CrMPK3是一种有丝分裂原激活的蛋白激酶Catharanthus roseus也叫及其在胁迫诱导单萜类吲哚生物碱生物合成中的可能作用

背景

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是植物胁迫信号转导中的重要信号级联。植物中产生的具有生物活性的单萜类吲哚类生物碱Catharanthus roseus也叫已知在几种非生物应激条件下，如损伤，UV-B等诱导。然而，到目前为止，对mia积累中任何信号成分的参与仍缺乏研究。在这里，我们报道了一种新的非生物胁迫诱导物的分离Catharanthus roseus也叫MAPK,CrMPK3这可能在非生物胁迫下mia的积累中起作用。

结果

CrMPK3在细菌系统中表达，是一种活性激酶，表现为自磷酸化和髓磷脂碱性蛋白磷酸化。CrMPK3虽然定位于细胞质，但在损伤时移动到细胞核。损伤，UV处理和MeJA应用c . roseus也叫叶片导致转录本积累CrMPK3以及MAPK的激活c . roseus也叫叶子。免疫沉淀和免疫印迹分析显示，损伤、紫外线处理和茉莉酸甲酯(MeJA)可激活CrMPK3．瞬态过表达CrMPK3在c . roseus也叫叶片组织中MIA关键生物合成途径基因表达增强，特异性MIA积累增多。

结论

我们的研究结果表明可能涉及CrMPK3在非生物胁迫信号转导中，主要的MIA生物合成途径基因转录本的调控，调控因子和主要MIA的积累。

植物为了应对不断变化的环境条件，合成各种各样的次生代谢产物，这些代谢产物不仅作为防御分子，而且有助于其整体的生长和发育。这些化合物的生物合成通常是由各种环境刺激和应激因素诱导的，如紫外线或病原体攻击。Catharanthus roseus也叫(l)G. Don是一种热带植物，合成130多种单萜类吲哚生物碱(MIAs)作为其次级代谢的一部分。其中一些mia具有很高的治疗价值，如抗肿瘤药物长春碱和长春新碱，因此具有很大的商业价值[1］．这些MIA是通过复杂的MIA生物合成途径以非常低的水平产生的，据报道，该途径也是由应激诱导的c . roseus也叫．然而，真菌激发子、重金属离子、紫外线辐射、渗透休克、损伤或病原体攻击等因素可诱导其生物合成。治疗c . roseus也叫茉莉酸甲酯(MeJA)能提高TDC(色氨酸脱羧酶)、STR (Strictosidine合成酶)、D4H(去乙酰氧基vindoline−4-羟化酶)和DAT(去乙酰基vindoline 4- o -乙酰基转移酶)的活性水平，并导致vindoline的积累增强[2］．此外，激发子诱导JA的生物合成和MeJA诱导Tdc而且Str被K-252a阻断，K-252a是一种蛋白激酶抑制剂，表明蛋白磷酸化参与了这种信号转导[3.］．到目前为止，还没有关于在应激反应中生物碱积累的任何信号成分的信息。人们可以推测有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联的参与，因为已知损伤和系统蛋白在番茄植物和自养细胞培养中激活十八碳酸途径上游的MAPKs [4］．在拟南芥中，MPK3/MPK6级联调控camalexin生物合成已有报道[5MAP激酶是细胞外刺激转化为细胞内反应的主要信号级联之一[6］．MAPK级联包括三个功能相连的激酶:MAP激酶(MAPK);MAPK激酶(MAPKK)和MAPKK激酶(MAPKKK)。在外部刺激的诱导下，受体介导MAPKKK的磷酸化和激活。这种活化的MAPKKK通过在丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化激活MAPKK, MAPKK反过来通过在苏氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化激活MAPK [7］．MAPKs已知可被多种生物和非生物激活[6- - - - - -9植物的压力。在哺乳动物和酵母中，MAPK级联在g蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶(RTKs)或双组分组氨酸激酶下游活跃。大多数MAPK底物包括转录因子、转录调控因子、剪接因子、受体、组蛋白等[10］．MAPKs的作用涉及植物的多种生物现象，包括病原体防御、非生物胁迫、细胞质分裂和细胞分化以及植物激素信号传导[7］．

