拟南芥apy酶AtAPY1定位于高尔基体而不是细胞外空间gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

两种高度相似的拟南芥apy酶AtAPY1和AtAPY2先前被证明参与植物的生长和发育，显然是通过调节细胞外ATP信号。研究了AtAPY1的亚细胞定位以证实其细胞外功能。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

转基因拟南芥系表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba融合到SNAP-(O)gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba采用-烷基鸟嘌呤- dna烷基转移酶(dna alkyltransferase)标记进行间接免疫荧光检测，在细胞点状结构中检测到AtAPY1。在稳定过表达的幼苗中发现了相同的信号模式gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba通过间接免疫荧光和实时成像。为了确定atapy1阳性结构的性质，gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba用FM4-64 (N-(3-三乙基氨基丙基)-4-(对二乙基氨基苯基-六三烯基)-二溴吡啶)标记染色处理表达苗，并与表达该基因的转基因株系杂交gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba高尔基体标记gydF4y2BaRab E1dgydF4y2Ba．FM4-64和Rab E1d均未与AtAPY1共定位。然而，转基因拟南芥系表达gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba或者是荧光蛋白标记的高尔基标记gydF4y2BaMembrin 12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba植物合成素gydF4y2Ba或gydF4y2Ba高尔基转运1蛋白同源物gydF4y2Ba显示co-localization。通过免疫金标记AtAPY1-GFP确认高尔基体定位。使用抗SNAP和GFP抗体、AtAPY1-GFP的实时成像和AtAPY1-GFP的免疫金标进行间接免疫荧光检测，未发现细胞外AtAPY1的存在。AtAPY1-GFP活性测定显示GDP、UDP和IDP是底物，但ATP和ADP都不是底物。为了确定AtAPY1是可溶性蛋白还是膜蛋白，分离微粒体膜并用各种增溶剂处理。只有SDS和尿素(非碱性或高盐条件)能够从微粒体膜释放AtAPY1蛋白。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

AtAPY1是一种完整的高尔基蛋白，具有高尔基酶特有的底物特异性。因此，它不可能像以前认为的那样调节细胞外核苷酸信号。我们认为AtAPY1可能通过调节高尔基体中的糖基化反应来发挥其生长和发育作用。gydF4y2Ba

术语“apyrase”(gydF4y2Ba一个gydF4y2BadenosinegydF4y2BapyrgydF4y2BaophosphatgydF4y2Ba日月光半导体gydF4y2Ba)是由Otto Meyerhof于1945年创造的，它是一种酶，可以切割ATP和ADP的磷酸酐键[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。几十年后，另一个名称“ntpase”(gydF4y2BangydF4y2BaucleosidegydF4y2BatgydF4y2Ba国际扶轮gydF4y2BapgydF4y2BahosphategydF4y2BadgydF4y2BaiphosphohydrolgydF4y2Ba日月光半导体gydF4y2Ba)被正式提出[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]因为apyrase可以水解大量的核苷三磷酸和二磷酸(参见[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba])。许多原核和真核生物中都发现了酶(参见[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba])，它们都共享高度保守的区域[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在植物中，假设的功能多种多样，包括结瘤[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，对外源性药物的抗性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，磷酸盐清除[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]和增长[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。每个真核生物基因组筛选的存在的乙酰酶基因持有至少两个候选。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，共有7个apyrase候选基因存在。我们的研究重点是两个拟南芥apyrase基因的功能gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba，其对应的蛋白质有87%的氨基酸相同。通过T-DNA(转移DNA)插入敲除两个apyrase基因中的一个，从而产生一个gydF4y2Baapy1gydF4y2Ba或gydF4y2Baapy2gydF4y2Ba单基因敲除(SKO)与野生型(WT)相比，表型无明显差异[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，但同时击倒两者gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba抑制花粉萌发[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba对幼苗是致命的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。过度表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba或gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba导致下胚轴和花粉管更旺盛的生长[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。然而，通过RNA干扰靶向抑制表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba在gydF4y2Baapy2gydF4y2BaSKO背景，抑制整个植物的生长，尤其是下胚轴和根的生长[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。一些证据表明，这些生长效应是由调节细胞外ATP (eATP)信号的AtAPY1和AtAPY2介导的[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]:在生长的花粉管细胞外基质(ECM)中测量的Apyrase活性可以通过添加化学抑制剂或针对AtAPY1的多克隆抗体来降低。活性的降低同时提高了eATP水平并降低了花粉管的生长[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。这些发现解释了当表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba并提供了第一个直接证据，证明酶在植物中作为细胞外核苷酸(如eATP)的调节剂起作用。在动物领域，外链酶和[eATP]之间的直接联系已经被证明[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。类似地，已知eATP在动物中作为信号分子(参见[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba])，直到在过去的十年中才在植物中被认识到这一点(参见[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

本研究的目的是通过AtAPY1和AtAPY2在质膜或外质体上的定位来确认两种拟南芥apy酶的细胞外功能。自gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba在挽救双敲除apyrase (DKO)花粉萌发的能力上显示出功能冗余[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]和DKO突变体的幼苗活力[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，这两种酶可能存在重叠的亚细胞定位。因此，本研究只关注一种氨基酶的定位。gydF4y2Ba

获得了表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba融合到两个标签序列中的任意一个，gydF4y2Ba提前gydF4y2Ba或gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba．为了鉴定atapy1阳性区室，细胞器特异性标记蛋白共表达并使用免疫金标记。出乎意料的是，酰基酶不是定位在质膜或细胞壁上，而是定位在高尔基体上。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

对于所有的实验，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba以Wassilewskija生态型为WT对照。在无菌条件下，在琼脂平板(4.3 gL)上培养1周gydF4y2Ba^1gydF4y2BaMurashige Skoog (MS)盐，0.5 g LgydF4y2Ba^1gydF4y2BaMES, pH 5.7(用KOH调节)，1% (w/v)蔗糖，0.8% (w/v)琼脂)或液体培养基(见上文，不含琼脂)，摇匀(80 rpm)。在琼脂板上放置一周后，将幼苗转移到土壤(Einheitserde, type P, Pätzer Inc.， sinnal - jossa, Germany)中，在24°C、100 μmol光子m的光周期下生长16 hgydF4y2Ba^{－ ２gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

淀粉酶突变体的基因型背景和术语gydF4y2Ba

术语SKO是指基因的零等位基因纯合存在gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba基因(=gydF4y2Baapy1 / apy1gydF4y2Ba)或gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba基因(=gydF4y2Baapy2 / apy2gydF4y2Ba)。T-DNA无效突变gydF4y2Baapy1gydF4y2Ba和gydF4y2Baapy2gydF4y2Ba参考突变等位基因gydF4y2Baapy1-1gydF4y2Ba和gydF4y2Baapy2-1gydF4y2Ba，如Steinebrunner等人所述。[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。符号“+”表示突变等位基因的WT对应物。产生两种apyrase DKO突变体:DKO- snap (=gydF4y2Baapy1 / apy1;apy2 / apy2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba;gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba)和DKO-GFP (=gydF4y2Baapy1 / apy1;apy2 / apy2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba)。两种类型的DKO突变体都携带gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba在基因的控制下gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba启动子。构造的细节gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba发表于[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba激振器花粉启动子区向内KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道基因在花粉和花粉管中的特异表达[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba-互补型氨基酶DKO突变体(= DKO- snap)gydF4y2Ba

