在地理上不同集合的耐冻性、相容溶质和多胺的比较Thellungiella sp。而且拟南芥登记入册

背景

Thellungiella被认为是一种极端微生物的替代品拟南芥研究环境压力耐受性。然而,拟南芥在此，比较了两种材料的耐寒性范围。

结果

叶片耐寒性16Thellungiella在4°C冷驯化14天之前和之后，用电解质泄漏试验评估材料。可溶性糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖)和游离多胺(腐胺、亚精胺、精胺)用HPLC、脯氨酸光度法定量。非驯化抗冻能力的范围完全重合拟南芥而且Thellungiella．经过寒冷的适应，有些Thellungiella材料比任何材料都更耐寒拟南芥登记入册。两种品种的抗冻性均与蔗糖水平相关，但棉子糖积累量较低Thellungiella且只与耐冻性有关拟南芥．叶片脯氨酸含量则相反。不同物种间的多胺含量大致相似。非驯化组中只有精胺含量较高Thellungiella但在驯化过程中植株的耐寒性下降，且与植株的耐寒性呈负相关。

结论

Thellungiella就耐寒性而言，不是嗜极菌，但有些品种显著扩大了存在的范围拟南芥．代谢产物数据表明不同物种间的代谢适应策略不同。

低温和冰冻严重限制了植物的生长和发育，限制了世界上大部分地区作物的生产力。温带地区的植物在数天到数周的时间里暴露在较低但不结冰的温度下，耐寒性会增强，这个过程被称为冷适应。这伴随着基因表达和代谢物组成的巨大变化[1- - - - - -3.]，包括增加相容性溶质的水平，如糖、脯氨酸和多胺，这可能有助于细胞的耐冻性。

植物抗冻性和冷驯化的分子研究主要是在拟南芥．除了正向遗传学和逆向遗传学，对自然变异的分析已成为分析该物种复杂适应性性状的一种越来越有用的方法(见[4- - - - - -6)。拟南芥树种广泛分布在整个北半球，跨越不同的生长环境。因此可以预期，它们拥有有利于适应各种气候条件的表型和遗传变异。几项研究表明，在反应中有显著的自然变化拟南芥低温装置[7- - - - - -13］．然而,拟南芥不是嗜极生物，可以预期，更多的耐寒物种进化出了不同的或额外的保护机制，这在这个物种中是找不到的。

Thellungiella salsuginea是一种新兴的植物模式物种，被认为具有嗜极生物的特征，即对盐度、冰冻、缺氮和干旱胁迫的高度耐受性[14- - - - - -19］．属Thellungiella是十字花科家庭，因此与…有关拟南芥［20.，21］．t . salsuginea就像拟南芥在许多特点，如短的生命周期，自育性，转化的花浸法和基因组大小约两倍于拟南芥［17］．近亲物种的基因组t . parvula最近进行了测序[22］．类似于拟南芥，亦在t . salsuginea不同的品种已经被鉴定出来，分别来自中国和加拿大的山东和育空品种经常被用于研究对非生物胁迫的响应[21］．然而，没有系统的调查自然变化的耐受力Thellungiella已出版至今。

在此，我们研究了14种植物的抗冻性和冷适应反应t . salsuginea两个密切相关的种的附属物t . halophila而且t . botschantzevii．我们将这些数据与最近一项关于54拟南芥登记入册(13］．结果表明，冬小麦经冷驯化后的耐寒性较好Thellungiella延绵的耐寒性比低温的耐寒性更强拟南芥登记入册。此外，该数据首次提供了不同代谢适应策略的证据Thellungiella相比拟南芥．

植物材料

种子Thellungiella salsuginea(Pallas) O.E. Schulz)的科罗拉多、Cracker Creek、Dillibrough、河北、河南、江苏、山东、新疆和育空地区的资料由Ray A. Bressan教授(普渡大学西拉斐特分校)提供。进一步的种子t . salsuginea(阿尔泰1号，阿尔泰2号，布里亚提亚，图瓦和雅库茨克)，t . halophila(C.A. Meyer) O.E.舒尔茨)(巴亚努尔)和t . botschantzevii(d.a German) (Saratov)在俄罗斯和哈萨克斯坦采集。所有资源的地理来源均列于表中1．的答:芥用于多胺测定的材料是我们以前研究中使用的材料[7，13］．