在本研究中，我们报告克隆丝裂原活化蛋白激酶从c . roseus也叫，CrMPK3．CrMPK3的转录本和活性是由已知的诱导生物碱生物合成的相同刺激诱导的c . roseus也叫。的瞬时过表达CrMPK3在c . roesus叶片导致特定生物碱和MIA生物合成途径相关基因转录本上调。我们推测CrMPK3可能在应激介导的MIA积累中起作用c . roseus也叫．

茉莉酸甲酯，紫外线和伤害激活MAP激酶c . roseus也叫

MAP激酶级联在不同植物中调控多种胁迫响应生物过程。为了了解MIA生物合成的信号成分，我们检查了导致MIA积累的条件下MAPK的激活。在c . roseus也叫茉莉酸甲酯处理[2，11]及紫外线[12]及伤人[13]已被证明能促进生物碱的积累。因此，我们利用这三个条件来研究MAPK在c . roseus也叫叶子。用髓鞘碱性蛋白(MBP)作为人工底物，用凝胶激酶法分析从处理过的叶片组织中提取的等量蛋白质。如图所示1，在损伤后15分钟内观察到两种不同的MAP激酶的短暂激活，并逐渐减少。紫外线治疗也会导致治疗后30分钟内激酶活性的增加。在紫外线照射后观察到至少三个MBP磷酸化激酶，而茉莉酸甲酯导致单个MAPK的激活(附加文件)1:图1)．

克隆CrMPK3

在观察MAPK在不同胁迫条件下的活化后，我们尝试克隆MAPK激酶基因c . roseus也叫这可能是调控MIA通路。为此，建立了cDNA文库c . roseus也叫用438 bp的MAPK EST (GenBank登录号为;AJ537469)。经第三次筛选获得的阳性斑块测序，得到了一个630 bp的片段，显示出与创面诱导蛋白激酶(WIPK)烟草attenuata则(ABJ89813)。但该克隆为缺失5 '端的部分基因。为了获得全长MAPK基因，从其他植物MAPK序列的5'端设计了一个前向简并寡核苷酸，这些序列与文库筛选得到的630 bp片段具有高度的同源性。从已鉴定的MAPK部分克隆的3 '端设计反向引物。PCR扩增c . roseus也叫含有5个“简并”和3个“基因特异性引物的cDNA扩增子约1.1 Kb。对扩增子进行克隆和序列分析，鉴定出一个长度为1119 bp编码独特的ORFc . roseus也叫MAPK。因为MAPK基因与烟草WIPK和拟南芥AtMPK3的同源性最高2:图2)我们把它命名为CrMPK3(EF156758)。的系统发育分析CrMPK3(附加文件2)表示它属于A组MAPKs [14]它们参与了病原体感染和非生物应激的信号传递。推导出的氨基酸序列分析表明CrMPK3编码372个氨基酸，蛋白质包含所有11个子域(附加文件3.)，在所有MAPK科中是保守的[15］．在CrMPK3的VII和VIII亚域之间发现了“TEY”磷酸化基序。在网上序列分析显示其分子量约为43 kDa。

重组CrMPK3是一个活性MAPK

为了证明CrMPK3将其完整的ORF克隆到pGEX-4-T2载体上，转化为蛋白酶缺失株大肠杆菌BL21。细菌表达谷胱甘肽s -转移酶(GST):CrMPK3融合蛋白被亲和纯化，并单独用于溶液激酶试验，同时与髓鞘碱性蛋白(MBP)作为底物。重组蛋白显示了自身磷酸化以及MBP磷酸化(图3.A)暗示CrMPK3编码一个活跃的MAP激酶。通过将ATP结合位点CrMPK3上第69个氨基酸残基上的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)而产生的CrMPK3的激酶非活性形式^K69R未能自动磷酸化或磷酸化MBP(图3.A).以MBP为底物，将重组蛋白数量减少10倍，在凝胶激酶实验中进一步分析CrMPK3的活性。正如预期的那样，纯化的融合蛋白活性随着激酶浓度的降低而降低(图3.B)不活跃的形式，CrMPK3^K69R在凝胶激酶试验中无活性(数据未显示)。