的开放阅读框(ORF)gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba融合到SNAP-tag序列，在原生控制下克隆gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba启动子区(nt−10 ~−1959;−1对应于腺嘌呤上游的第一个核苷酸gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba启动密码子)与网关技术(Invitrogen)。的gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba序列显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．对于snap标签，停止密码子从gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba生成c端与标签的融合。载体pSNAP-tag(m) (New England Biolabs)作为PCR模板gydF4y2Ba提前gydF4y2Ba标签序列。扩增引物对产生531 bp的产物，包含以下内容gydF4y2Ba提前gydF4y2Ba-特异性序列:5 ' -GACTGCGAAATGAAGCGCA-3 ' (SNAPlokattB3F;5 ' -TTAAGGCTTGCCCAGTCTGTG-3 ' (SNAPlokattB2R;反向)。反向引物引入终止密码子。将各自的PCR产物与匹配的pDONR载体(Invitrogen)重组，生成三个DNA元件的每一个进入克隆。通过引物序列将所需的重组位点引入PCR产物中。将三个入口克隆与二进制目标向量pGWB501 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba来形成最后的结构gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba．通过测序确定了进入克隆和表达克隆的序列。的gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba应变GV3101 [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]用表达克隆转化，然后用于转化半合子的apyrase突变体gydF4y2Baapy1gydF4y2Ba突变(=gydF4y2Ba+ / apy1gydF4y2Ba)，纯合子为gydF4y2Baapy2gydF4y2Ba突变(=gydF4y2Baapy2 / apy2gydF4y2Ba;SKO)，并包含该构造gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba．用花浸渍法转化植株[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。转基因系(T1代)在含50 μg mL潮霉素的琼脂板上生长gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)、卵黄磷脂(PPT) (10 μ mLgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba卡那霉素(30 μg mL)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。选择潮霉素的存在gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba， PPT供在场者使用gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba卡那霉素的存在gydF4y2Baapy1gydF4y2Ba或gydF4y2Baapy2。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba-互补型脲酶DKO突变体(= DKO- gfp)gydF4y2Ba

克隆gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba结构的详细描述见[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。的ORFgydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba经PCR扩增无终止密码子，克隆至pQE-30载体(Qiagen)。为了放大gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2BacDNA, pBIN mGFP5-ER [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba作为模板。PCR产物在框架中克隆gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba该序列已经存在于pQE-30中，以使GFP与AtAPY1的c端进行翻译融合。得到的共轭函数gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba将ORF扩增并亚克隆到TOPO pCR2.1载体(Invitrogen)中。的gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2BacDNA通过gydF4y2Ba生态gydF4y2BaRI酶切并克隆到二进制载体pLBJ21中[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba序列可作为附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．转基因株系表达gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba-tag可从拟南芥资源中心(库存号CS9114)获得。gydF4y2Ba

利用含有重组结构物的农杆菌，用花浸渍法对WT Wassilewskija植株进行了转化[j]。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。在含有卡那霉素(30 μg mL)的琼脂板上选择T1代转化子gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。对于基因互补实验，纯合子gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba与转基因系杂交gydF4y2Baapy1gydF4y2BaSKO为半合子植物gydF4y2Baapy2gydF4y2Ba突变和携带gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2BacDNA在gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba启动子(=gydF4y2Baapy1 / apy1;+ / apy2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba)。用PCR方法对卡那霉素耐药后代进行基因分型。gydF4y2BaApy1gydF4y2BaSKO植物含有gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba构造(=gydF4y2Baapy1 / apy1;+ / +;35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba)被激怒了gydF4y2Baapy2gydF4y2BaSKO为半合子植物gydF4y2Baapy1gydF4y2Ba突变与表达gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba在…的控制之下gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba启动子(=gydF4y2Ba+ / apy1;apy2 / apy2;美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba)。选择卡那霉素组和PPT组的后代。gydF4y2Ba

补体脲酶DKO突变体的筛选gydF4y2Ba

为了筛选互补的apyrase DKO-SNAP和DKO-GFP突变体，从候选植物中提取基因组DNA，详见其他地方[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。用于检测gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba，gydF4y2Baapy1, apy2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba，所使用的引物组合如[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，相反的除外gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba-特异性引物改为A1I1R (5 ' - gcgagctagaaataccc -3 ')，得到1 kb的PCR产物。的存在gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba结构被确认使用gydF4y2Ba提前gydF4y2Ba特异性引物SNAPlokattB2R和gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba-特异性引物A1E9F (5 ' -CCACTAGGAAGCGCAATAGA-3 ')位于外显子9。的gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba构建体使用gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba正向引物A1E9F和反向引物位于gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba序列(GFP_rev 5 ' -TGTATAGTTCATCCATGCCATG-3 ')，得到0.7 kb的PCR产物。gydF4y2Ba

共表达转基因系的产生gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba,要么gydF4y2BaYFP-(黄色荧光)- rab E1d， - syp32， - got1p同源物gydF4y2Ba或gydF4y2BaRFP -(红色荧光蛋白)- memb12gydF4y2Ba

由Geldner等人产生的四个转基因品系。[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba表示标记gydF4y2BaYFP-Rab E1dgydF4y2Ba，gydF4y2BaYFP-Got1phomologgydF4y2Ba，gydF4y2BaYFP-SYP32gydF4y2Ba或gydF4y2BaRFP-MEMB12gydF4y2Ba在…的控制之下gydF4y2BaUBQ10gydF4y2Ba启动子从诺丁汉拟南芥库存中心获得。根据Geldner等人的建议，通过抗生素选择和基因组PCR对这些系进行了验证。[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。纯合子转基因gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba植物与任何一种纯合子杂交gydF4y2BaUBQ10::YFP-Got1p同源物，YFP-SYP32gydF4y2Ba或gydF4y2BaRFP-MEMB12gydF4y2Ba植物。将F1后代选择在含有卡那霉素(30 μ mL)的琼脂板上gydF4y2Ba^1gydF4y2BaPPT (10 μg mL)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)与十字架gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba融合构建物或潮霉素(50 μg mL)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)与十字架gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba融合结构。在共聚焦显微镜下进行分析之前，对双抗性F1幼苗进行基因分型，以确定是否存在所需的融合结构。gydF4y2Ba

原生质体的制备gydF4y2Ba

Ten-day-oldgydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba在18°C的缓冲液(0.4 M山梨醇，20 mM HEPES-KOH pH 7.6, 2.5 mM EDTA, 5 mM MgCl)中消化转基因苗gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10mm NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba0.1% (w/v)牛血清白蛋白，新鲜添加1.6% (w/v)纤维素酶Onozuka RS (Duchefa)和1.6% (w/v)宏酶R-10gydF4y2Ba根霉spgydF4y2Ba．(美国赛瓦))(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AtAPY1-SNAP的全载免疫荧光gydF4y2Ba

