表达载体，pHGWFS7 [37]使用LR克隆酶反应;农杆菌属对水稻愈伤组织进行了细胞介导转化。用湿霉素(50 μg mL)筛选转化愈伤组织^－1）;然后再生转基因植物。

T₂转基因植株在28℃光照16 h /暗8 h的循环条件下生长进行实验。GUS活性原位组织化学定位如下。样品在Eppendorf管中用90%的丙酮固定1小时，放置在冰上，并用100 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤4次。样品在X-Gluc缓冲液(0.5 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡醛酸酶(Nacalai Tesque, Osaka, Japan)， 50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0, 5%甲醇)中37℃孵育24 h，然后依次用50%、70%、90%、100% (v/v)乙醇清洗固定1 h。固定样品在100%乙醇中保存后拍照。

osmca1过表达和抑制系的产生

为了生成rna沉默触发的反向重复结构，的3'-UTR的400 bp对应区域OsMCA1用RNAiFW扩增，5'-中国商用飞机有限责任公司CTCTTATCCAAACTTGCCAT-3'和RNAiRV, 5'- AATGTTCCACAGGGGAAAAAGAATGTTCTC-3'作为特异性引物，亚克隆到pENTR/D-TOPO克隆载体中，克隆到ti基RNAi载体pANDA [38]使用LR克隆酶反应。将该结构引入水稻愈伤组织中农杆菌属-介导的转化，根据Tanaka et al. 2001的方法[39］．用湿霉素(50 μg mL)筛选转化愈伤组织^－1）;然后再生转基因植物。从T₂植物被用于各种分析。

过度表现OsMCA1而且格斯将cdna、序列克隆到ti基载体pPZP2H-lac [40玉米的下游泛素启动子,农杆菌属对水稻愈伤组织进行了细胞介导转化。用湿霉素(50 μg mL)筛选转化愈伤组织^－1)，然后再生转基因植物。

表达细胞质靶向apoaequorin互补脱氧核糖核酸(41在OsMCA1克隆到ti载体pSMAB704 [42的下游CaMV 35 s启动子,农杆菌属对水稻愈伤组织进行了细胞介导转化。转化愈伤组织采用bialaphos (Meiji Seika, Tokyo, Japan)筛选(5 μg mL^－1)，然后再生转基因植物。

OsMCA1在烟草BY-2细胞中的亚细胞定位

为了产生表达GFP-OsMCA1的转基因BY-2细胞，使用OsMCA1(GFP)F, 5'-扩增编码区中国商用飞机有限责任公司ATGGCGTCGTGGGAGAACCT-3'和OsMCA1(GFP)R, 5'-TTAGTGTTCCATGTACTGAA-3'作为特异性引物，亚克隆到pENTR/D-TOPO克隆载体上，然后克隆到n端EGFP融合的pH7WGF2载体上[37]使用LR克隆酶反应。

BY-2细胞转化按照An(1985)进行[43将4 mL 3天的指数生长培养物转移到90毫米的培养皿中，在28℃下与100 μL新鲜的隔夜培养物一起孵育根癌土壤杆菌pGV2260包含二进制矢量pH7WGF2。共培养48h后，将烟草细胞清洗后镀于含湿霉素(50 μg mL)的LS琼脂培养基上^－1)和卡本西林(250 μg mL^－1)．每隔3-4周，选择转化体并转移到新鲜培养基上继续选择。

荧光苯乙烯膜探针FM4-64 (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)作为17 mM的原始溶液保存在无菌水中，并在最终浓度为4.25 μM时用于标记液泡膜(液泡体)。5日龄BY-2细胞用FM4-64处理3 h，用培养基洗涤2次。

胞质钙的测定^{2 +}浓度

钙的测量^{2 +}根据Kurusu等人(2011)描述的方法进行动员[44］．简单地说，传代后5天表达apoaequorin的水稻细胞用1 μM腔肠嗪在25℃下孵育至少12 h。细胞悬液(250 μL)转移到直径1.1 cm的培养管中，置于光度计(Lumicounter 2500, Microtech Nition，千叶，日本)中。在光度计中，培养管顺时针和逆时针每3s旋转17转，搅拌细胞。经过15分钟的孵育使细胞稳定，Ca^{2 +}测定依赖于水马苷的发光，并表示为相对发光单位(rlu)。

Ca^{2 +}培养细胞摄取

传代后5 d的水稻细胞用于测定钙含量^{2 +}吸收。水稻细胞在Ca中培养^{2 +}在25°C条件下，游离介质至少3小时。细胞悬液(80 mg mL^－1)转移到含有0.1 mM氯化钙的培养基中₂孵育1小时左右^{2 +}吸收是通过添加开始的⁴⁵CaCl₂最终浓度为33 kBq/g。然后在25°C下搅拌细胞;分别于0、15、45分钟后取细胞1 mL⁴⁵CaCl₂．用5 mM氯化钙预浸泡的Whatman过滤器(GF/C)过滤细胞₂用5毫米氯化钙的冰冷溶液清洗5次₂，和2毫米LaCl_3.删除⁴⁵Ca^{2 +}从细胞壁。每个过滤器上保留的放射性按前面所述进行计数[45］．