CrMPK3在受伤时移动到细胞核

为了了解CrMPK3在植物中的命运，研究人员检查了CrMPK3的亚细胞定位。为此，阅读框CrMPK3与pCAMBIA 1303载体中的绿色荧光蛋白(GFP)相融合。根癌土壤杆菌用此结构变换的应变GV3101进行瞬态变换c . roseus也叫培养三天后在共聚焦显微镜下观察的叶盘。CrMPK3主要沿质膜和细胞质定位于细胞内(图4)．使用甘露醇对细胞进行质解，证实融合蛋白定位在质膜和细胞质中(附加文件)4)．然而，当叶片组织被切割成小块，并在切割5min后在显微镜下观察时，出现了主要分散在细胞质中的GFP荧光的变化(图4)．当10分钟后观察相同的玻片时，发现大部分荧光定位于细胞核(图4)．DAPI染色显示切片中细胞核的位置，与CrMPK3核信号一致(附加文件)5)．然而，也没有CrMPK3^K69R-GFP或GFP单独显示损伤诱导迁移到细胞核(图4)．这表明只有活跃的CrMPK3在损伤激活后迁移到细胞核。这一发现与早期关于MAPK在外界刺激下从细胞质转位到细胞核的报道一致[16］．

CrMPK3表现出损伤、UV和MeJA诱导的表达和活性

自烟草WIPK和拟南芥MPK3以来，CrMPK3的同源同源物在响应各种刺激时表现出酶活性和mRNA水平的增加[17- - - - - -19我们调查了CrMPK3基因也被应激条件诱导，增强MIA的积累。两个月大在体外种植c . roseus也叫植物受到不同的胁迫条件，如伤害和紫外线处理以及茉莉酸甲酯处理。转录水平CrMPK3用northern blot法分析其对胁迫的反应。的水平显著提高CrMPK3在这些治疗的30分钟内记录到转录(图5A).以损伤和MeJA处理为例，30min后转录水平开始下降。但是，紫外线处理水平较高CrMPK3在治疗后2小时内可以观察到转录，然后下降到基础水平。

检查应激是否诱导转录物积累CrMPK3与其活动相印证在足底，采用抗crmpk3抗体进行免疫印迹检测。对叶片进行损伤处理、紫外胁迫处理和茉莉酸甲酯处理，处理后15分钟制备的蛋白提取液用抗磷酸酪氨酸抗体4 G10免疫沉淀。免疫沉淀用抗crmpk3抗体进行western blot分析。与对照/模拟处理样品相比，在损伤、UV和MeJA处理的组织中，抗crmpk3抗体识别出43 kDa MAP激酶的明显激活(图2)5B)。

由于CrMPK3和AtMPK3显示出高度的序列相似性，我们使用市售的AtMPK3抗体(Sigma-aldrich)来评估CrMPK3在应激条件下的活性c . roseus也叫叶子。MAPK ERK1(抗ptepy)抗体双磷酸化活性形式的免疫沉淀和αAtMPK3抗体的免疫印迹显示了与CrMPK3抗体近乎相似的结果(附加文件)6)．此外，当使用αCrMPK3对总蛋白提取物进行免疫印迹时Atmpk3变异系和野生型植物(Col 0)，信号只在野生型植物中观察到(附加文件)7)验证了αCrMPK3抗体的特异性。

损伤、紫外线处理和茉莉酸甲酯对CrMPK3转录本的上调和蛋白的激活促使我们研究这些胁迫对MIA关键通路基因的调控。c . roseus也叫叶片组织经损伤、紫外线处理和茉莉酸甲酯处理后，在不同的时间间隔内收获。从这些组织中提取RNA，对MIA通路的不同基因进行定量实时荧光定量pcr (qRT-PCR)。分析MIA基因Str(Strictosidine合成酶)D4h(Desacetoxyvindoline−4-hydroxylase),Dat(去乙酰vindoline 4- o -乙酰转移酶)和Tdc(色氨酸脱羧酶)[20.］．如图所示5C，所有的处理都导致所有四个MIA通路基因的表达增加。的表达略有增加Str在紫外线处理后观察到。