将10日龄的DKO-SNAP幼苗在4% (w/v)多聚甲醛(PFA)中固定1 h，并用1% (w/v)纤维素酶Onozuka RS (Duchefa)和1% (w/v)巨酶R-10处理gydF4y2Ba根霉spgydF4y2Ba．(Serva)在37°C下放置15分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，用1% (v/v) Triton X-100室温(RT)处理1小时。为了灭活所有内源性过氧化物酶，样品在甲醇:过氧化氢(200:1,v/v)中在室温下黑暗孵育30分钟。水洗后，用96% (v/v)乙醇处理1 min, PBS洗涤2次，用1% (w/v)脱脂牛奶(Fluka)封闭30 min。兔α-SNAP抗体(Open Biosystems, Huntsville, Alabama, USA) (1:50, 1% (w/v)脱脂牛奶)RT孵育至少1小时。PBS洗涤三次后，用1% (w/v)脱脂牛奶1:800稀释的山羊α-兔igg偶联辣根过氧化物酶(HRP) (GE Healthcare) RT孵育至少1小时。PBS洗涤三次去除二抗后，用2 μL异硫氰酸荧光素(FITC)酪酰胺(1 mg mL)处理幼苗gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)加入50ml扩增缓冲液[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]在室温下或在4°C的黑暗中过夜至少1小时。根据Pernthaler等人的方法制备了FITC酰胺[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]并由Kerstin Röske提供。样品用PBS洗涤三次，保存在PBS中成像。gydF4y2Ba

AtAPY1-GFP的全载免疫荧光gydF4y2Ba

6天大的根尖gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba将转基因幼苗用4% (w/v) PFA固定在0.1 M磷酸盐缓冲液(PB, pH 7.4)中30 min，在8% (w/v) PFA ([gydF4y2Ba35gydF4y2Ba];Y-D Stierhof, personal communication)，然后用80%甲醇/20% DMSO (Dent’s固定剂，[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba])。用兔α-GFP (TP 401;很多没有。071519来自Torrey Pines, 1:100)和山羊α-兔Alexa Fluor 488 (Invitrogen;很多没有。430222;1:100)，然后如前面所述嵌入Technovit 7100 [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。用Keyence BZ 8000荧光显微镜对3个μm的切片进行分析(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

用FM4-64和碱性pH处理gydF4y2Ba

出生7到10天gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba用15 μM FM4-64 (Invitrogen)在1 M Tris-HCl pH 8.0中真空浸润转基因幼苗。对于碱处理，采用了两种处理方法:(1)gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba将幼苗在普通MS液体培养基(pH 5.7)中培养5天，转移到碱性MS培养基(pH 8.1)中，再培养3天后成像[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba[2]在常规MS液体培养基(pH 5.7)中培养8天，在成像前用自来水或Tris缓冲盐水(TBS) pH 7.5浸润至少2小时。gydF4y2Ba

共聚焦激光扫描显微镜gydF4y2Ba

DKO-SNAP植株(10 d)成像采用徕卡共聚焦多光子显微镜TCS SP5 MP。为了避免FITC漂白，样品在200 μL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 800 μL水，9 mL甘油中加入抗褪色剂(0.233 g 1,4-重氮杂环(2.2.2)辛烷(Sigma)) [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。FITC信号使用徕卡水浸物镜(HCX PL APO 63x/1.2 water Lbd.Bl.)捕获。探测器范围设置为494 ~ 530 nm。使用与FITC相同的参数和设置捕获WT幼苗(10 d)的自身荧光。使用Leica软件(LAS1.8.2)的染料分离工具对WT和DKO-SNAP样品的光谱图像进行线性解混分析，以识别fitc特异性信号。gydF4y2Ba

转基因植物材料含有gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba用蔡司Axio成像仪连接激光扫描显微镜LSM 710或780(卡尔蔡司)对结构进行成像。6至10 d龄的幼苗在水中和原生质中成像，山梨醇缓冲液pH为7.6(见原生质体制备)，不含酶。使用蔡司Zen 2009和斐济相机对图像进行分析[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)软件。使用蔡司水浸物镜(C-Apochromat 40x/1.20 W Korr M27或C-Apochromat 63x/1.20 W Korr M27)。在氦氖(HeNe)激光594 nm激发线激发后，在601 ~ 708 nm范围内检测到叶绿素荧光。用488nm氩激光多线激发GFP，在490 ~ 520 nm范围内采集发射光谱。用氩激光器(514/561多束分束器)514 nm激发线激发YFP，在535 ~ 580 nm处采集发射光谱。RFP在561 nm处激发，在570 ~ 630 nm范围内检测到荧光。对于GFP与YFP或RFP的共成像，选择线序成像模式，在两条激发激光线之间快速切换。对于同一样品中GFP和YFP的检测，GFP在458nm处激发，YFP如上所述(多分束器458/514/594)。GFP和FM4-64的荧光成像采用488nm激发激光线同时进行，发射探测器分别为490 ~ 543nm和667 ~ 746nm。对于所有的双标记，狭窄的探测器入口狭缝带宽被选择，以避免荧光发射的漏穿。 Bright field-type images were acquired with the transmitted light detector.

AtAPY1-GFP的免疫金标记gydF4y2Ba

6天大的根尖gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba按照“AtAPY1-GFP全株免疫荧光”的描述固定转基因幼苗。将固定的样品按如下方法进行德康冷冻切片处理[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。简而言之，将根尖在PB中洗涤数次，逐步渗透到明胶中，并在冰上冷却。单根尖块茎在冰上切开，在2.3 M蔗糖水中4°C孵育24 h，固定在pin (Leica no. 6)上。1670 - 1950)，然后在液氮中冷冻。在配备FC6冷冻室的徕卡UC6上切割100纳米薄的切片，并用甲基纤维素蔗糖(1份2% (w/v)甲基纤维素(Sigma M-6385, 25 centipoises) + 1份2.3 M蔗糖)进行拾取。为了进行免疫金标记，将网格倒置放在37°C培养箱中的PBS滴液上20分钟，用0.1% (w/v)甘氨酸在PBS中洗涤(5x1min)，用1%(w/v)牛血清白蛋白在PBS中阻断(2x5min)，用一抗孵育1小时(α-GFP: Torrey Pines的TP 401, 1:50，或Abcam的ab290, 1:50)。PBS洗涤(4x2min)后，用10 nm或6 nm金偶联的Protein A孵育1 h, PBS洗涤(3x5s, 4x2min)， 1% (v/v)戊二醛后固定(5min)。切片用蒸馏水(10x1min)洗涤，用中性草酸铀酰(2% (w/v) UA, 0.15 M草酸，pH 7.0)染色5min，在水中短暂洗涤，并用甲基纤维素醋酸铀酰(9份2% (w/v) MC + 1份4% (w/v) UA, pH 4)在冰上孵育5min。最后，将网格圈出，将MC/UA膜还原成均匀的薄膜并风干。切片在Philips Morgagni 268 (FEI)上进行80 kV的分析，并用MegaView III数码相机(Olympus)拍摄图像。 Areas were calculated using the ITEM-software (Olympus). Alternatively, 200-nm-thin sections were mounted on glass slides and stained with α-GFP and goat α-rabbit Alexa Fluor 488 for fluorescence analysis on a Keyence BZ 8000 fluorescence microscope.

