识别新型MicroRNAgydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba以及对目标的计算预测gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物对外界刺激的反应是通过基因表达的精细调控，部分由小rna保证。其中，microRNAs (miRNAs)起着至关重要的作用。它们通过靶向靶信使rna (mrna)的切割或翻译抑制负调控基因表达。在gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba众所周知，环境和收获压力会影响天然橡胶的生产。本研究旨在鉴定与非生物胁迫相关的miRNAsgydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba使用下一代测序和生物信息分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

利用Solexa技术对遭受严重非生物胁迫的植株进行小rna的深度测序。通过结合LeARN管道，来自植物microRNA数据库(PMRD)和gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba我们鉴定了已经在其他植物物种的48个保守的miRNA家庭，10个小型miRNA家庭识别了48个保守的miRNA家庭。结果表明，除七个家庭外，miRNA是24个核苷酸的最丰富的大小。severalgydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因产生20-22个核苷酸和23-27个核苷酸。为保守和推定的新的MiRNA家庭检测到两种miRNA级尺寸，表明其功能性二元性。使用保守和新的miRNA序列扫描EST数据库。miRNA靶标准预测和分析。介绍了所涉及“刺激刺激”和“抗氧化”和“转录活动”的预测目标。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

小rna的深度测序结合转录组数据是一个强大的工具，用于识别保守的和新的miRNAs时，完整的基因组尚未可用。我们的研究为进化研究提供了额外的信息，并揭示了潜在的氧化还原状态控制的特定调节gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba是天然橡胶的唯一商业来源，是亚马逊盆地的热带多年生物种。东南亚国家在2010年生产的1000万吨天然橡胶中提供了92％，但在全球范围内的需求需求需求增长促进了增强的树木生产率。这一目标越来越多地成为相应研究活动在全球气候变化和粮食作物的土地的重新分配中的关键挑战。天然橡胶是在位于专用乳胶细胞的橡胶颗粒中生物合成的CIS-1,4聚异戊二烯聚合物。胶乳细胞周期性地从粘合梭中发出，然后吻合以形成脱底板壁龛[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．天然橡胶是由攻收获。乳管的含橡胶粒子的30〜50％的细胞质中，然后，由保持在软组织树皮高膨压排出。乙烯发生器，2-氯乙基膦酸（乙烯利），被施加到面板攻丝刺激胶乳的生产。乙烯利增加胶乳流的持续时间敲击和它的两个分接[之间再生后gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．抽头板干燥(TPD)是一种生理疾病，在橡胶种植周期的30年里每年造成10-40%的橡胶生产损失。这种由氧化应激引起的生理紊乱，部分是由过度的环境和收获应激引起的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．乳胶细胞中活性氧(ROS)的生成导致橡胶颗粒的原位凝固[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．植物中ROS的研究最初只关注其细胞毒性，但现在ROS也被认为是信号分子[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．活性氧信号网络出现，并在所有需氧生物中保持保守[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．ros清除系统既能维持氧化还原稳态，又能保护细胞成分免受氧化损伤。生物和非生物胁迫，如干旱、盐度、强光、温度、重金属、紫外线辐射、大气污染、机械伤害、营养饥饿和病原体攻击是植物中ROS的主要来源[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MicroRNAs (miRNAs)尤其在对非生物胁迫的反应中发挥关键作用(综述见[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba])。事实上，小rna参与微调基因表达对生理、外部和发育刺激的反应[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．其中，mirna已经被证明是存在于动物、植物和病毒中的一大组内源性小rna。自从他们在gydF4y2BaCaenorrhabditis线虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba2002年[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba， mirna已经被描述为通过靶向特定信使rna (mRNAs)进行劈裂来负调控基因表达[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba或翻译抑制[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．microrna的生物发生已经在植物和动物中得到了充分的描述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．简单地说,一个gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因首先被转录到初级的miRNA（初级miRNA）通过RNA聚合酶II中，70-500个碱基长初级miRNA形成其通过RNA酶III样DICER样I（DCL1），以产生的miR前体加工的不完全配对的发夹（的pre-miRNA）gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．通过DCLI进一步切割pre-miRNA，释放出一个miRNA/miRNA*双工。然后，这种双分子通过植物同源物到出口素5 [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba])， 20-22个核苷酸的典型成熟miRNA被选择性地纳入与Argonaute 1 (AGO1)相关的rna诱导沉默复合物(RISC)。在RISC复合体中，miRNA与mRNA结合，通过miRNA与mRNA之间完美或近乎完美的互补作用抑制基因表达[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在植物中，最近的发现gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba同时产生规范miRNA(20-22核苷酸)和长miRNA (lmiRNA, 23-27核苷酸)的基因表明它们的双功能[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．lmirna来源于gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因由DCL3选择性地处理，可以与前一个目标源于4，并在其一些目标基因座中引导DNA甲基化gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba在大米和苔藓中[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．最近和主要由miRNA前体的转录后修饰所扮演的角色的发现强调了miRNA的生物合成的复杂程度和方式的miRNA行为[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．事实上，在miRNA前体的3'端添加寡聚尿苷尾是一种控制小鼠miRNA产生的机制[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在植物中，有报道称，miRNA的5'缺失和3'尿苷化结合，或RNA编辑事件，改变了Argonaute关联的靶向性和偏好[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．已经描述为高盐度，干旱和低温调节或下调几种miRNA [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．此外，mirna靶向基因gydF4y2Ba铜锌超氧化物歧化酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaCuZnSODgydF4y2Ba)，在维持氧化还原稳态中起主要作用，在无压力条件下被miR398切割gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