CrMPK3在细胞中的瞬时过表达c . roseus也叫叶片增加MIA通路基因表达和生物碱积累

的mRNA表达模式CrMPK3关键的MIA通路基因在不同胁迫处理下表现出明显的共同调控。之间的因果关系CrMPK3和MIA通路基因及特异性生物碱，瞬时过表达CrMPK3以及它的激酶非活性版本CrMPK3^K69R在c . roseus也叫用的是树叶。首先，我们证实了转基因在瞬态转化中的存在c . roseus也叫使用基因组DNA PCR(图6A).表达分析显示CrMPK3表达CrMPK3, CrMPK3^K69R与对照叶相比(矢量变换)(图6A, B)，然后检测MIA通路基因的表达(Tdc, Str，D4h，Dat)和积极的监管机构ORCA3(十八卡类反应性蒽醌APII结构域因子3)和抑制因子ZCT1，2，3.(Z盒结合因子1,2,3)在同一样品中进行qRT-PCR分析。结果显示，基因表达明显上调Tdc, Str，D4h，Dat而且Orca3以及降低对Zct1，Zct2而且Zct3在CrMPK3但在CrMPK3中没有^K69R转化叶(图6B)与空矢量变换对照叶相比。如果CrMPK3^K69R转化后的叶子，尽管水平很高CrMPK3mRNA转录量几乎与CrMPK3相当，MIA生物合成途径基因转录量无明显变化(图6B).所获得的数据表明，CrMPK3直接或间接参与了MIA通路基因的上调，并可能与MIA的更多积累有关。

为了进一步了解CrMPK3在应力调节MIA积累中的作用，我们定量了瞬态转化中的一些特定生物碱c . roseus也叫叶子。在空病媒对照和CrMPK3转化叶片中，至少用8-10片叶片进行生物碱定量。估计在真空浸渗72小时后进行。有趣的是，在CrMPK3转化的叶片中发现蛇纹石、长春新碱、长春多林和catharanthine的积累更多(图7)．这一结果进一步支持了CrMPK3在mia积累中的作用。

Catharanthus roseus也叫是一种最重要的药用植物和一些努力，以提高植物的生物碱含量。其中一些包括，使用应激治疗，如伤害，紫外线治疗，重金属诱导或真菌细胞壁成分诱导或激素治疗，如茉莉酸甲酯。这些处理导致MIA通路基因的表达增加和生物碱的大量积累。JA响应Str而且Tdc表达对蛋白激酶抑制剂敏感[3.这表明磷酸化在MIA通路基因的激活中起着关键作用。MAP激酶是一类重要的参与信号转导的蛋白激酶，在生物或非生物胁迫下都起作用;它参与激发子介导的信号转导，导致生物碱的更高积累不能被否决。在本研究中，我们报告了一个全长丝裂原活化蛋白激酶从C. roseus, CrMPK3．推导出的氨基酸序列与WIPK同源性86%烟草benthamiana和LeMPK3Lycopersicon esculentum84%与AtMPK3同源，78%与OsMPK6同源。氨基酸序列分析显示存在11个亚域，在VII和VIII亚域之间有一个TEY基序，典型的MAP激酶。此外,在溶液中gst标记的CrMPK3的激酶实验证实它是一个活性的MAP激酶。

MAP激酶的调控已在转录水平和翻译后水平观察到[21，22］．我们对CrMPK3的研究结果也显示了类似的结果。增强转录本积累CrMPK3观察其对损伤、紫外线照射和MeJA处理的反应。的应力诱导表达CrMPK3在拟南芥(AtMPK3)和其他植物中观察到MPK3在胁迫下的快速表达[23，24］．此外，在番茄中，UV B特异性激活LeMPK3已被报道[18］．值得注意的是，CrMPK3与LeMPK3具有较高的同源性。这些研究表明相近的直系同源物具有保守的生物学功能。