Co-localization分析gydF4y2Ba

转基因植物共表达gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba,要么gydF4y2BaRFP-MEMB12gydF4y2Ba，gydF4y2BaYFP-SYP32gydF4y2Ba，gydF4y2BaYFP-GOT1p同族体gydF4y2Ba或gydF4y2BaYFP-Rab E1dgydF4y2Ba用共聚焦显微镜成像，用ImageJ对获得的双通道图像进行分析[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。使用ImageJ的“Colocalization Threshold”和“Coloc2”工具生成相应的散点图和Pearson相关系数。gydF4y2Ba

AtAPY1-GFP的纯化gydF4y2Ba

起始材料的培养，将50mg种子在250ml烧瓶中50ml液体培养基中培养10 - 12d。幼苗用研钵和杵在液氮中研磨成细粉。每克植物材料，250 ~ 375 μL冷冻Tris- mes缓冲液(10 mM Tris, 2 mM MgCl)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入30 mM KCl, pH 6.5，以1 mM MES pH 3调节)。细胞匀浆在室温下解冻，并通过细网(Miracloth, Calbiochem)过滤。滤液在1000℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃保温10分钟，清除杂物。上清液在8000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃保温10 min，弃丸。将上清液与100% (v/v)甘油1:1混合，保持酶活性，保存于- 80°C。纯化AtAPY1-GFP时，采用α-GFP抗体包被的96孔微滴板(GFP-multiTrap板，ChromoTek, Planegg-Martinsried，德国)。蛋白质提取物200微升(4-6 μL)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)每孔加入，在4°C下振荡(500 rpm)孵育2小时或过夜。用300 μL冷水Tris-MES缓冲液洗涤孔3次，去除未结合蛋白。gydF4y2Ba

淀粉酶活性测定gydF4y2Ba

为了确定apyrase的活性，一种基于Tognoli等人的测定方法[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]被使用。核苷酸底物购自Sigma，原液在水中制备。将核苷酸在Tris-MES缓冲液(pH 6.5或pH 5.5)中稀释至所需浓度，并在GFP-multiTrap板上以每孔130 μ l的等份加入固定化AtAPY1-GFP。反应在30°C下振荡(500 rpm)孵育1小时。在新的96孔透明微滴板(Greiner Bio-One, kremsmnster, Austria)上，将每种反应混合物的60 μL转移到两个独立的孔中，并加入120 μL新配制的0.375 M H的停止溶液，检测释放的磷酸盐gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba0.75% (w/v) (NH)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_4gydF4y2BaMoOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·4gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0, 0.7% (w/v) SDS和3% (w/v) FeSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每口井都有。在RT下孵育10分钟后，在740 nm处读取样品的吸光度。为了确定磷酸盐污染和非特异性磷酸酶活性的背景，这些反应与WT蛋白提取物平行进行。从AtAPY1-GFP测定的读数中减去背景吸光度读数。gydF4y2Ba

微粒体膜蛋白的增溶作用gydF4y2Ba

幼苗从2毫克gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1gydF4y2Ba-转基因gfp种子在60 mL液体培养基中培养2周，然后在液氮中研磨。将植物粉末悬浮于3 mL冷冻蛋白提取缓冲液中(50 mM HEPES KOH pH 6.5, 5 mM EDTA, 0.4 M蔗糖，1 mM AEBSF(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐)(Sigma)，完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche))。使用前立即加入AEBSF和抑制剂鸡尾酒。蛋白悬浮液通过单层奇迹布过滤，并在14000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置10分钟。上清液在100,000℃下进行超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下使微粒体膜形成1小时。等量的膜分别用2 M NaCl和0.2 M Na处理gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 0.2% (w/v) SDS, 4 M尿素或蛋白提取缓冲液单独冰敷30 min。然后，样品在10万度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下孵育1小时，产生含有溶解蛋白(S100)和微粒体膜部分(P100)的上清。上清液在Vivaspin 2浓缩器(聚醚砜膜，10-kDa切断)中离心;萨托里乌斯)在12000英尺的温度下约20分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba．用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Scientific)测定S100和P100组分的蛋白浓度。将等量(约40 μg)的膜组分和溶解蛋白装在SDS凝胶上并进行免疫印迹。gydF4y2Ba

SDS-PAGE和Western blot分析gydF4y2Ba

按照标准方案进行SDS-PAGE和半干免疫印迹。硝化纤维素膜(Schleicher & sch)在1% (w/v)脱脂牛奶中阻断1小时。在TBS中，用1% (w/v)脱脂牛奶稀释一抗和二抗。膜与抗体孵育1h后，用0.1% (v/v) TBS水洗3次，每次10 min。单克隆小鼠α-GFP检测AtAPY1-GFP (1:1000;Roche)、肌动蛋白与小鼠α-植物肌动蛋白8单克隆(克隆10-B3 MAbGPa;1:1000;Sigma)， cFBPase与兔α-多克隆gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BacFBPase (1:1000;Agrisera)。山羊二抗α-小鼠IgG和α-兔IgG均与HRP (GE Healthcare)偶联，用1:5000稀释。使用ECL Western blotting试剂(GE Healthcare)检测化学发光信号。gydF4y2Ba

加入数据gydF4y2Ba

AtAPY1gydF4y2Ba[TAIR: At3g04080]gydF4y2Ba, AtAPY2gydF4y2Ba[TAIR: At5g18280],gydF4y2BaGot1p同族体gydF4y2Ba[TAIR: At3g03180],gydF4y2BaMEMB12gydF4y2Ba[TAIR: At5g50440],gydF4y2BaRab E1dgydF4y2Ba[TAIR: At5g03520],gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba[TAIR: At2g25600],gydF4y2BaSYP32gydF4y2Ba[TAIR: At3g24350]。gydF4y2Ba

用标记AtAPY1挽救幼苗致死性apyase双敲除表型gydF4y2Ba

其中一个目标是在亚细胞水平定位AtAPY1，以了解该蛋白如何在植物生长中发挥其功能。选择标记AtAPY1而不是培养抗体是因为AtAPY1和AtAPY2在氨基酸(aa)序列上非常相似:AtAPY1中只有一个6 -aa-片段(aa 44-49)与AtAPY2中相应的序列有4个不同的aa和2个相似的aa [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。这两个序列之间的所有其他差异只包含一个或两个氨基酸。gydF4y2Ba

在可用的标签中，SNAP-tag [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba似乎是最合适的。作为一个OgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba-烷基鸟嘌呤- dna烷基转移酶，SNAP共价结合苯基鸟嘌呤底物。有大量的底物耦合到不同的荧光染料和其他商业上可用的标签，使snap标签定位研究的多功能工具。的表达式gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba被放置在原生启动子区域的控制下，因为过表达会导致本地化工件。尽管存在这种风险，另一种标记AtAPY1版本，AtAPY1- gfp，与强花椰菜花叶病毒融合gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba启动子，因为ntpases的表达水平普遍较低[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

