核型变异是表达骨科和生态型分化的expressGrass

背景

核型可以提供有关分类关系，遗传畸变和物种的进化起源的信息。但是，差异化了切换的微小染色体（Panicum Virgatum.由于缺乏显著特征和多倍性，这种生物能源作物的标准核型的建立尚未完成。

结果

对一个二倍体个体(2N= 2X= 18)，建立染色体核型。荧光原位杂交(FISH)将5S和45S rDNA位点分别分配到7号染色体和2号染色体上。玉米CentC和本地柳枝稷的着丝粒重复序列(PviCentC)具有73%的同源性，表明在第3号染色体上存在强信号。然而，只有PviCentC探针标记了所有染色体的着丝粒。意外的PviCentC和5S rDNA杂交模式与这些重复在一个亚基因组中严重减少或完全缺失相一致。这些模式在四倍体和八倍体个体中保持。45S rDNA重复序列在二倍体、四倍体和八倍体个体中产生了预期数量的位点。柳枝稷高低生态型5S rDNA位点的差异为区分这些亚群提供了依据。

结论

总的来说，这些结果提供了SwitchGrass染色体的定量核型。鱼分析表明亚因素之间的遗传分歧，允许属于发散遗传池的交换植物的分类。此外，SwitchGrass的核型结构和细胞遗传学分析为未来的遗传和基因组研究提供了一种框架。

多倍体是整个基因组的可遗传复制，是植物多样化的一个关键特征，即使不是全部，也存在于大多数植物分类群中[1]．多倍体化可以导致物种形成或在一个物种内产生不同的生殖分离的细胞类型。一个古老的基因组加倍事件和随后的基因丢失已经塑造了所有草类物种的基因组[2]．虽然估计有30-80%的被子植物可能是多倍体[3.]，不同物种杂交产生的异源多倍体与单一物种内产生的同源多倍体的相对频率难以确定。掩盖多倍体进化起源的进化过程，如渐渗、缺失、协同进化和突变，可能会产生不确定性。随着时间的推移，基因组可能会重复杂交，基因组的种间杂交或紧密种间杂交可能产生类似的结果。来自独立标记集(如叶绿体和核标记)的不一致的树状拓扑可以提示网状关系的存在，但这些不是决定性的[4.]．

标题亚属分类单元的种间关系panicum.Sensu Sticho（S.），包括约100 c4草地，包括Panicum Virgatum.L.（SwitchGrass），尚未阐明并且可能代表复杂情况[5.]．由于柳枝稷在美国和其他地方被视为一种有前途的可再生能源生产原料，这些关系对于了解可能在育种计划中有用的种质的广度具有重要意义。该植物地理范围广，水分和养分利用效率高，常年生长习性好，是理想的生物能源作物[6.-8.]．该物种包含多种细胞型，其基本染色体数为9 [9.那10]，倍性水平范围从二倍体(2x)到十二倍体(12x) [11-14]．柳枝稷作为一种多倍体物种，具有两个基本的亚基因组，它们在遗传上存在分歧，但保持完全或接近完全的二体遗传[15]．从细胞学和地理上区分两种不同的生态型[16]．低地加入占据了物种范围的南部范围，主要是四倍体，而隆水载体通常是四倍体或八倍体，并主宰北纬[17]．还描述了广泛的非整倍倍性，特别是在八倍体的群体内，但这些可能存在于不同水平的所有群体中[18]．

虽然柳枝稷细胞型间的人工杂交在很大程度上是不成功的[19那20.]的研究中，有关细胞型之间、高地和低地生态型之间以及近缘种之间的历史杂交仍存在一些问题panicum.子根属。这些物种可以代表一个常见的基因库，其经历了一次被隔离群体的“二次接触”期间经历重复的杂交[21]．最近对柳枝总枝的分析表明，以南方大平原和墨西哥湾东海岸为代表的低地柳枝总枝有两个不同的遗传多样性中心，而高地柳枝总枝在遗传上是一个广泛分布的四倍体和两个八倍体血统[22]．利用叶绿体序列多态性，分子时钟估计表明，低地和高地的入侵早在130万年前就发生了分化，但在最近的冰期周期中可能发生过几次分化[23那24]．