此外，紫外和MeJA激活的MAP激酶可以用单克隆抗磷酸酪氨酸抗体4 G10免疫沉淀[25，26]，经免疫印迹分析与CrMPK3抗体鉴定。结果证实，CrMPK3可被损伤、UV和MeJA处理激活。有趣的是，一个假定的MAPK的激活已经显示出对紫外线的反应c . roseus也叫细胞悬浮培养[27］．UV-B反应假定MAPK活性被发现在刺激中起着重要作用Tdc而且Str基因和catharanthine的积累对紫外线的反应。然而，这种特定的MAPK还没有被发现，编码它的基因也没有被克隆出来。尽管如此，之前显示的MAPK活性[27]不太可能是CrMPK3的，因为它的活性在49 kDa左右，而CrMPK3的活性为43 kDa。有趣的是，我们的凝胶激酶实验显示，对紫外线的反应有多个MAPK的激活。值得注意的是，这项研究[27]进行了使用c . roseus也叫细胞悬浮培养(CSC)缺乏细胞分化，并提供与自然生长的植物完全不同的环境条件。细胞分化被认为是影响MIA基因表达及其积累的重要因素之一[28- - - - - -30.］．不同MAPKs激活的差异可能归因于这些研究中使用的不同类型的生物系统。与此一致的是，在水稻中观察到有关CSC和成熟植株的明显结果[31］．

许多研究报告了MAP激酶活化后转位进入细胞核。ERM (Elicitor responsive MAP)激酶在10分钟内对Elicitor处理的响应已被报道[16］．CrMPK3的核易位对损伤的响应c . roseus也叫与先前的报告一致[16］．MAP激酶被广泛推测直接或间接地与细胞核中的转录因子相互作用以调节基因。在本研究中，活化的MAP激酶在损伤后转移到细胞核中支持MAPKs的功能。

由于MIA的生物合成对环境信号有响应，因此研究了损伤、紫外线处理和茉莉酸甲酯应用对MIA通路基因转录积累的响应。在转录水平观察到MIA通路基因的明显调控。自CrMPK3转录本也表现出了对这些处理的响应，因此研究短暂过表达的影响是值得的CrMPK3对MIA通路基因的影响。c . roseus也叫叶片被瞬时转化CrMPK3采用真空浸渍法和瞬时转化叶片构建的二元结构对MIA通路基因的表达进行了研究。瞬时转化叶片中CrMPK3活性增加。瞬时转化叶片也表现出明显的转录上调TdcDat而且D4h。研究了MIA通路基因阳性和阴性调控因子的转录调控。有趣的是,Orca3,该通路的阳性调控因子表现为上调，而Zct1Zct2而且Zct3MIA通路阻遏因子[32，33)，显示了放松管制。Zcts是锌指型转录因子家族成员，是已知的MIA生物合成途径基因的抑制因子[32］．Orca3是AP2转录因子的成员，是已知的MIA通路基因的阳性调节因子[33］．此外，MIA基因转录本的增加也导致转化叶片中特定生物碱的积累增加。有报道称，两者呈正相关Dat而且D4h相关失踪物品记录及积累C. roseus［34］．转录水平的上调TdcStr,Dat而且D4h正向调节因子的上调和抑制因子的下调可以部分解释。瞬时转化叶片中MIA关键基因转录本水平的提高以及特定生物碱积累的增加表明CrMPK3对MIA生物合成具有积极作用。MAPKs成员在调节防御化合物(如植物抗毒素)中的作用已在拟南芥和水稻中得到很好的证明。在拟南芥中，MPK3和MPK6已被证明可调节乙烯和camalexin生物合成中的多个基因[5，35］．同样，在水稻中，MKK4-MPK3/MPK6级联调控植物抗抗素生物合成的几个基因的表达和植物抗抗素的积累以响应MAMP [36］．

我们目前的研究报告，MAP激酶来自一种重要的药物，c . roseus也叫其直接或间接参与调节单萜类吲哚类生物碱的合成。基于这些发现，CrMPK3可能是一个潜在的候选者，可以用于更好地生产特定的生物碱c . roseus也叫．