SNAP-或gfp -标签被融合到AtAPY1的c端，以避免在亚细胞靶向过程中可能的n端切割而丢失标签。因为标签会损害蛋白质功能并导致错误定位[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，执行互补策略。击倒gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba(DKO)对幼苗是致命的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。DKO幼苗应该存活，如果补充了标记AtAPY1功能和正确定位。然而，使用gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba启动子使得AtAPY1-GFP无法拯救DKO突变体，实验证实了这一点，因为该启动子在花粉中被关闭[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。如果DKO花粉中没有AtAPY1- gfp，就不会形成后代，因为AtAPY1或AtAPY2的存在是花粉发芽的先决条件[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。为了克服这一障碍，部分补充了apyrasegydF4y2Baapy2gydF4y2BaSKO工厂=gydF4y2Ba+ / apy1;apy2 / apy2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba)作为转化的遗传背景，每个标记gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba构造。这些植物携带了gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba在花粉特异性启动子的控制下gydF4y2Ba美籍西班牙人gydF4y2Ba这保证了DKO花粉的存活。gydF4y2Ba

DNA是从含有其中一种的部分互补的SKO植株的后代中分离出来的gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba或gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba并用于PCR分型。几个DKO植物没有WTgydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba分别鉴定为DKO-SNAP和DKO-GFP。两个突变体的PCR分析如图所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba答:的gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2gydF4y2Ba正如预期的那样，DKO-GFP突变体中总是存在这种结构，但有趣的是，DKO-SNAP突变体中也存在这种结构。一种可能的解释是，在选择的启动子区域中缺少一些在花粉中最佳表达所必需的调控元件。启动子区域先前用于gydF4y2BaAtAPY1:格斯gydF4y2Ba分析(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]在3 '端长了1 kb，包括了上游的几乎整个基因(At3g04090)gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba．由于At3g04090基因被认为对于成功的互补是不必要的，所以它大部分被排除在gydF4y2BaAtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba构造。gydF4y2Ba

为了证实SNAP和gfp标记的AtAPY1可以挽救DKO的致死幼苗表型，我们分析了SKO和DKO的互补植株与WT和DKO幼苗的表型对比(图2)gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。SKO-SNAP (gydF4y2Ba+ / +;apy2 / apy2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2;AtAPY1: AtAPY1-SNAPgydF4y2Ba)及SKO-GFP (gydF4y2Baapy1 / apy1;+/+gydF4y2Ba;gydF4y2Ba美籍西班牙人:AtAPY2;35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba)植物被纳入研究，以检查标记的apyrase对WT表型可能的显性负面影响。没有编码标记AtAPY1构建体的DKO幼苗表型异常，子叶肉质，无根(图2)gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba;［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba])。这些幼苗过了这个阶段就不发育了。DKO植株表达gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba或gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba另一方面，与野生型植物没有表型差异(图2)gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)和SKO突变体(数据未显示)。gydF4y2Ba

致命的DKO (gydF4y2Baapy1 / apy1;apy2 / apy2;美籍西班牙人::AtAPY2)gydF4y2Ba能否通过改造来拯救gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba提前gydF4y2Ba或gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba使DKO-SNAP和DKO-GFP植物成为定位研究的合适工具。gydF4y2Ba

AtAPY1存在于点状结构中，但不存在于质膜或细胞外空间gydF4y2Ba

为了在共聚焦显微镜下定位AtAPY1在亚细胞水平，活的DKO-SNAP幼苗与snap兼容的荧光底物孵育，以标记AtAPY1- snap融合蛋白。使用两种细胞渗透性荧光底物:红色荧光四甲基罗丹明- star和绿色荧光BG-505(均由Andreas Brecht提供，前Covalys Biosciences, Basel, Switzerland)。虽然特异标记融合蛋白gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在酵母中取得了成功[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]以及动物和人类细胞培养物[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，高背景使得在拟南芥幼苗中无法检测到atapy1 - snap特异性信号。被测染料通过细胞壁进入细胞，但即使水洗14小时也不能去除多余的荧光底物(数据未显示)。gydF4y2Ba

因此，选择间接免疫荧光作为一种不同的方法。DKO-SNAP幼苗固定。细胞壁消化和质膜渗透后，用抗snap标签的一抗孵育。经过几个洗涤步骤后，加入fitc标记的二抗，观察CLSM的AtAPY1-SNAP。背景很低，但没有检测到特定的信号(数据未显示)。为了增加荧光信号，采用了酪酰胺信号放大技术[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。该技术利用过氧化物酶活性将大量标记的底物在邻近区域进行共价偶联。因此，我们不添加fitc标记的二抗，而是与fitc偶联酪酰胺联合添加hrp标记的抗体。TSA提高了DKO-SNAP幼苗的信噪比，细胞内可见点状结构(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)在WT中没有发现(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB).选择根毛作为适合定位的细胞类型，因为启动子-葡萄糖醛酸酶分析表明gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba在根毛以及其他细胞类型中的保卫细胞中强烈表达[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

克服弱表达水平gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba采用间接免疫荧光法对转基因植株进行表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在强35S启动子的控制下我们在两种不同的方法中使用了针对GFP的一抗和Alexa Fluor 488偶联的二抗:200纳米薄德康冷冻切片包埋后标记(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba2.选C。预包埋标记，然后包埋在Technovit 7100树脂中，切片(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。在两个实验中，细胞内的点状信号都可以在根部得到证实(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaC)和根毛(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。在细胞壁和质膜上未检测到信号，在没有一抗的对照组(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba

为了验证免疫荧光获得的成像数据，采用了第二种检测方法。转基因植物表达gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba是成像gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba样品形貌。图示细胞内点状图案与之前的相同gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba在保护细胞中观察到表达植株(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaE)，子叶表皮(附加档gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)，下胚轴(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)和根(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)。WT对照组没有出现WT保护细胞典型的这种点状模式(图2)gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。的表达式gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba-tag单独导致细胞质染色[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

gfp标记蛋白的实时成像方法适用于细胞壁上的apyrase检测，正如其他植物物种的外胞体apyrase所示[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。但由于AtAPY1被认为定位于细胞外，而且GFP在pH≤5.0时不会发出荧光[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，如果标签暴露在细胞壁的酸性环境中，可能会错过一个弱的AtAPY1-GFP信号。为细胞外环境、WT原生质体和表达体提供GFP荧光的最佳pH值gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba由子叶制备，在pH 7.6下成像。与之前一样，在细胞内发现了GFP信号(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaG)，这在WT控制中没有出现(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaH)，但转基因原生质体的质膜没有荧光(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaH)。这一结果排除了AtAPY1锚定在质膜上的可能性。然而，原生质体的形成对细胞来说代表着严重的压力，这可能会导致基因的下调gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba和/或AtAPY1的降解或内化。此外，AtAPY1可能是细胞壁中的可溶性蛋白，在这种情况下，原生质体制备过程中细胞壁的消化会导致AtAPY1- gfp信号的丢失。因此，壁完整的细胞在适合于GFP荧光的pH下成像(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba1, J).幼苗表达gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba在pH为8.1而不是5.7的液体培养基中生长。已知培养基中较高的pH值可以恢复外质体中的GFP荧光[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。然而，即使在这些条件下，也没有检测到细胞外的GFP信号(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaI).此外，gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba为了尽量减少碱性培养基对AtAPY1分布的影响，在正常条件下培养幼苗，并用pH为7.5的缓冲液浸润，仅用于成像。在30多个独立实验中，同样没有发现细胞外信号(数据未显示)。gydF4y2Ba