ROS的测量

水稻细胞(cv。继代培养后5 d进行测定^•O₂^-和H₂O₂在细胞外培养基中。^•O₂^-在添加20 μM甲氧基化塞地纳荧光素类似物(MCLA(2-甲基-6-[p-methoxyphenyl) 3, 7-dihydroimidazo[1, 2 -α]pyrazin-3-one);Invitrogen)在相同的条件下使用发光计(Lumicounter 2500)测量[Ca^{2 +}］_cyt［46］．

监测H₂O₂产生于细胞外培养基，细胞(80 mg mL^－1)在含有0.5 mM氯化钙的5 mM MES缓冲液(pH 7.0)中洗涤和重悬₂， 0.5 mM K₂所以₄添加或不添加175 mM甘露醇(Kurusu et al. 2005)。将25 μl培养基与150 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)和25 μl 0.462 mM鲁米诺(50 mM Tris-HCl, pH 8.0)混合在96孔滴定板中。加入铁氰化钾(25 μL, 11.76 mM)₂O₂使用光度计(MicroLumat Plus LB96V, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)记录依赖于荧光的化学发光15 s。

统计分析

使用未配对的学生数据来确定统计学意义t测试;P< 0.05为显著性。

现地址:日本前桥市群马大学分子与细胞调控研究所细胞生物学实验室，群马371-8510。

BAPTA:

1,以- (2-aminophenoxy)乙烷N N N’N’-四乙酸

(Ca^{2 +}］_cyt：

胞质游离钙^{2 +}浓度

迪拜国际资本:

差分干涉对比

DPI:

二苯基碘鎓

EGTA:

乙烯glycol-bis - (2-aminoethylether)N N N’N’-四乙酸

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

格斯:

β葡萄糖醛酸酶

H₂O₂：

过氧化氢

MAMP:

微生物相关分子模式

MCLA:

2-methyl-6 - [p-methoxyphenyl) 3, 7-dihydroimidazo[1, 2 -α]pyrazin-3-one

^•O₂^-：

超氧阴离子自由基

媒介女士:

Murashige和Skoog medium

种族:

cDNA末端的快速扩增

rlu:

相对发光单位

RNAi：

RNA干扰

RT:

逆转录酶

ROS:

活性氧

假:

salicylhydroxamic酸

对照组:

苦味酸。

我们要感谢樱井康弘先生提供的技术援助。Hiroaki Shimada和Tadamasa Sasaki提供了有用的技术建议。三木大辅和岛本子RNAi质粒(pANDA载体)，和涩谷直人博士为礼物N-acethylchitoheptaose。

本工作部分由教育、文化、体育、科学技术省创新领域科学研究(21200067)资助TK，探索研究(21658118)资助KK，青年科学家(B)(21780041)资助TK，优先领域科学研究(21026009)资助HI，科学研究B(19370023)资助KK和(21370017)资助HI，以及日本科学技术厅的资助。通过目标驱动研发(AS221Z03504E)向TK提供适应性和无缝技术转移计划，并为CREST向HI和KK提供技术转移计划。

作者指出

从属关系

1. 东京理科大学应用生物科学系，2641山崎，野田，千叶县，278-8510，日本

   久鲁高光，西川大辅，山崎由光，后藤真子，滨田晴康，山中拓哉和久chitsu和之

2. 东京科学大学科学技术研究所(RIST)， 2641山崎，野田，千叶县，278-8510，日本

   Takamitsu Kurusu & Kazuyuki Kuchitsu

3. 东京学艺大学生物系，小金井，东京184-8501，日本

   中野雅孝，中川优子和饭田秀敏

4. 东京农业科技大学农业科学联合大学院，日本东京府初183-8509

   东Nakano

5. 东京都市医学科学研究所生物膜实验室，世田谷区，东京，156-8506，日本

   可以从轻Iida

6. 国立环境研究所环境生物学研究室，筑波，茨城，305-8506，日本

   Hikaru Saji

7. 理研植物科学中心，筑波，茨城县，305-0074，日本

   Kazuo Shinozaki

相应的作者

对应到滨Kuchitsu．

作者的贡献

TK, DN和YY进行了大部分的实验和数据分析。TK和KK设计了研究并撰写了手稿。DN、YY、MG参与共焦成像分析。MN、TY、KI对Ca^{2 +}酵母吸收实验。HH和HS参与了转基因系的构建和PCR分析。YN, KS, HI参与了研究的设计，并对手稿进行了批判性的修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Takamitsu Kurusu, Daisuke Nishikawa, Yukari Yamazaki对这项工作做出了同样的贡献。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。

转载及权限