在本研究中，第一个MAPK的克隆，CrMPK3来自重要的药用植物Catharanthus roseus也叫有报道。的CrMPK3编码一个活性MAP激酶，含有372个氨基酸，分子量约43 kDa。对CrMPK3氨基酸序列的硅晶分析表明，它具有MAP激酶的所有基本特征，并带有“TEY”磷酸化基序。CrMPK3与MAPK密切相关的系统发育分析表明，CrMPK3属于A族MAPK [14]，与烟草WIPK和拟南芥AtMPK3序列高度一致。有趣的是,CrMPK3显示了紫外线、损伤和MeJA诱导的表达模式，该模式与MIA生物合成途径和MIA积累的许多关键基因和调控因子的表达模式一致(图5) [33，37］．增强表达CrMPK3在上述条件下还体现在其在所有研究条件下激酶活性的增加。CrMPK3在损伤中的作用通过损伤诱导的CrMPK3- gfp的核定位进一步得到证实，而CrMPK3- gfp则定位在细胞质中(图4)．CrMPK3和MIAs的进一步一致性来自于的瞬时表达CrMPK3在c . roseus也叫叶片，这不仅导致主调控因子的表达增加，Orca3以及MIA通路的关键基因，同时也能大量积累蛇纹碱、长春多林、长春新碱、红花素等重要生物碱(图67)．从这些研究中我们推断CrMPK3可能是导致应激诱导MIAs积累的信号转导通路的重要组成部分c . roseus也叫．稳定转基因的未来研究CrMPK3以MIA通路调节器的形式识别CrMPK3的相互作用伙伴，可以进一步揭示信号转导网络。尽管如此，目前的工作是揭示这种模式药用植物复杂信号转导机制的一小步。

植物材料及处理

两个月大Catharanthus roseus也叫在28℃温室条件下，对生长在温室内的野生植物进行了不同胁迫处理。伤害完好的叶子c . roseus也叫使用手术刀片，植物叶片的损伤高达40%。在图中所示的不同时间点，用N液速冻法采集叶片样品₂并保存在−80°C下进行进一步分析。

紫外光C (253 μmol m)对植物进行紫外光处理^－2年代^－1)灯亮两分钟。用茉莉酸甲酯处理c . roseus也叫茉莉酸甲酯(50 μM)，用棉球蘸茉莉酸甲酯溶液。

隔离CrMPK3

的部分cDNA克隆c . roseus也叫MAPK (438 bp)使用特定引物MAPKF1: 5 ' -CTCAAGCTTCTTCGTCATAT-3 '(正向)和MAPKR1: 5 ' - gacagaccacatcaattg -3 '(反向)进行扩增CrMAPKEST (GenBank加入号;AJ537469)。扩增分别在94°C 30秒、52°C 30秒和72°C 30秒下进行，循环使用30次TaqDNA聚合酶(Bangalore Genei，印度)。部分CrMAPK作为探针，筛选λ-ZapII导向的YEc . roseus也叫叶片特异性cDNA文库，获得全长克隆。用斑块杂交法筛选重组斑块。经三次筛选获得的阳性斑块鉴定出长630 bp的部分CrMAPK克隆，缺少5 '末端。利用5 '简并引物和反向特异性引物组合成功扩增了该基因的5 '端c . roseus也叫cDNA为模板。引物序列为5 ' -ATGGYTGATGCWAATATGGGTG-3 '(正向)和5 ' -TTATGCATATTCTGGATTTAGAGCC-3 '(反向)。将扩增后的片段克隆到pGEM-T易克隆载体(Promega)中，进行测序。完整的长度CrMAPK克隆用ORF查找工具(NCBI)进行鉴定。的全长cDNAc . roseus也叫MAPK从c . roseus也叫利用基因特异性引物对(FLMPKF1: 5 ' - atggttgatgcaaatatggg -3 '和FLMPKR1: 5 ' -TTATGCATATTCTGGATT-3 ')在PGEM-T Easy vector (Promega)中克隆并测序。

GST融合蛋白的制备

完整的长度CrMPK3表达载体pGEX-4 T-2克隆于Bam你好,Xho我限制网站。用1 mM异丙基硫代-β- d -半乳糖苷酶(IPTG)诱导GST-CrMPK3融合蛋白大肠杆菌胃俞。融合蛋白使用谷胱甘肽珠(GE Healthcare)按照制造商的说明进行纯化。

激酶失活的GST-CrMPK3融合蛋白的生成

激酶失活的GST:CrMPK3融合蛋白是通过突变一个保守的赖氨酸(K)在69^thCrMPK3与精氨酸(R)的atp结合域的残基CrMPK3诱变引物对(5 ' -ATGGTGGCGATTAGGAAAATAGCT-3 '和5 ' - agcttttcctaatcgccaccat -3 ')在pGEX-4 T-2中作为模板。PCR扩增在94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 5分钟，30个循环，最终扩增在72°C 10分钟。PCR产物用DpnI和消化产物在蛋白酶缺乏时发生转化大肠杆菌菌株BL-21 (DE3)。通过测序验证了点突变K69R。纯化的GST:CrMPK3^K69R是按照之前提到的相同的方法获得的。