两种检测方法，免疫荧光和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba成像显示相同的点状结构，但在质膜或细胞外间隙未见信号。gydF4y2Ba

AtAPY1定位于高尔基体gydF4y2Ba

在更高的放大倍数下，一些atapy1特有的点状信号呈现为甜甜圈或马蹄形结构(见图)gydF4y2Ba2gydF4y2BaI).这种形态是典型的高尔基堆，从顶部看主池的中间[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。此外，在0.5 ~ 1 μm之间观察到的尺寸与高尔基堆的预期尺寸相匹配[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。为了证实AtAPY1定位在这些细胞器中，我们使用了FM4-64染料。FM4-64被细胞内吞，依次染色质膜、核内体和细胞壁gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-高尔基网络，但不是高尔基体[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。成像fm4 - 64 -渗透gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba即使在浸润120分钟后，幼苗也没有发现荧光染料和GFP信号的共定位(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA和图中对应的散点图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE)。gydF4y2Ba

作为另一个阴性内体对照，研究了与GTPase Rab E1d共定位。关于将Rab E1d指定为高尔基体的标记蛋白，文献中存在一些争议[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]或后高尔基体/内体隔室[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。然而，有共识认为Rab E1d主要与大鼠唾液转移酶共定位[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba),一个gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba高尔基体和/或gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-高尔基网络标记蛋白[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]，它还与质膜(PM)有关[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。因此，Rab E1d被认为在从高尔基体到PM的分泌囊的贩运中发挥了作用[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在转基因植物中共表达gydF4y2BaYFP-Rab E1dgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba，未发现YFP和GFP荧光重叠(图2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba，对应的散点图如图所示gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。这种重叠的缺失不仅表明在核内体中不存在AtAPY1-GFP，也排除了GFP和YFP检测通道之间的串扰。为了确认所选择的GFP和YFP设置分别对GFP和YFP荧光的检测具有特异性，只表达两种荧光团之一的转基因植物在GFP和YFP设置下依次成像。当对表皮细胞成像时gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba用GFP设置表达植物，在GFP检测通道中出现了熟悉的点状结构(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2BaA)。然而，使用YFP设置拍摄相同表皮切片的图像并没有提供这种点状图案(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2BaA).与植物表达相同的成像实验gydF4y2BaYFP-SYP32gydF4y2Ba仅，显示可忽略的YFP荧光渗透到GFP检测通道(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2BaB).这些对照实验证明了GFP和YFP检测设置的特异性。gydF4y2Ba

在直接定位方法中，通过与三种已知的拟南芥高尔基驻留蛋白共定位，研究了AtAPY1-GFP在高尔基体中的发生。MEMB12 (Membrin 12)和SYP32 (Syntaxin of plants 32)是定位于高尔基体的SNARE蛋白[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。高尔基转运蛋白Got1p (Golgi transport 1 protein)存在于高尔基膜中gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba［gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]，其在拟南芥中的同源物也定位于高尔基[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。转基因植物共表达gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba或者是高尔基标记gydF4y2BaRFP-MEMB12gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC),gydF4y2BaYFP-SYP32gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD)或gydF4y2BaYFP-Got1p同族体gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)用共聚焦显微镜分析。所有三种高尔基标记蛋白的荧光与AtAPY1荧光重叠，将AtAPY1- gfp定位在高尔基体上。gydF4y2Ba

为了排除或确认共定位，不仅通过眼睛，ImageJ软件被应用。利用两个检测通道的图像叠加生成散点图，并计算Pearson相关系数(RgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba)的两个荧光信号(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE和附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。RgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba值> 0.5表示共定位[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，验证了与AtAPY1-GFP同源的三个标记蛋白RFP-MEMB12、YFP-SYP32和YFP-Got1p共定位。gydF4y2Ba

为了确认共定位结果，利用α-GFP一抗和金偶联二抗分别用金颗粒标记AtAPY1-GFP。通过根部的德康冷冻切片电镜显示高尔基体染色较弱，但具有特异性(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA、B)。在面积为11.8 μm的56个高尔基隔室(48个标记，8个未标记)中进行切片gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，每μm 8.3个金粒子gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba被计算。如果只考虑标记的高尔基隔室，则该值增加到9.8个粒子/ μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．相比之下，每μm仅含0.37和0.07个金颗粒gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在88个线粒体(= 14 μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)和12个核(= 27 μm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba),分别。多泡体(MVB)也被金颗粒免疫阳性标记(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)，这很可能反映了一些AtAPY1-GFP向液泡的运输gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba-过度表达植物[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba而不是AtAPY1在泡前腔室中的功能作用。包括细胞壁在内的任何其他细胞室未发现免疫标记(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaD).综上所述，AtAPY1-GFP的免疫金标记研究证实了它在高尔基体中的定位，没有发现细胞外发生的迹象。gydF4y2Ba

AtAPY1具有典型的内链酶而非外链酶的底物特异性gydF4y2Ba

如果AtAPY1的高尔基定位是正确的，那么AtAPY1应该表现出高尔基酶特有的底物特异性。因此，AtAPY1-GFP的活性在已知的apyase底物存在下进行了测试，pH为6.5，与高尔基体[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。AMP不是吡喃酶的底物，因此作为阴性对照。AtAPY1-GFP不水解ATP和ADP，而ATP和ADP是外链酶的典型底物[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，但核苷酸尿苷二磷酸(UDP)，鸟苷二磷酸(GDP)和肌苷二磷酸(IDP)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在所有其他NTPs或ndp存在的情况下，未检测到活性(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和AMP(数据未显示)。这三种NDPs的水解与其他植物高尔基脲酶的底物特异性相匹配，例如来自水稻(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]和梧桐(gydF4y2Ba宏碁pseudoplatanusgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为了研究底物特异性是否具有pH依赖性，以及一旦AtAPY1到达外质体后，底物特异性是否会发生有利于ATP和ADP的变化，我们在pH 5.5(细胞壁中常见的pH值)下重复了AtAPY1- gfp活性测定[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。然而，三种二磷酸盐UDP, GDP和IDP仍然是唯一的底物(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。因此，确定的底物特异性证实了AtAPY1不在细胞壁中观察到，而是在高尔基体中观察到的结果。gydF4y2Ba

AtAPY1是一种完整的膜蛋白gydF4y2Ba

目的之一是确定AtAPY1是否是高尔基体管腔中的可溶性蛋白，或者如TMHMM预测程序所暗示的那样[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]，一种高尔基膜蛋白，其n端具有未裂解的信号序列，可作为跨膜锚点(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaA)。免疫金标记结果支持了这一预测，表明该蛋白存在膜关联(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Baa - c)。gydF4y2Ba