鉴于这些不确定性，表征基因组结构的独立方法可用于有效的评估和利用种质资源。使用原位杂交技术的细胞遗传学分析已被证明在解决多倍体中的基因组体构造中是非常有用的，并且是染色体核心型的重要工具[25]．在具有小和高度相似的染色体的多倍植物中，使用标记的总基因组DNA，重复序列或单拷贝探针，通过原位杂交（鱼）的荧光辅助核型。特别地，在RDNA基因座（45s和5S rdNA）中发现的变异有时可用于区分亚因素或区分物种的生态型[26那27]．在多倍体化期间或之后的染色体减少，破裂或融合可以导致这些串联重复序列的增益或丧失。例如，在核心区中，RDNA基因座的位置和顺序在相关的物种中有广泛的不同[28]．使用重复探针的FISH分析可以进一步实现染色体鉴定，并已成功应用于玉米[29]， 白饭 [30.]， 甘蔗 [31,大豆32和松树[33]．

在柳枝稷等复杂的多倍体生物中，染色体数目减少的基因型的发展将被证明对育种和遗传研究有用[34]．单倍体植物，无论是源自二倍体还是多倍体，都有一半整倍体形式的染色体数目因此，由柳枝稷四倍体衍生而来的“单倍体”植株将有2个9 (2N= 2X= 18)。由于真正的单倍体数目为9，术语“二倍体”被用来描述含有两套同源染色体的雄性柳枝稷品系[35]以及含有两套非配对同源染色体的生殖系[36]．“二倍体”的术语和这种株系的用途以前已经描述过马铃薯、大麦、小麦和其他一些物种[37-39]．

柳枝稷早期的细胞学研究主要集中在染色体总数上，而不是染色体的个体形态和分子结构[40]．我们这里的目的是描述数量核型P.Virgatum.L.为了简化分析，我们使用了Dihaploid线（2N= 2X= 18)由低地四倍体个体通过雌核发生而产生的[36]．术语“二倍体”是用来表示该系的多倍体起源及其亚基因组的同源构成。在这里，我们建立了一个标准的参考核型，以识别个别柳枝属染色体的可见特征，并允许其独特的区分。我们证明了与rDNA和着丝粒重复相关的加性和非加性位点的存在，表明了亚基因组的分歧。我们也记录了山地和低地基因型之间的核型差异。

染色体测量数据

根尖南瓜制剂的体细胞染色体计数证实了2N = 36 metaphase chromosomes in the tetraploid cultivar Kanlow (Figure1a），这与已发表的数据同意[14那41]．ALB280的染色体数目为2N = 18 based on data from more than 50 metaphase plate preparations (Figure1b）。从ALB280进行中期蔓延的图像分析（图1b）进行以生产Expertgrass核型。允许配对染色体和基数的数字测量N= 9，从最长到最短(图2a，b）。表中提出了十种完整和未变形染色体蔓延的形态学数据1表明，切换染色体较小至长度的中等，范围为2.05±0.16μm至4.10±0.25μm。通过鱼分析（下面的数据）鉴定焦化剂允许测量染色体臂和臂比的计算（R.）.基于Levan等人描述的参数，将所有染色体分类为偏心（M）。[42]．

冷凝模式

由于染色体长度上的凝结模式(CP)的变化，染色体染色不均匀。这种独特的CP，特别是在有丝分裂前期，被用作诊断测量染色体鉴定。CHIAS IV软件[43]利用这种不均匀的染色图案，用于为每一个九个SwitchGrass染色体产生独特的CP轮廓（图2c).用于生成表中形态数据的相同的10个染色体扩散图像1采用CHIAS IV软件进行分析。同源染色体在每一次前期传播中配对，然后与所有10次传播中的同源染色体平均。基于染色体长度和CP得到的表意图如图所示2c。允许不同的灰度图像特征的柳枝稷染色体大等特性的基础上,凝聚区域在2号染色体的长臂,间质收缩1号染色体上的双手,和巨大的白色区域表明常染色质的染色体区域5和8(图2C）。连同长度和臂比数据，CP型材允许每种染色体与核型中的所有其他染色体区分开。