凝胶激酶测定

凝胶内激酶活性如前所述[26］．20 μg总蛋白在含有0.1%SDS和0.5 mg/ ml牛脑髓磷脂碱性蛋白(MBP)的10%聚丙烯酰胺凝胶(Sigma Aldrich)上分离。电泳后，用缓冲液(25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM DTT, 5 mM Na)去除凝胶中的SDS_3.签证官_4,0.1 mM NaF, 0.5 mg ml^－1BSA, 0.1%Triton X 100)，然后在缓冲液(25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM DTT, 5 mM Na中复性_3.签证官₄， 0.1 mM NaF)在4°C过夜。MBP磷酸化通过在20ml反应缓冲液(25 mM Tris HCl pH 7.5, 2 mM EGTA, 12 mM MgCl)中培养凝胶进行₂， 1mm DTT, 0.1 mM Na_3.签证官₄1 μM ATP和50 μCi的γ32P-ATP (3000 Ci mmol^－1)在室温下放置60分钟。凝胶用5%TCA和1%焦磷酸钠洗涤三次，在滤纸上干燥，并在磷成象器中自放射(台风，GE医疗)。

溶液激酶试验

GST融合蛋白(5 μg)与5 μg MBP和1 μCi γ-孵育³²p标记ATP在15 μl反应混合物(25 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM MgCl₂， 25 μM ATP, 1 mM EGTA和1 mM DTT)， 30°C, 20分钟。用5× SDS负载缓冲液停止反应，样品在15%的聚丙烯酰胺凝胶上溶解。凝胶在Whatman 3MM纸上干燥，并暴露在x射线胶片上。

蛋白提取和免疫印迹分析

冷冻的叶片组织在液氮中研磨，并在1毫升冰水提取缓冲液(100 mM HEPES -KOH pH 7.5, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM DTT, 10 mM Na)中均质_3.签证官₄， 10 mM NaF, 50 mM β-甘油磷酸，1 mM PMSF, 10%甘油和7.5%PVPP)。提取液离心，回收清上清。将200 μg提取的粗蛋白与1 μg 4 G10抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(Upstate Biotechnology, NY)/ MAPK ERK1双磷酸化活性形式的pTEpY抗体(Cell signaling Technology)孵育在250 μl体积的提取缓冲液中(不含PVPP)， 250 mM NaCl和0.1%(v/v) Nonidet P40。随后加入30 μl protein A-Sepharose (GE Healthcare)过夜，然后在4°C下离心(13000 rpm) 3 min。用提取缓冲液洗涤3次，在5倍负载缓冲液(0.625 M Tris-HCl pH 6.8, 5%SDS, 50%甘油，0.125%溴酚蓝，DTT) 30 μl中煮沸5min。如前所述，反应产物用于蛋白质凝胶印迹分析[38］．CrMPK3多克隆抗体来自印度Gene Care公司定制合成。简单地说，纯化的重组蛋白CrMPK3用于兔多克隆抗体的培养。收集免疫前血清和接种后血清，检测其与免疫前血清和接种后血清的结合能力c . roseus也叫免疫免疫分析中的蛋白质。免疫前血清没有检测到任何特定的蛋白带c . roseus也叫免疫印迹分析(数据未显示)使用1:2000稀释的一抗抗crmpk3。

亚细胞定位研究和瞬态转换构建的生成c . roseus也叫

完整的长度CrMPK3而且CrMPK3^K69R扩增引物中含有以区域我和Spe我分别在正向引物和反向引物中限制位点。对于亚细胞定位结构，反向引物缺乏终止密码子，因此编码区为CrMPK3在与绿色荧光蛋白的阅读框中，反向引物中包含了瞬态转换构造的终止密码子。将扩增子分别克隆到pGEM-T Easy载体中，测序确认。构造是通过消化生成的CrMPK3在pGEMT易向量与以区域我/SpeI，并将切除的片段插入用同一组限制性内切酶酶切的植物二元载体pCAMBIA 1303的相应位点。测序进一步证实了这些结构。