目前，已有15172个成熟的mirna被发现并储存在公共数据库miRBase(发布16,2010，gydF4y2Bahttp://www.mirbase.orggydF4y2Ba) [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba植物MicroRNA数据库(PMRD)中有9277个成熟植物mirnagydF4y2Bahttp://bioinformatics.cau.edu.cn/pmrd.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．大多数mirna已经在模式物种中被鉴定出来，例如gydF4y2Ba拟南芥，水稻gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，gydF4y2BaPhyscomitrellagydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba［gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，其基因组已被测序。一些MiRNA也被识别gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba［gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，gydF4y2Baarachis hypogaea.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba芸苔栗鸟gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]在大戟属中gydF4y2Ba萝藦gydF4y2Ba［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．第二十三条miRNA家族在预测gydF4y2Ba萝藦gydF4y2Ba在四种大戟科植物(gydF4y2Ba蓖麻，麻疯树，木薯gydF4y2Ba和gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．然而，使用的策略不允许彻底鉴定miRNA家族gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

大量收集的可用性gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba表达序列标签;gydF4y2Bahttp://bassigny/cgi-bin/esttik_dev/quick_search.cgigydF4y2Ba)和下一代测序技术为理解胁迫反应和乳胶生产中涉及的关键功能的转录后调控提供了前景gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba．这项研究涉及到对来自gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba在各种条件下生长的植物。本文报道了48个保守的miRNA家族的鉴定结果，这些家族与其他物种中已知的同源性非常高。鉴定了9个家族的MiRNA前体序列。此外，还鉴定了10个推测的新miRNA家族及其前体。扫描gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba使用miRNA序列的EST数据库揭示了他们推定的目标。其中，提出了对刺激，ROS-清除系统和转录调节的预测目标，并对氧化还原地位的控制进行了新的见解gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba提出。gydF4y2Ba

小rna的分类gydF4y2Ba

通过Solexa测序，从受各种非生物胁迫的幼年和成熟植物材料汇集而成的小RNA库中，共获得4223,792条原始reads(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在删除适配器后，清除的读取总计为2,378,135个序列，对应于670,645个唯一序列。序列长度从17到32个核苷酸不等。尽管一些小rna在我们的数据集中出现了大约1000次，但大多数只进行了几次测序。仅包含一个或两个reads的小rna分别占干净序列的32%和53%。gydF4y2Ba