种子Thellungiella播种于土壤中，在4°C的生长箱中，以90 μE m光照16 h日长^－2年代^－1为期一周，以促进发芽。幼苗移栽到温室中，每天16 h，补光至少达到200 μE m^－2年代^－1白天20°C，晚上18°C，持续8周(非驯化植物)。在冷驯化过程中，植物被转移到4℃的生长箱中，在上述条件下再培养14天。拟南芥植物在相同的条件下生长和驯化[7，11]，但只在不适应的条件下生长6周，才能达到相同的发育状态。

耐冻性试验

冷冻损伤被确定为分离叶片在不同温度下冷冻后的电解液泄漏，这在以前的出版物中有详细描述[7，11］．简单地说，将取自三株植物的三片莲座叶放入装有300 μl蒸馏水的玻璃管中。试管被转移到一个可编程的冷却浴中，温度设置为−1°C，在整个实验过程中，对照样品置于冰上。在- 1℃温度平衡30分钟后，将冰晶添加到管中开始冻结。30分钟后，样品以4°C/h的速率冷却。在- 1°C到- 30°C的温度范围内，从浴液中提取样品，并在冰上慢慢融化一夜。然后将叶片浸泡在蒸馏水中，在4°C的摇床上摇16小时。电解液泄漏测定为样品煮沸前后水中电导率的比值。电解液泄漏50%的温度(LT₅₀)计算为LOG EC₅₀用GraphPad Prism3软件拟合了泄漏值的s型曲线。

糖分析

同样用于耐寒性测定的植物的两片叶子在取样后立即被冷冻在液氮中，并使用“Retsch MM 200”球磨机进行均质(Retsch, Haan, Germany)。可溶性糖的提取和定量采用高效阴离子交换色谱(HPAEC)，使用ICS3000色谱系统(加利福尼亚州森尼维尔市Dionex)上的CarboPac PA-100色谱柱，如上所述[24］．

脯氨酸的测量

从乙醇提取物中测定脯氨酸含量，乙醇提取物也用于糖的测定，其测定方法是从前面描述的程序改进而来[25，26］．提取液用蒸馏水稀释10倍，100 μl与100 μl冰乙酸和100 μl 2.5% (w/v)酸性茚三酮试剂混合[26］．混合物在95°C下孵育1小时，然后在冰上孵育10分钟。用500 μl甲苯提取反应混合物，在分光光度计上测定甲苯相中茚三酮在520 nm处的吸光度。

聚胺测量

叶片样品(100-200 mg)用球磨机均质，在1 ml 0.2 N高氯酸中4℃提取1 h，提取游离多胺，4℃16000 x g离心30 min。由于我们在样品中只检测到极低水平的结合多胺(数据未显示)，因此没有进一步研究。取上清等分100 μl、1.5 M碳酸钠110 μl、丹酰氯200 μl(丙酮7.5 mg/ml;加入Sigma，慕尼黑，德国)。另外，加入10 μl 0.5 mM二氨基己烷作为内标。60°C暗处培养1小时后，加入50 μl 100 mg/ml脯氨酸溶液结合游离丹酰氯[27］．丹基化多胺在60°C暗处孵育30min后，用250 μl甲苯提取，真空离心机干燥，100 μl甲醇溶解。在由梯度泵(p580型)、自动进样器(ASI-100)和荧光检测器(RF 2000)组成的高效液相色谱系统(Dionex)上，使用反相LC-18色谱柱(Supelco, Munich, Germany)进行分析。样品注入20 μl，流速为1 ml/min，以70% ~ 100% (v/v)甲醇为线性梯度在水中洗脱，激发波长为365 nm，发射波长为510 nm。使用Dionex Chromeleon软件对数据进行分析，并从纯物质中获得校准曲线进行定量。

统计数据

使用R统计包中的皮尔逊乘积-矩相关分析进行相关检验[28］．

建立了自然收藏Thellungiella规范。登记入册

研究了16种不同品种的抗寒性和抗冻性Thellungiella登记入册(表1)．其中14只属于该物种t . salsuginea每人一份t . halophila(Bayanaul)和t . botschantzevii(萨拉托夫)。其中4个产地来自美国大陆或加拿大，5个产地来自中国，此前对育空和山东的产地进行了大量研究(见[21)。此外，为了这项研究，我们从俄罗斯和哈萨克斯坦的不同地点收集了7份材料，以丰富我们从非常寒冷的气候中收集的材料1)．因此，这些遗迹的地理起源跨越北半球(33°N到61°N之间)，从东经130°到西经135°。