RNA提取和Northern Blot分析

RNA提取和Northern blot分析如前所述[39］．20 μg RNA样品在1.2%变性琼脂糖凝胶上分离，并使用标准程序在hybond - n14膜上进行印迹(GE, Piscataway, NJ, USA)。预杂交和膜杂交在60°C的改性church缓冲液(7%SDS, 0.5 M NaPO4, 10 mM EDTA, pH 7.2)中进行。印迹与α-杂交³²p - dcttp标记的全长cDNA克隆CrMPK3．印迹在2XSSC和0.1%(w/v) SDS中在室温下洗涤10分钟，然后在0.5X SSC和0.1%(w/v) SDS洗涤缓冲液中在60℃下洗涤10分钟。将膜暴露在柯达X-OMAT胶片上，分析信号。

实时定量PCR (qRT-PCR)分析

用LiCl法从浸润叶片中提取总RNA [39]并用10个单位的RNase free DNase 1 (Takara Bio Inc.， Japan)处理以去除基因组DNA污染。5微克总RNA使用Power Script逆转录酶按照制造商使用低聚(dT)引物的程序进行第一链合成。qRT-PCR方法如前所述[20.，40］．对反应的十分之一进行PCR扩增。用于不同基因qRT-PCR分析的引物对在附加文件中有提及8:表1。

的瞬态变换c . roseus也叫真空浸渍叶片

CrMPK3 / CrMPK3^K69R在二元结构中用于转化的感受态细胞根癌土壤杆菌应变GV3101。六片嫩叶c . roseus也叫被浸泡在重组的悬浮液中农(OD₆₀₀=2) MMA (0.43%[w/v] Murashige和Skoog碱性盐混合物[Sigma, Deisenhofen, Germany]， 10 mM MES [pH 5.6]， 2%[w/v]蔗糖，200 μM乙酰丁香酮)，在真空泵产生的负压下孵育30 min。用空载体悬浮液浸润的叶片作为阴性对照。浸入后，将叶子在自来水中简单清洗一下，然后用纸巾擦干，以去除多余的液体。将叶片放在塑料托盘中的湿Whatman纸上，密封，并在25°C的植物室中培养60小时，光周期为16小时。

总生物碱提取及高效液相色谱分析

生物碱提取和HPLC分析如别处所述[34］．简单地说，从干燥的叶子样本中提取总生物碱遵循前面描述的方案[41］．主要吲哚类生物碱的色谱分离c . roseus也叫在二元梯度流动相剖面的反相C18色谱柱上进行[42］．化合物的鉴定是基于保留时间和紫外光谱与真实标准品的比较。在甲醇(0.25 mg ml)中制备不同的真实样品(catharanthine, vindoline, vinblastine，蛇纹石)溶液^－1)，用于制备不同浓度的校准图，线性范围为0.25 ~ 25 μg。每个组织平行重复3个重复定量分析，计算均数和标准差。

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

惩罚:

甲基jasmonate

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

MAPKK:

丝裂原活化蛋白激酶

MAPKKK:

丝裂原活化蛋白激酶

MBP:

Mylein碱性蛋白

米娅:

单萜类吲哚生物碱

紫外线:

紫外线。

SKR, MJ, AHS, PS感谢印度科学与工业研究委员会，DPW感谢大学拨款委员会，而BR和SKJ感谢印度生物技术部的奖学金。这项工作得到了印度生物技术部印度新德里国家植物基因组研究所的核心资助。

从属关系

1. 印度国家植物基因组研究所(NIPGR)， Aruna Asaf Ali路，印度新德里110067

   Susheel Kumar Raina, Dhammaprakash Pandhari Wankhede, Monika Jaggi, Pallavi Singh, Siddhi Kashinath Jalmi, Badmi Raghuram, Arsheed Hussain Sheikh和Alok Krishna Sinha

相应的作者

对应到阿洛克克里希纳辛哈．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SKR完成大部分实验并起草稿件，DPW进行IP和凝胶激酶分析并帮助起草稿件，MJ和SKJ帮助定量实时PCR (qRT-PCR)分析，PS帮助构建制剂、共聚焦显微镜和培养拟南芥突变株，AHS帮助共聚焦显微镜工作，BR帮助western blot分析。AKS构想了这个想法，设计和协调了实验，并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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