从转基因植株中分离出微粒体膜gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba用针对胞质和不溶性蛋白标记蛋白的抗体验证了它们的纯度(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。用各种增溶剂处理微粒体膜，然后分析任何增溶蛋白。使用α-GFP抗体，在AtAPY1-GFP的预期分子质量(80 kDa)处观察到一个主要信号，在27 kDa处观察到一个次要信号(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB).较小的蛋白很可能是AtAPY1-GFP在蛋白提取过程中的降解产物。如果不处理微粒体膜，在膜部分中检测到AtAPY1-GFP(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)，表明该蛋白是膜结合的。为了支持这一发现，洗涤剂SDS从膜上释放了大部分AtAPY1-GFP蛋白(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB).为了区分AtAPY1是外周蛋白还是整体膜蛋白，将微粒体膜置于高盐(2 M NaCl)、碱性(0.2 M Na)环境中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)和变性(4m尿素)条件。外周蛋白被尿素从膜上去除，尿素会干扰蛋白质之间的相互作用，高盐和碱性处理分别会破坏静电和疏水相互作用。除了微量的盐和钠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理确实将AtAPY1从颗粒部分转移到上清(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)作为整体膜蛋白。AtAPY1也不是高尔基可溶性蛋白，因为在Na后，AtAPY1仍留在颗粒部分gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba已知可将微粒体腔内的可溶性蛋白质浸出至上清部分的处理方法，见[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。尿素将部分AtAPY1-GFP蛋白释放到上清液中，但大部分蛋白仍留在膜组分中(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB).尽管跨膜蛋白通常不被尿素提取，但II型积分蛋白与膜的关联似乎不如具有多个跨膜结构域的蛋白紧密[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

综上所述，AtAPY1具有单代II型膜蛋白的特征。gydF4y2Ba

AtAPY1细胞外定位的先前证据gydF4y2Ba

使用程序预测AtAPY1的亚细胞定位尚无定论:程序SubLoc version (v) 1.0 [gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]表示细胞质，靶P v. 1.1 [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba线粒体与WoLF PSORT v. 2.0 [gydF4y2Ba74gydF4y2Ba叶绿体。Predotar v. 1.3 [gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]无法定义具体的定位和PSORT v. 6.4 [gydF4y2Ba76gydF4y2Ba预测了细胞外定位。因此，实验数据变得非常宝贵。实验gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba萌发花粉在液体萌发培养基中检测淀粉酶活性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。这种细胞外活性被添加针对n端截断(aa 36-471)、变性和重组AtAPY1蛋白的多克隆抗体所抑制[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。这表明AtAPY1是一种细胞外蛋白。然而，这些抗体可能针对细胞壁中AtAPY1以外的酶。例如，AtAPY1的apyase保守区(ACR) 1与AtAPY2的ACR1是100%相同的。因此，α-AtAPY1抗体也能识别AtAPY2也就不足为奇了[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。AtAPY1 ACRs与其他5种拟南芥酶的相似性不高，但这些保守区域仍可能是α-AtAPY1抗体的结合靶点。在不同的植物(棉花)中，使用相同的α-AtAPY1抗血清成功抑制胞外apyase活性的实验支持了交叉反应的可能性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

这个实验gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba萌发后的花粉还表明，在花粉萌发培养基中表现出淀粉酶活性的蛋白质是可溶的，因为它可以在虹吸的分液中测量[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。由于AtAPY1表现出整体膜蛋白的增溶特性，因此不太可能与之前检测到的胞外apyase活性相同。gydF4y2Ba

拟南芥apyrase作为eATP信号的调节因子gydF4y2Ba

AtAPY1和AtAPY2被认为是拟南芥中eATP信号的调节因子[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，因此被认为在细胞壁中起作用。然而，AtAPY1的底物特异性并不符合这一模型。AtAPY1- gfp不能水解ATP和ADP，这与AtAPY1调节eATP信号的作用相矛盾。gydF4y2Ba

尽管AtAPY1不符合外链apyrase的特征，但AtAPY2仍然是候选基因。然而，Dunkley等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba［gydF4y2Ba80gydF4y2Ba注意到AtAPY2的高尔基定位。他们利用密度离心法制备了拟南芥愈伤组织的膜组分，并用质谱法鉴定了高尔基蛋白池中的AtAPY2。最近，AtAPY2的高尔基定位在另一个富含高尔基膜的蛋白质组学分析中得到证实[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。然而，拟南芥信息资源数据库保存了两种不同的剪接变体gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Ba这可能导致相应蛋白质的不同定位。事实证明转基因拟南芥植株过表达gydF4y2BaAtAPY2gydF4y2Baeap介导的超氧化物生成比WT少[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba指出了AtAPY2(一种变体)的细胞外定位。gydF4y2Ba

由于三种亚细胞检测方法均未在细胞壁中检测到AtAPY1，并且不具有外链apyrase的底物特异性，因此我们假设在拟南芥eATP信号传导中观察到的调节酶是AtAPY1以外的其他apyrase。gydF4y2Ba

高尔基体中可能的AtAPY1功能gydF4y2Ba

在高尔基体中描述了二磷酸酶的活性gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba［gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。UDP迅速降解为单磷酸尿苷和PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba通过一种面向高尔基体管腔及其活性部位的整体膜蛋白。它也在gydF4y2Bap .一gydF4y2BaUDP抑制糖基转移酶[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]，它在植物初生细胞壁成分的组装中起作用[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba在反馈机制中。因此有人提出，二磷酸水解酶如apyrase通过不断去除糖基转移反应的副产物UDP来防止高尔基体中多糖合成的抑制[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]。他们发现高尔基脲酶只存在于豌豆幼苗茎的伸长区，这一发现支持了高尔基脲酶在多糖生物合成中的作用。这个区域不断需要新的细胞壁材料。apy1酶在拟南芥中可能起同样的作用。apyrase DKO突变体的发育和生长表型，如缺乏花粉萌发[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，没有根和芽生长，细胞形状扭曲[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba可以用细胞壁材料的生物合成缺陷来解释。这种作用得到了AtAPY1底物特异性的支持，因为UDP和GDP是由高尔基体中的糖基转移酶产生的。gydF4y2Ba

更多关于糖基化作用的证据来自酵母的互补实验gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba突变体gydF4y2BaΔgda1gydF4y2Ba．这种酵母突变体缺乏高尔基氨基化酶鸟苷二磷酸酶1 (GDA1)，导致糖基化缺陷[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba通过与之互补而废除gydF4y2BaAtAPY1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

也有人认为，高尔基酶提供核苷单磷酸作为底物，以反港机制从细胞质中交换核苷酸糖[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]。因此，单磷酸核苷的缺乏会阻止或减少核苷酸糖进入高尔基体的运输[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba并增加细胞质中核苷酸糖的浓度。作为一个“释放阀”，叶绿体会输入糖并将其转化为淀粉。与这一假设一致的是，与WT相比，在apyrase DKO突变体中观察到瞬时淀粉的显著增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。当高尔基体功能通常被破坏时，叶绿体中淀粉的积累也被观察到，这可以用细胞质糖浓度升高引起的间接影响来解释[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