耐寒性的自然变化Thellungiella登记入册

的耐寒性Thellungiella加入之前已确定(未适应;NA)和之后(已驯化;ACC) 4°C冷驯化两周(图1)．结果表明，在抗冻性上有很强的自然变异Thellungiella．驯化(LT₅₀- 9.12°C(江苏)到- 15.21°C(图瓦))，高于未驯化植物(LT₅₀- 5.70°C(新疆)至- 7.40°C(巴亚努尔))。此外，Tuva表现出最高的适应能力(LT相差8.22°C)₅₀NA和ACC之间的差异最大，江苏最低(3.28℃)。

Thellungiella一般认为它比拟南芥更耐寒[29］．事实上，我们最近测定的耐寒度是54拟南芥在完全相同的条件下加入Thellungiella［13提供了一个检验这一假设的独特机会。图1清楚地表明LT的范围₅₀价值观之间并无差异拟南芥而且Thellungiella在不适应的状态下，但那有些Thellungiella(图瓦，萨拉托夫，阿尔泰1号和2号，巴亚努尔)达到低LT₅₀冷驯化后的值。

地理来源纬度与海拔高度之间无显著相关(p < 0.05)₅₀在冷适应之前或之后。然而,LT₅₀ACC与生长季最冷月份记录的平均最低生境温度显著相关，而在冷驯化前未发现这种相关性(图1)2)．

糖和脯氨酸在低温下的积累

在冷驯化过程中，通常可以观察到糖和脯氨酸等相容性溶质的积累[2，3.］．因此，我们测量了葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)、蔗糖(Suc)、棉子糖(Raf)和脯氨酸(Pro)的含量。数据3.而且4结果表明，大多数植株叶片中糖和Pro含量均有较大幅度的增加Thellungiella冷驯化期间的加入。如前所述拟南芥［13，也有一些Thellungiella没有积累特定溶质的物质。例如，雅库茨克在适应后显示出极低的Fru水平，而Dillibrough在寒冷中没有积累任何Pro。

通过相关分析，进一步探讨了这些相容溶质在叶片抗冻性中的功能意义。糖和Pro含量与LT无显著相关性₅₀除Glc外(r =−0.619,p = 0.011)。冷驯化后，只有Suc的内容(图5)5)和Pro(图6)与耐冻性显著正相关(即与LT负相关)₅₀)，而Fru含量呈负相关。也就是说，Suc和Pro的含量在抗冻性强的品种中较高，而Fru的含量在抗冻性强的品种中较高。

因为我们之前也测定过54叶的糖和Pro含量拟南芥登记入册(13]，我们现在可以直接比较相容性溶质在这些物种的驯化耐寒性中的作用(图5而且6)．而Glc、Fru和Suc含量与抗冻性呈显著正相关拟南芥，这只适用于SucThellungiella．然而，这些糖的整体池大小是相似的，尽管有些拟南芥这些植物的Glc含量是其他植物的2 - 3倍。Raf和Pro的差异最为显著。耐冻性最强的驯化品种叶片中Raf含量最高拟南芥入学率是其他国家的几倍Thellungiella登记入册。例如，最耐寒的拟南芥加入(N14)约含有10.5 μmol Raf g^－1FW，而所有Thellungiella添加量小于3 μmol g^－1弗兰克-威廉姆斯。另一方面，Pro水平在Thellungiella比在拟南芥叶片Pro含量与LT无显著相关性₅₀ACC在拟南芥(图6)．一些Thellungiella在非驯化状态下，植株叶片中Pro含量较高(高达18.5 μmol g FW)^－1)。拟南芥冷驯化后加入(高达14.9 μmol g FW^－1)．