注释的gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba爆炸上的小rnas试图了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组。大多数序列没有映射到gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组序列。在映射序列中，没有注释26,721。注释序列预测了6,618种MRNA降解产物，6,800个可转换元素，399 rRNA，138份伪降解，73个NCRNA，39个TRNA，5个SN / Snornas和57 miRNA对应于14个家族。gydF4y2Ba

利用PMRD数据库中所有miRNA序列进行进一步的定位。总共有18,430个序列与其他物种的保守mirna匹配(0或1个不匹配)。研究结果分为48个miRNA家族gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．由于大多数序列不能映射到PMRDgydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba使用LeARN管道扫描EST数据库。基于茎环结构，这一策略又鉴定了10个miRNA家族，这些家族在其他物种中没有被描述过(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．670,645份独特种质的分布显示，丰富度最高的种质的核苷酸序列依次为27、19、24、26和17个(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．含有17和19个核苷酸的加入来自mRNA劣化和转换元件的产品，根据绘图结果gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组序列（数据未显示）。gydF4y2Ba

保守和推测的新miRNA家族的特征gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba

保守的和推测的新mirna的Reads根据其核苷酸长度分布(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．48个保守的miRNA家族大部分有24和23个核苷酸(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对于10个推测的新miRNA家族，最具代表性的长度是24、27和26个核苷酸(图)gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在48个保守的miRNA家族中，有12个以超过1000个reads为主，其中3个家族显示超过20000个reads。后者对应于HbmiR159/319和HbmiR408(图)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．相比之下，36个家庭在数据集中较少出现，其中18个家庭的reads数小于100，分别是:HbmiR1310、HbmiR162、HbmiR168、HbmiR1863、HbmiR2118、HbmiR2910、HbmiR2914、HbmiR2915、HbmiR2916、HbmiR393、HbmiR394、HbmiR395、HbmiR399、HbmiR444、HbmiR476、HbmiR482、HbmiR828和HbmiR845(图)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对长度分布的详细分析gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2BamiRNA家族显示出一些差异(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．首先，分别对保守和新miRNA家族的20-22和23-27核苷酸大小进行了检测。其次，除了HbmiR169(27个核苷酸)、HbmiR2911(26个核苷酸)、HbmiR482(25个核苷酸)、HbmiR472(25个核苷酸)、HbmiRn8(25个核苷酸)和HbmiRn9(27个核苷酸)外，mirna的丰富度最多为21-24个核苷酸。第三，推测的新mirna出现在少于500个reads的低水平，而HbmiRn1和HbmiRn2的水平极低，只有三个序列(图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

检测miRNA序列中的单核苷酸突变gydF4y2Ba

对于所有的保守miRNA家族，基于[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在美国，有17个家族受到RNA编辑事件的影响，9个家族受到5'缺失和3'尿苷化修饰(以下称为-1 + UU修饰)的影响。在gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba，在十七个家庭中，四个家庭显示在转录后RNA修饰的部位的单核苷酸突变gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，即AtmiR156、AtmiR159a、AtmiR164a、AtmiR172agydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．与此相反，未发现-1 + UU修饰gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

鉴定保守的和推测的新miRNA家族的前体转录本gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba转录组gydF4y2Ba

保守的和假定的新的miRNA前体在gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba使用LeARN管道克隆从不同器官获得的PB260转录本序列数据库[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．8个保守的miRNA家族根据RNA序列的映射显示出茎环结构gydF4y2Ba4gydF4y2Ba发现了HbmiR156、HbmiR159、HbmiR396、HbmiR476和HbmiR2910家族的单一miRNA前体转录本。鉴定出HbmiR166、HbmiR319和HbmiR408家族的两个miRNA前体转录本。此外，LeARN管道预测了10个假定的新mirna及其独特的前体(表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba将小RNA数据集的序列映射到前体序列上，可以识别出所有8个保守家族(HbmiR156、HbmiR159、HbmiR166、HbmiR319、HbmiR396、HbmiR408、HbmiR476和HbmiR2910)的miRNA*，以及5个公认的新家族HbmiRn3、HbmiRn4、HbmiRn8、HbmiRn9和HbmiRn10。茎环反转录聚合酶链反应(RT-PCR)成功地对7个保守家族的前体和9个假定的新家族的前体进行了检测(图)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