着丝粒的本地化

从玉米Centromere重复序列Cencc开发的质粒探针[44] (GenBank AF078922.1)用于柳枝稷染色体FISH检测。在二倍体ALB280的有丝分裂染色体传播中只观察到一个CentC信号(2N= 2X = 18) (Figure3.一种）。低地四倍体品种Alamo鱼类分析（2N= 4X = 36), two CentC signals were evident (Figure3.b).此外，在陆地八倍体品种Grenville (2N= 8X= 72(图)3.C）。Alb280的染色体长度和臂比数据用于确定中心探针与碱性核型的染色体杂交（图4.）.

使用玉米Centc和稻米与稻米与稻米序列的SheckGrass 454序列数据的BLAST分析导致潜在的CENTROMERE特异性重复序列中发现的潜在浓度的基因组，平均值与玉米中心（AF078922.1）相同的73％。使用相应的共有序列设计的引物用于扩增并标记用于鱼类分析的切换曲率特异性Centromere重复序列。标记的SwitchGrass Centromere探针（PVICENTC）在ALB280的所有18染色体上产生了荧光信号（图3.d).另外，ALB280染色体中有一条染色体的着丝粒FISH信号明显比其他染色体亮。这种PviCentC信号模式也出现在所有四倍体细胞型检测中，所有的着丝粒都被标记，两条染色体显示出非常高的荧光水平(图)3.e cv。Kanlow)。八倍体细胞型保持了这种模式，在特定的染色体上显示了四种强烈的FISH信号，而其他所有的细胞型在着丝粒上都包含相同强度的信号(图)3.F，CV。洞穴岩石）。长度，臂比和缩合图案分析将高荧光染色体鉴定为染色体3，其与玉米中心探针一致，从中衍生PVICENTC。

45s rdna本地化

使用小麦PTA71质粒探针用鱼检测45s rdNA对有丝分裂中期染色体的染色体染色体[45]．这些结果表明，在ALB280染色体扩散中检测到一对45S rDNA信号，提示基本核型(n = 9)有一条含有45S rDNA序列的染色体(图)3.g).当对四倍体低地个体AP13进行探测时，出现两对45S rDNA信号(图)3.H）。每个碱基基因组（n = 9）的这种图案的这种图案也悬浮在来自八倍体积种子CADDO的个体中，其中八个45s rDNA信号是可见的（图3.一世）。多种差异中的形态和鱼染色模式分析表明，在染色体2的短臂的末端附近找到了45S rdNA信号（图4.）.

5 s rDNA本地化

利用单倍体柳枝稷(ALB280)的454个序列数据，对高粱、水稻、玉米和小麦等几种禾草的5S rDNA序列进行BLAST检测。得到的序列被用来扩增和荧光标记柳枝稷的314个碱基对的同源5S rDNA序列。这些5S rDNA FISH探针与二倍体ALB280的一条染色体和低地四倍体品种Kanlow的两条染色体杂交(图)3.分别为J和k)。ALB280染色体定量测量数据将5S rDNA信号定位于7号染色体间质区(图)4.）.在Kanlow染色体的鱼形象中，一个5S rdNA信号强，弱一个5s rdna信号（图3.k).在陆地八倍体生态型中，5S rDNA的FISH信号的模式与根据二倍体和四倍体数据预测的模式不同。陆地八倍体品种Caddo的杂交位点不是2个强信号和2个弱信号，而是4个强信号和4个弱信号3.l).这表明在5S rDNA位点上，高原和低地生态型存在独特的差异。

5S RDNA基因座的生态型变异

为了进一步研究5S rdna基因座的SheckGrass eCotypes之间的差异，通过鱼分析高兰四倍体品种Dacotah和夏季，与低地四倍体Kanlow和Alamo相比。两个强5s rdna信号和两个弱信号（图5.）在隆起的四倍体中观察到，这与四个强度和四个弱5S rDNA信号中的Upland octokoids中所见的模式一致（图3.l).相比之下，低地四倍体Kanlow和Alamo只包含一个强的和一个弱的5S rDNA信号(图5.）.FISH数据也支持这一结论，即二倍体的ALB280保留了来自其四倍体祖先的一个5S rDNA位点[36]．