使用两种不同的转基因株系表达任一种gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba或gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba允许在亚细胞水平特异性标记AtAPY1。显示atapy1特异性荧光信号的细胞器通过以下标准被鉴定为高尔基体:(i)形态，(ii)大小，(iii)与内吞标记染色FM4-64缺乏共定位gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-高尔基标记蛋白Rab E1d，但(iv)与三个高尔基标记蛋白MEMB12, SYP32和Got1p同源共定位。用α-GFP抗体对高尔基体进行免疫标记。在进行综述时，通过高尔基膜的蛋白质组学分析和AtAPY1- yfp与cfp标记的共定位，独立地证实了AtAPY1的高尔基定位gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-瞬时转化洋葱皮中的高尔基标记α-甘露糖苷酶I [j]gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

虽然不能排除细胞外AtAPY1缺失检测是方法敏感性问题，但我们的结果表明AtAPY1主要存在于高尔基体中。因此，AtAPY1不太可能代表eATP水平的调节酶[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]，而拟南芥外链apyrase的真实身份尚未被发现。此外，由于缺乏[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]和减少的AtAPY1和AtAPY2 [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba可能与eATP信号没有直接联系。相反，AtAPY1在高尔基体中的定位需要成为未来研究的基础，以了解AtAPY1特别是植物高尔基体酶如何影响植物的生长和发育。gydF4y2Ba

aa:gydF4y2Ba

氨基酸(s)gydF4y2Ba

ACR:gydF4y2Ba

淀粉酶保守区gydF4y2Ba

AEBSF:gydF4y2Ba

4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐gydF4y2Ba

apyrase:gydF4y2Ba

腺苷焦磷酸酶gydF4y2Ba

样品形貌:gydF4y2Ba

共聚焦激光扫描显微镜gydF4y2Ba

DKO:gydF4y2Ba

双基因敲除gydF4y2Ba

eATP:gydF4y2Ba

细胞外ATPgydF4y2Ba

ECM:gydF4y2Ba

细胞外基质gydF4y2Ba

FITC:gydF4y2Ba

异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba

fm4 - 64:gydF4y2Ba

N - (3-triethylammoniumpropyl) 4 -二溴化吡啶(p-diethylaminophenyl-hexatrienyl)gydF4y2Ba

国内生产总值:gydF4y2Ba

鸟苷二磷酸gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

Got1p:gydF4y2Ba

高尔基转运蛋白gydF4y2Ba

HeNe:gydF4y2Ba

氦氖激光器gydF4y2Ba

合:gydF4y2Ba

辣根过氧化物酶gydF4y2Ba

国内流离失所者:gydF4y2Ba

肌苷二磷酸gydF4y2Ba

主持人:gydF4y2Ba

甲基纤维素gydF4y2Ba

MEMB12:gydF4y2Ba

Membrin 12gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige和SkooggydF4y2Ba

多功能车辆总线:gydF4y2Ba

多泡体gydF4y2Ba

NTPDase:gydF4y2Ba

核苷三磷酸二磷酸水解酶gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放式阅读框gydF4y2Ba

病人:gydF4y2Ba

球团gydF4y2Ba

铅:gydF4y2Ba

磷酸缓冲液gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐缓冲盐水gydF4y2Ba

PFA:gydF4y2Ba

多聚甲醛gydF4y2Ba

PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

无机磷酸盐gydF4y2Ba

下午:gydF4y2Ba

等离子体膜gydF4y2Ba

PPT:gydF4y2Ba

PhosphinothricingydF4y2Ba

招标书:gydF4y2Ba

红色荧光蛋白gydF4y2Ba

RT:gydF4y2Ba

室温gydF4y2Ba

史:gydF4y2Ba

上层清液gydF4y2Ba

提前:gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba-alkylguanine-DNA alkyltransferasegydF4y2Ba

美籍西班牙人:gydF4y2Ba

向内摇花粉gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道gydF4y2Ba

SYP32:gydF4y2Ba

植物合成素gydF4y2Ba

SKO:gydF4y2Ba

单基因敲除gydF4y2Ba

本文分别:gydF4y2Ba

DNA转移gydF4y2Ba

TBS:gydF4y2Ba

Tris缓冲了生理盐水gydF4y2Ba

透射电镜:gydF4y2Ba

透射电子显微镜gydF4y2Ba

TM:gydF4y2Ba

跨膜域gydF4y2Ba

运输安全管理局:gydF4y2Ba

酰胺信号放大gydF4y2Ba

UA:gydF4y2Ba

铀酰乙酸gydF4y2Ba

UDP:gydF4y2Ba

尿苷二磷酸gydF4y2Ba

v:gydF4y2Ba

版本gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型或野生型gydF4y2Ba

YFP:gydF4y2Ba

黄色荧光蛋白。gydF4y2Ba

这项工作得到了德国研究基金会的支持(批准号:STE 1455/2-1到美国)，并为德累斯顿工业大学Universität的博士生提供为期一年的奖学金gydF4y2Ba35 s:: AtAPY1-GFPgydF4y2Ba构造和相应的WT背景转基因系由孙宇生成。我们感谢Niko Geldner捐赠的波标记系18Y (YFP-Got1p同源)、22Y (YFP-SYP32)、27Y (YFP-Rab E1d)和127R (RFP-MEMB12)，以及诺丁汉拟南芥库存中心分发的相应种子。特别感谢Andreas Brecht和Katrin m ntener为snap技术和技术支持提供基板。我们感谢DFG德累斯顿再生治疗中心(CRTD)的光学和电子显微镜设备和技术中心Universität德累斯顿生物技术中心，特别是Jean-Christophe Olaya和Ruth Hans在徕卡显微镜SP5上的出色帮助，Hella Hartmann在Zeiss LSM 780上的出色帮助，Susanne Kretschmar在免疫金标记的样品制备上的出色帮助。我们也感谢Tsuyoshi Nakagawa发送给我们二进制目标载体pGWB50, York-Dieter Stierhof对TEM图像的讨论，Jeannine Bloch对酶活性的统计分析，Travis Graber对手稿的校对。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Universität德累斯顿理工大学分子生物技术研究室，Helmholtzstraße 10，德国德累斯顿01069gydF4y2Ba

   马德伦·席勒，卡罗琳·马萨斯基和艾瑞斯·斯坦布伦纳gydF4y2Ba

2. dfg -德累斯顿再生治疗中心(CRTD)， Technische Universität Dresden, Fetscherstraße 105, Dresden, 01307，德国gydF4y2Ba

   托马斯KurthgydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba虹膜SteinebrunnergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

MS对DKO-SNAP突变体进行了分子遗传学研究，进行了共聚焦激光扫描显微镜和图像分析、样品制备和处理等定位研究，分析了AtAPY1-GFP的溶解度，并参与了论文的起草。CM对AtAPY1-GFP进行底物特异性分析。TK用免疫金标记法和间接免疫荧光法进行了定位研究gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba表达幼苗。是构思的研究，产生的gydF4y2BaAtAPY1-SNAPgydF4y2Ba转基因系和共表达系gydF4y2BaAtAPY1-GFPgydF4y2Ba和标记基因，对DKO-GFP突变体进行遗传互补，并撰写稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。gydF4y2Ba

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