比较保守和推测的新miRNA家族预测靶点的基因本体论分类gydF4y2Ba

通过对miRNA靶点的计算预测，鉴定出48个保守miRNA家族的1083个序列和10个推测的新miRNA家族的705个序列。利用基因本体论(Gene Ontology)对其参与的生物学过程及其分子功能进行了分析gydF4y2Ba7 a, B, CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba7D.gydF4y2Ba)．对于保守的和推测的新miRNA家族的预测靶标，大多数GO项以相同的比例表示。推测的新miRNA家族的靶基因均具有生物过程和分子功能的保守miRNA家族的GO项。在生物学过程方面，假定的新miRNA家族有两个额外的术语(生长，细胞壁组织或生物发生)。在一些GO术语中，新miRNA靶基因的数量比保守miRNA的数量要少:细胞过程(25%对27%)、代谢过程(22%对27%)和生物调节(10%对12%)(图)gydF4y2Ba7AgydF4y2Ba和gydF4y2Ba7C.gydF4y2Ba)．与细胞成分组织(5%对3%)、定位(7%对4%)和刺激反应(10%对8%)的保守靶点相比，假定的新miRNA靶点的这个数字更大(图)gydF4y2Ba7 a, B, CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba7D.gydF4y2Ba)．至于用于分子功能的氧化石墨烯术语，尽管两类mirna的抗氧化活性分布相同(1%)，在推测的新miRNA家族中，观察到转录调节活性的比例下降(4%，而非7%)，结构分子活性增加(4%，而非2%)和转运蛋白活性增加(7%，而非4%)(图)gydF4y2Ba7B.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7D.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

比较参与“刺激反应”、“抗氧化”和“转录调节”活动的保守和假定的新miRNA家族的预测靶基因gydF4y2Ba

由于氧化应激的管理对橡胶生产至关重要，我们着手更有效地了解氧化还原稳态的机制。因此，根据GO注释，我们优先预测参与“刺激反应”(生物过程)和“抗氧化”和“转录调节”(分子过程)活动的mirna靶向基因(见表)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

HbmiR156、HbmiR159、HbmiR172、HbmiR393、HbmiR395、HbmiR396和HbmiR408是AP2/ERF结构域转录因子家族的12个成员。两个HD-ZIP III结构域的蛋白成员(HbmiR165/166, HbmiR172)，一个bZIP结构域的转录因子(HbmiRn4)，三个NAC结构域的蛋白(HbmiR164, HbmiR165和HbmiRn7)，三个Squamosa启动子结合蛋白(HbmiR156/157)，四个WRKY转录因子(HbmiR156/157, HbmiR390, HbmiR444)，四生长素反应因子(ARF);HbmiR160和HbmiRn5)和5个GRAS家族转录因子(HbmiR170、HbmiR171、HbmiR396和HbmiRn5)也可能被靶向。gydF4y2Ba

编码蛋白质参与蛋白质降解的蛋白质，例如半胱氨酸蛋白酶（HBMIR396）和遍在蛋白蛋白质连接酶（HBMIRN6和HBmirn7），用于分类为“刺激刺激”类别的基因。gydF4y2Ba