准确的核型可以包含总长度和臂长度比等物理测量，但还可以包括诸如异形旋钮的地标[46[染色质缩合的模式[43，以及通过FISH可视化的分子特征[47]．染色体鉴定对于细胞学分析，以及基因组学、分类学和多倍体进化的后续研究至关重要，能够理解可见地标和遗传或物理地图特征之间的关系[48]．为此，柳枝稷基本核型的构建有望促进基因组分析。柳枝稷的体细胞中期染色体很小，这可能在早期的研究中对细胞学特征的检查有限[11那13那49]．利用复杂的成像和分子技术，我们现在能够提出第一种综合的柳枝稷核型，定量区分这种生物能源作物的9个碱基染色体。

使用SwitchGrass（ALB280）的Dihaploid系列显着简化了核型化过程。acetocarmine和dapi染色的染色体散布允许在Alb280中的同源染色体的视觉配对，并基于总和和相对长度以及臂比产生核型。在我们的实验中，单一的交换机根尖端制剂通常产生20个或更多个分割细胞（预脱酶）。染色体差异通常导致核苷酸术后核的高频率。Pro-Metaphase染色体沿其长度展示了特征缩合图案（CP），对应于染色体的紧凑性，其用于产生定量IFIOMAGRA [50]．这种方法对细胞学分析也有用芸苔属植物种类，甘蔗和水稻[51-53]．结合物理测量数据，CP数据允许我们明确识别SwitchGrass的小型核心染色体。

虽然形态学和CP数据表明，在二倍体系ALB280 (2N= 2X = 18), FISH data presented here indicate that the subgenomes have different repetitive DNA content at PviCentC and 5S rDNA loci. This finding is in general agreement with the highly differentiated genomes indicated by linkage map data in which tetraploid ecotypes demonstrate fewer than expected markers mapping across subgenomes, and complete or near complete disomic inheritance [15]．这也与在二倍体品系减数分裂终变期观察到的18个非配对单价物一致[36]．这些基因位点上的FISH信号数据可能指向柳枝稷基因组的异源多倍体进化。然而，这些数据也与单一物种中整个基因组复制后基因含量的自然丢失(同源多倍性)相一致。为了更好地理解柳枝稷多倍体的起源，对柳枝稷进行了进一步的系统发育分析panicum.(s.s.)亚属和/或基因组原位杂交(GISH)技术应采用[1那27那54-56]．

在一个简单的添加剂模型下，5S rdNA基因座的鱼信号和中心基因座预计将分别存在于Dihaploid，四倍体和八倍薄层线中的2,4和8份中。令人惊讶的是，在Dihaploid Alb280中只观察到这些基因座的一种鱼信号。此外，对均亚胍基的所有染色体杂交的切换紫色特异性Centromere探针，杂交，但在单个亚基因组（与玉米Centc探针相同的轨迹相同的轨迹）上呈现更强的鱼信号。这种信号强度的差异，特别是对于通用Centromere探针pvicentc，表明该重复的更大的拷贝数存在于一个亚基因组中的染色体中，而不是在所有其他染色体中。或者，或结合，染色体3的染色体3的同源性比所有其他标记的焦体在所有其他标记的焦粒子中高得多。我们在RDNA和Centromeric Loci观察到的变异也可能是交联习惯的结果和SwitchGrass的自我不相容20.]．在外围的属于属的繁殖秘书长，记录了同源染色体之间的高水平重复DNA多态性[57]．其他近缘繁殖的物种Lolium和Lolium-Festuca.rdna loci的复杂展示变异[58那59]，表明SwitchGrass中的嗜血度可能由过交叉引起。还有助于非添加性鱼信号数据可以是SwitchGrass非植物的高频率，特别是在八伏糖细胞型中的频率[18那40]，这可能导致大规模的遗传变化和父母基因组失衡。