多胺含量Thellungiella而且拟南芥登记入册

几项研究的证据表明，多胺可能在植物抗冻性的发展中发挥重要作用(见[30.)。因此，我们测量了所有叶片样品中游离腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)的含量Thellungiella在冷驯化前和冷驯化后的加入(图7)．由于没有发表过关于多胺含量不同的数据拟南芥在这些条件下，我们还确定了9个拟南芥材料中各自的多胺，这些材料跨越了广泛的耐冻性[7，13］．总的来说，Put和Spd的水平基本相同Thellungiella而且拟南芥在一些地区(如dilllibrough和河北)，它们要么在冷驯化过程中增加，要么保持不变;Te-0和Can-0)。而非驯化组的Spm水平要高得多Thellungiella叶片，但在冷驯化期间急剧减少。在拟南芥在驯化过程中，Spm水平普遍较低，仅在少数材料中有所下降。在两种条件下，游离Spd都是主要的多胺。

Put、Spd和Spm含量与LT无显著相关性₅₀NA(未显示)或Put或Spd含量和LT₅₀ACC在Thellungiella(图8)．而Spm含量与LT之间存在显著相关性₅₀ACC在Thellungiella表明较高的叶片耐寒性与较低的游离Spm池大小相关。在拟南芥LT之间无相关性₅₀观察两种条件下多胺池的大小。

Thellungiella被认为是替代模式物种Arabidopsi研究植物抗非生物胁迫的机制。Thellungiella与拟南芥这使得它成为生理学和分子研究的一个有吸引力的候选者[14，21，29］．的主要论点Thellungiella然而，它被认为是一种“嗜极生物”，对各种压力的耐受力比拟南芥．另一方面，研究表明，在不同的品种之间存在着相当大的自然变异拟南芥这导致在不同的环境生长和压力条件下的耐受性不同。6)。这种自然变异在冷适应和抗冻性方面的研究最为广泛[7，8，10，12，13］．因为自然资源也可用于Thellungiella这为直接比较这些物种之间的耐受力范围和适应机制的可能差异提供了独特的可能性。

在目前的研究中，我们第一次比较了天然变化范围的耐寒性拟南芥而且Thellungiella．我们从耐冻性的广泛重叠中得出结论，至少在这一性状方面Thellungiella不应该被认为是极端微生物。然而，它的耐冻范围可以延伸到比塑料更低的温度拟南芥大约三分之一的可用Thellungiella比任何材料都更耐寒拟南芥加入。的驯化耐寒性Thellungiella与生长季最冷月份录得的平均最低生境温度正相关，与拟南芥［7，12］．

只有育空的耐寒性才加入Thellungiella曾在文献中报道过[16］．LT₅₀在评估全株存活率时，记录了非驯化植物的- 13°C和冷驯化植物的- 18.5°C。这些温度远远低于我们从电解质泄漏测量中得到的−6.4°C (NA)和−11.7°C (ACC)。但对应的电解液泄漏数据[16表明温度范围与我们的结果相似，尽管没有LT₅₀给出了数值。另外，由于没有直接的比较拟南芥提出，本文对物种间的比较尚存推测。

从这里提出的比较，我们认为尽管Thellungiella就耐冻性而言，可能不是嗜极菌，它在冷驯化后的耐冻性范围显然超出了拟南芥．因此，我们认为Thellungiella一个有用的附加模型物种，以确定优越或替代的耐寒机制。

在寒冷的环境中拟南芥时，代谢组的组成发生强烈变化(见[1)。几种代谢物的池大小增大，不同品种的冷反应代谢组存在显著差异拟南芥登记入册(7，31，32］．Glc、Fru、Suc和Raf四种糖的叶片含量与叶片耐寒性呈显著的线性相关[8，11，13这些糖也在一小组代谢物中被发现，可以用来预测几种植物的耐寒性拟南芥准确性高的基因型[32］．此外，虽然叶片Pro含量在冷驯化过程中也有所增加，但在此前调查的54份材料中，叶片Pro含量与抗冻性无相关性[13Pro也不在预测代谢物之列[32］．

目前的数据表明，这五种相容溶质之间的作用可能有显著差异拟南芥而且Thellungiella．蔗糖中，仅Suc与驯化耐冰性呈正相关，而Fru与驯化耐冰性呈负相关。此外，Thellungiella入学没有积累Raf到相同的程度Arabidopsi年代。相反,Thellungiella在冷驯化过程中积累了大量的Pro，我们发现Pro与驯化后的耐寒性显著相关。相容性溶质，特别是Suc和Pro的积累不仅存在于Thellungiella植物在寒冷的环境中。特别是Pro的内容也比中增加了很多拟南芥当植物受到高NaCl浓度的胁迫时[15，33，34这表明在非生物胁迫条件下，物种之间有不同的代谢适应策略。显然，这一假设必须在未来通过代谢组学的方法来验证，使用的是来自这两个物种的适当集合。