在我们对45S rDNA位点的分析中，端粒FISH信号对在倍性序列上显示出一种规则的加性模式。在四倍体品种中，我们的数据与Costich等的数据一致[18]分析（Upland和Lowland）的所有四倍体展示了两对端粒体45s rdNA信号。然而，在八倍体栽培品种中，Costich等人。[18[45s RDNA信号的大小，数量和位置的大量变化。在我们对八倍增CV的分析中看到45s RDNA信号强度的变化。CADDO（见图3.i)可能表明rDNA重复变异和/或探针杂交亲和力的差异。只有一个高地八倍体(cv。Caddo)在本研究中使用45S rDNA进行分析，我们的结果可能表明柳枝稷八倍体的多种染色体构成之一。总的来说，四倍体和八倍体个体的FISH分析支持rDNA和着丝粒序列的消除，并表明亚基因组分化模式广泛保持。

我们的数据还显示了5S rDNA位点的独特生态型差异。在柳枝稷中，不同种类的柳枝稷在高地和低地四倍体(以及高地四倍体和高地八倍体)之间的FISH信号模式差异提供了不同的特征。我们推测这些rDNA位点的变异与柳枝稷生态型间的表型和地理分布差异有关。在选用物种、数量上的多态性、染色体位置和rDNA位点的重复长度已经揭示了物种特异性和亚基因组特异性的FISH模式[60]．作者表明，在过程中可能发生了特定的逆转，RDNA扩增和基因座转置选用进化。这种情况对于SwitchGrass Handand和Lowland Ecotypes的分歧也可能是真的。分类品种的SwitchGrass从野外勉强移除，并且迅速发展的RDNA基因座可能仍然发生变化。在低地四倍体（2信号）和高度四倍体（4个信号）之间的5S rDNA基因座的添加剂图案可以指示染色体重排和rDNA变化，最终导致两种生态型之间的栖息地适应性差异。此外，从uppland四倍体到Upland Octoploid的5S rDNA基因座的保守倍增模式进一步支持在不同细胞型上维持生态型分歧。

ExpertGrass Ecotypes和/或细胞型之间存在基因流量对切换改善的特定基因库的开发和使用具有后果。因此，了解染色体建筑和倍增性关系对于品种发展至关重要。这里呈现的细胞遗传学数据可用于根据生态型分类Expergrass植物，并最终有助于识别和分离区域适应品种[61那62]．通过性状鉴定和育种改良柳枝稷以获得显著的杂种优势，也保证了独立基因库的维护[63那64]．最近对几种推测的高地和低地柳枝稷的分析发现了生态型之间的自然杂交以及基因流动的证据[22那23]．结果证明了杂交种群中的细胞型和表型的混合物，表明基因流动的历史悠久。此外，遗传标记数据表明，基因流是双向的，从高地到低地和来自低地到Upland [23]．对整个柳枝稷染色体的定量了解将有助于区分杂交基因型和在定向育种计划中跟踪基因组来源。使用FISH和GISH可以识别易位和/或新染色体来源的渐渗[25那65]，但也可用于识别有助于多倍体物种(如柳枝稷)进化的祖先基因组[27那66]．

物种核型的发展，以及对单个染色体的明确识别，对于遗传和物理地图数据的整合也是至关重要的。利用SSR和STS标记构建了柳枝稷的遗传图谱[15]．将这些基因标记杂交到柳枝草染色体将导致连锁群的最终分配。利用BAC无性系作为探针进行单拷贝和低拷贝序列的荧光检测在许多物种中都被证明是非常成功的，包括水稻[67]，玉米[68，和高粱[69]．柳枝植物BAC文库最近已被开发出来，可通过BAC- fish探针用于连接图和物理图的集成。BAC序列还可用于染色体组分的流动排序，用于物理基因定位和染色体特异性文库的构建[70]．在这种情况下，FISH技术将继续是理解柳枝稷基因组结构的有价值的工具。

柳枝稷染色体相对较小且缺乏明显的特征，在过去可能阻碍了详细的核型分析[11那40]．通过使用复杂的分子，细胞学和成像技术，我们描述了一种定量的核型P.Virgatum.L.区分单个染色体。我们的数据支持交换草中两种亚因素的遗传分歧，为研究这种生物能量作物中多倍体的演变提供了基础。我们还展示了普满和低地生态型之间的核型差异，以有助于识别和维护未来育种策略的不同基因库。需要对切换染色体的额外细胞遗传学分析是必要的，但是本文所呈现的数据提供了一种定量基础，基因组和遗传研究可以继续前进。这种核型将使某种血管液以及外星替代品以及其他人用于古典遗传分析和引入新的变异。

植物材料及生长条件

二倍体柳枝稷(2N= 2X = 18) were identified from among the progeny of a biparental cross between two lowland tetraploid cultivars, Kanlow and Alamo, as previously described [36]．在细胞学和FISH分析中使用的四倍体和八倍体品种要么来自美国东北林肯的同事，要么来自美国国家遗传资源计划(NGRP, Beltsville, MD)。本研究中使用的品种材料在附加文件中描述1表S1。所有生态型种子在4°C下分层3周，在湿滤纸上发芽后移栽至温室。植物在温室中维持在72°F，补充光照(每天16小时)，根据需要浇水，每周用一般用途的20-20-20肥料施肥。

有丝分裂染色体准备

有丝分裂染色体扩散是根据Zhang和Friebe的研究方案产生的[71]有一些修改。从温室生长的植物切除积极生长的根尖，在冰冷的水中预处理18-24小时，然后在4℃下固定在3：1的乙醇和冰醋酸中，过夜。立即用于将载玻片制备或在-20℃下储存在-20℃的固定剂中使用的根材料长达几个月。对于滑动制备，将根尖（0.5-1.0cm）在0.01M柠檬酸盐缓冲液中洗涤两次5分钟，并以50mg / ml Onozuka R-10纤维素酶和30mg / ml的植物（Phytotechnology Labs）的酶混合物消化Shawnee Mission，KS）在37°C。消化时间从30分钟变化到2.5小时，取决于根尖的厚度和瘫痪程度。然后将软化的根尖在0.01μm柠檬酸盐缓冲液中洗涤5分钟并转移到载玻片中。镊子和手术刀用于小心地切除含有积极分割有丝分裂细胞的根帽后面的白色组织。除去所有其他根部组织，将剩余的细胞浸渍在1％的1％acetocarmine污渍中。将盖玻片放置在染色的组织上，甚至施加压力以产生有丝分裂染色体蔓延。 Slides were viewed under phase-contrast microscopy to identify spreads optimal for use in FISH analysis.

探测DNA标记和荧​​光原位杂交（鱼）

克隆pTa71从小麦L. [45]用于鉴定45S rDNA (18s -5.8 S- 25s rRNA)基因序列。CentC探针序列[44]是由扎克·坎德博士慷慨地提供的质粒克隆，从PCR产物Zea Mays.脱氧核糖核酸。使用来自玉米，水稻和高粱的5S RDNA序列设计了5S rdNA探针，以从CV读取的SwitchGrass 454序列数据库中识别类似序列。阿拉莫个人使用BLASTN。引物（FP 5'-AGCACGCTTACGTTTCGAGTTCTGA-3'; RP 5'-AGAATGGCTAGATGCGCGGAAT-3'）从得到的BLASTN命中和最高的E值中开发。使用使用BLASTN鉴定为类似于使用BLASTN的玉米Centc和稻米与稻米与米中序列设计的PCR引物，从SwitchGrass GDNA扩增了PVICENTC探针。72]．使用爆炸点击的分析用于从现有的SheckGrass原始基因组序列数据中推断PVICENTC序列。得到的共识序列用于为切换特异性焦化重复探针（FP 5'-Catgcccaatccacttcttttagc-3'; RP 5'-caacttacggggaAgcacaaAgtgg-3'）设计引物。使用Nick翻译或PCR（Nick Translation Kit; PCR DIG探测合成试剂盒，罗氏应用Sciences，Indianapolis，In）用汤诺昔单蛋白-11-DUTP或生物素-16-DUTP标记为Digoxigenin-11-DUTP或BIOTIN-16-DUTP。制造商说明。如前所述进行杂交和后杂交洗涤程序[73]．染色体用4′，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色。