在这一点上，我们要强调的是，相容溶质含量的差异不太可能是造成所观察到的耐寒性差异的唯一原因。虽然它的结构耐冻esk1突变体中拟南芥显示Pro在非驯化条件下的高度积累[35]，它还显示了数百个基因表达的变化，因此不可能将较高的耐寒性归因于单一因素[36］．同样，虽然耐寒性在拟南芥与Raf含量密切相关，Col-0中棉子糖合成酶基因的一个敲除突变体导致在冷驯化的叶片中Raf的缺失，而不影响抗冻性[37］．所有这些发现都强调了一个众所周知的事实，即植物的耐寒性是一个多基因的数量性状。此外，目前的数据表明，即使在密切相关的物种，不同的代谢物可能是重要的。

另一类经常与植物耐寒性有关的代谢物是多胺[30.］．它们被认为与植物生长、发育和耐胁迫的许多方面有关(参见[38- - - - - -40)。它们在这些过程中的确切作用还没有完全阐明，但已经证明Put是冷驯化过程中必不可少的组成部分拟南芥［41］．这至少部分是通过调节ABA生物合成的作用介导的。

测定了两种样品中游离多胺的含量拟南芥而且Thellungiella结果表明，并非所有材料在冷驯化过程中Put或Spd的含量都有所增加。游离Put和Spd水平与叶片耐寒性无相关性。其实最耐寒的拟南芥本研究的加入(Te-0)显示两种多胺的池大小均无增加。此外，在所有研究植物中，Put和Spd的总体含量非常相似。只有游离Spm含量较高Thellungiella在不适应的条件下比在拟南芥．然而，在冷驯化期间，这一比例大幅下降，导致在驯化状态下的物种之间的池大小相似。在ThellungiellaSpm含量与LT呈负相关₅₀ACC，表明低水平的Spm可能是有效冷驯化的必要条件。类似的Spm水平下降已经在拟南芥加入Col-0 [41和在小麦中[42对寒冷暴露的反应。然而，这种游离Spm水平降低的功能相关性目前尚不清楚。本研究揭示的Spm含量的自然变化可能为阐明这一现象的分子基础和功能意义提供了有趣的可能性。

而Thellungiella一般认为它是一种耐非生物胁迫的极端微生物，目前的数据表明，这与它的耐寒性是不正确的。然而，一些加入显著地扩大了目前的范围拟南芥，强调…的效用Thellungiella作为一个额外的模式物种。代谢物数据表明，这些亲缘关系相当密切的物种之间存在不同的代谢适应策略，需要使用适当的分析技术进行跟踪研究。

YPL进行了耐寒性实验和脯氨酸的测定，YPL和EZ进行了糖和多胺的测定。收集并提供AB和BdBThellungiella种子。YPL, EZ和DKH设计了这项研究并分析了数据。YPL和DKH起草了手稿。所有作者阅读并批准了该手稿。

我们要感谢Ray Bressan教授(普渡大学，西拉法叶，IN)的发言Thellungiella salsuginea种子收集，德米特里·德曼博士(海德堡大学，德国)为我们收集种子t . halophila(Bayanaul)和Ulrike Seider和Astrid Basner，感谢他们出色的技术支持。YPL感谢瑞士国家科学基金会和马克斯普朗克学会提供博士后奖学金。AB获得了俄罗斯基础研究基金会(05-04-89005-NWO-a)的资助，BdB获得了荷兰科学研究组织(047.017.004)的资助。

从属关系

1. 马克斯-普朗克研究所für Molekulare pflanzenphysiology, Am Mühlenberg 1，德国波茨坦，D-14476

   李杨平，Ellen Zuther & Dirk K Hincha

2. 全俄农业生物技术研究所，俄罗斯莫斯科，Timiryazevskaya St. 42, 127550

   阿列克谢Babakov

3. 阿姆斯特丹自由大学结构生物系，荷兰阿姆斯特丹1085-1087

   伯特·德·波尔

相应的作者

对应到德克·K·欣查．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

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