显微镜和图像分析

数字图像记录使用奥林巴斯BX51荧光显微镜(Olympus Corporation, Center Valley, PA)， DP70 CCD(电荷耦合器件)相机和合适的单色滤光片组(Chroma Technology, Rockingham, VT)。使用Linux下的GIMP 2.6 (GNU Image Manipulation Program)对图像进行处理。染色体长度测量和臂比采用GIMP 2.6手动确定，并在CHIAS IV软件(染色体图像分析系统IV)中进行自动测量确认[43]．染色体凝聚模式的分析由CHIAS IV系统进行，使用宏程序编写的Seiji Kato, Nobuko Ohmido和Kiichi Fukui。在GIMP 2.6中对FISH数据进行分析，将探针信号图像叠加在相应的DAPI染色图像上。调整顶部(FISH信号)层的透明度，以显示信号和染色体对齐。

核型分析

在Dihaploid Ecotype Alb280的10个不置位和非重叠染色体上进行核型分析（2N= 2X= 18)。根据总长度、臂比和缩合模式对乙酰胭脂胺和/或DAPI染色的扩散区同源染色体进行配对。使用GIMP 2.6和CHIAS IV成像软件对每个染色体进行物理长度测量，并将像素长度转换为微米。统计T.进行了测试，以确认同源对之间没有显著差异。从着丝粒到每条染色体的顶端测量染色体臂，并根据臂比(r =长臂长度/短臂长度)确定中心性类，如前面所述[42]．在可能的情况下，使用FISH信号数据对同源染色体进行配对，并对所有10个有丝分裂扩散的核型中每条染色体的测量数据进行平均。染色体从长到短依次编号为1-9，并与FISH信号数据配对以确定核型(N= 9)。此外，用CHIAS IV软件分析了所有10个有丝分裂扩散的冷凝模式(CP)，以帮助区分染色体。

SwitchGrass的Dihaploid线条

利用Kanlow和Alamo这两个四倍体品种(2n = 4X = 36)控制杂交后代中的一个二倍体个体(2n = 2X = 18)，对柳枝总枝的9号染色体进行了核型分析。36]．该二倍体株系(ALB280)最初通过杂合度降低与亲本株系区分开来，随后通过流式细胞仪估算C值进行确认。该分析表明，Alamo 280的2c值为1.48，约为四倍体F1参考个体(ALB881)和Alamo父本(ALBA4)的一半，其2c值分别为2.61和2.75 pg [36]．

我们感谢Denise Costich和Grace Chan对稿件的关键评论。我们还感谢Bernd Friebe，Rachael Wang，以及丹尼斯·昂首阔的技术咨询。美国农业部，农业研究服务，是一个平等机会/肯定行动雇主，所有机构服务都可以在不受歧视的情况下提供。提及本手稿中的商业产品和组织仅提供特定信息。它不构成USDA-ARS在其他产品和组织上的认可。这项工作由美国农业部，农业研究服务（USDA-ARS）当前研究信息系统（CRIS）5325-21000-017，USDA-ARS CRIS 5440-21000-028-00，并通过联合USDA /科学进食基因组学能源办公室授予DE-AI02-09ER64829。资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

从属关系

1. 美国农业部农业研究服务处西部区域研究中心基因组学和基因发现研究组，800布坎南街，奥尔巴尼，加利福尼亚州，94710

   休·A·扬和克里斯蒂安·M·托拜厄斯

2. 美国农业部中东部区域生物质中心，美国东北部林肯市UNL东校区Keim Hall 137, 68583

   Gautam Sarath

通讯作者

对应于克里斯蒂安M托比亚斯。

利益争夺

作者宣布没有任何竞争的利益。

作者的贡献

CT、GS和HY构思设计了本研究。GS和CT为FISH分子探针的设计提供了关键的植物和分子材料，并进行了序列分析。HY进行了实验，并对实验数据进行了分析。HY在CT和GS的帮助下撰写了这份手稿。所有作者阅读并批准最终稿件。

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