还鉴定了与ABA信令相关的三个序列：ABA不敏感的蛋白质（HBMIR166和HBMIR2910）和HVA22样蛋白（HBMIR398）。另外，编码CTR1，乙烯信号传导途径的负调节剂的一个序列由HBMIRN5靶向。通过预测靶向靶向的帽结合蛋白，也突出了miRNA生物生成的突出显示。有趣的是，预计涉及天然橡胶生物合成，HMG-COA还原酶和4-羟基-3-甲基二磷酸还原酶的两种酶分别由HBMIR159和HBMIR444靶向。对于“抗氧化活性”类别，鉴定了几种ROS扫描酶。Cuznsod的叶状塑料和过氧缩体同种型分别由HBMIR398和HBMIR159靶向。预计涉及谷胱甘肽生物合成，γ谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）的另一种酶被Hbmirn5靶向。RBOH（或NADPH氧化酶）是参与ROS生产的酶，其可能由两个miRNA（HBMIR2914和HBMIR476）靶向。此外，还发现，对蛋白质的氧化丁蛋白的氧化还原状态涉及或参与蛋白质的氧化锰状态，例如编码参与木质素合成的蛋白质，形成阴离子过氧化物酶前体和4-作用：COA连接酶。由HBMIR159，HBMIR408和HBMIR398定位。gydF4y2Ba

三个目标的切割位点已经通过实验验证了氯塑料Cuznsod，Squamosa启动子结合蛋白和ARF（表gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．对于这些指标，切割位点位于规范10个核苷酸。gydF4y2Ba

小rna的大小分布gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba可能与其他物种不同gydF4y2Ba

下一代高通量测序技术是鉴定miRNA的有力工具。测序和分析gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba小RNA库产生了200多万次序列。在绝大多数（86％）中，测序的小RNA仅由一个或两个读数代表。类似地，发现了65％的独特miRNA序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba454测序技术[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．有趣的是，我们发现gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba小rna与其他物种不同。最丰富的小rna有17、19和27个核苷酸gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba而他们在其他物种的21名24个核苷酸。事实上，在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，gydF4y2Baarachis healob.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]， 24个核苷酸的比例已被证明是主要的，分别占独特小rna的60%、45%和36%。主要的大小已被发现是21个核苷酸gydF4y2BaPinus contorta.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),gydF4y2Ba水松chiniensisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba， 17-核苷酸和19核苷酸小RNA的高百分比是由于响应非生物处理的RNA降解产物和转座元件的数量增加gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组(数据未显示)，如前所述gydF4y2BaBrachypodiumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．事实上，小RNA大小分布的变化已经在gydF4y2BaBrachypodiumgydF4y2Ba对冷敷的反应。在正常生长条件下，21-和24-核苷酸类是最丰富的小RNA家族，而冷处理后是19-核苷酸类[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．我们的数据集是由受多种非生物胁迫的各种组织的小rna汇集而成的。不同类型的非生物应力可能对其大小分布有不同的影响，这可以解释不同的非生物应力对其大小分布的影响gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

长保守和新的23-27个核苷酸的miRNA由短miRNA序列和延伸组成。这个lmiRNA结构表明它们是由相同的物质产生的gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因。我们的观察表明14个规范的双重功能gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因生产20-22个核苷酸和23至27个核苷酸lmiRNA在gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba，即gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ba169，gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ba2911年,gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ba482，gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ba472，gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ba408和gydF4y2BaHBMIR.gydF4y2Ban3-10。在整个植物界，lmiRNA以前被归类为异色小干扰rna (hc-siRNA) [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，从mirna生成位点衍生的hc-siRNA依赖于与AGO4相关的DCL3、RDR2和PolIV，以及一些靶位点的直接DNA甲基化[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．相对于20-22核苷酸的miRNA, 24个核苷酸的阅读量更高，产生20-22 nt和23-27 nt miRNA的14个miRNA家族可能在响应非生物胁迫时主要通过直接DNA甲基化来调节其靶标。这可能证实了最近一项研究的结果，该研究表明，在5个基因中存在位点特异性非生物胁迫诱导的DNA甲基化gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba［gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

古老，最近差异化gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2BaMiRNA提供了进化研究的其他信息gydF4y2Ba

48gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba保守的miRNA家族与其他物种的miRNA家族或多或少相似。在gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba，在40多种植物中发现了5个miRNA家族(HbmiR319、HbmiR156/157和HbmiR165/166) [gydF4y2Ba57gydF4y2Ba[九个对应于胚胎胚胎的古代miRNA（HBMIR156，HBMIR159 / 319，HBMIR160，HBMIR165 / 166，HBMIR171，HBMIR408和HBMIR395），两个在气管囊肿的共同祖先（HBMIR397和HBMIR398）和九个中在初生术的共同祖先（HBMIR162，HBMIR164，HBMIR168，HBMIR169，HBMIR172，HBMIR393，HBMIR394，HBMIR399和HBMIR827）中[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．有趣的是，这项研究发现了所谓的单子叶特异性HbmiR444家族[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．这表明HBMIR444出现在单胶质细胞和双旋晶膜之间的形态之前。还发现了三种木质物种特异性miRNA家庭gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba: HbmiR473 (gydF4y2Ba素类gydF4y2Ba和gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba), HbmiR476 (gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba)和HbmiR479 (gydF4y2Ba白杨，葡萄，陆地棉gydF4y2Ba和gydF4y2Ba素类gydF4y2Ba)，并可能在进化过程中被木本物种独立招募。在这项工作中发现的10个新的miRNA家族可能是最近的gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba多样化，因为他们尚未识别到现在在其他大戟植物中。此外，该信息以前对大戟属物种进行了研究[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，其中仅鉴定出25个保守的mirna。gydF4y2Ba

我们的数据可以用来研究的进化gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因。我们展示了70％的推定性新gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因能够产生23-27个核苷酸的lmiRNA，而保守基因的这一比例为29%gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因。这与我们在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在美国，人们以前认为年轻人gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因在远古时期一直产生sirnagydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因主要产生规范的mirna，表明gydF4y2Ba米尔gydF4y2Ba基因与DCL的使用变化有关，导致特定的miRNA尺寸类[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．此外，还发现了几种所谓的植物特异性miRNAgydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba，如HbmiR1310最初只在gydF4y2BaPinus Taeda.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]、HbmiR2910、HbmiR2914、HbmiR2915和HbmiR2916gydF4y2Ba胡杨gydF4y2Ba［gydF4y2Ba60gydF4y2Ba和HbmiR476gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba［gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．我们的数据表明，这些miRNA不再被认为是物种特异性的miRNA。gydF4y2Ba

我们的研究还揭示了转录后水平的一些保守和不同的机制。实际上，在先前观察到的地点，对某些miRNA系列的miRNA进行RNA编辑事件gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．然而，对于剩下的13个家族，在我们的实验条件下没有观察到RNA编辑。在我们的实验条件下，未观察到-1 + UU修饰gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba选取Ebhardt等人的9个家族[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．一旦gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba基因组序列是可用的，它将有可能进行一个多基因家族成员之间的差异和RNA编辑事件的详尽分析。gydF4y2Ba

预测的靶/miRNA对在植物物种和假定的新物种之间保守gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba

与其他植物相比，它的一些调控机制似乎是保守的gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba，如HbmiR166对HD-ZIP III蛋白的调控[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba， HbmiR156介导的Squamosa启动子结合蛋白[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]， HbmiR164介导的NAC结构域蛋白[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba， HbmiR172介导的apetala2样蛋白[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]， HbmiR169介导的ccaat结合转录因子，HbmiR396介导的半胱氨酸蛋白酶[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．这些古代miRNA规范了祖先的转录因子，坐标高度保守的功能，例如器官极性和分离，细胞分裂或荷尔蒙控制[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．我们预测了潜在的新的miRNA/靶对gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．如HbmiR165和HbmiRn7的NAC结构域蛋白，HbmiR170、HbmiR396和HbmiRn5的GRAS结构域蛋白，HbmiR396和HbmiR444的WRKY结构域蛋白，以及HbmiR156、HbmiR159、HbmiR393、HbmiR396和HbmiR408的apetala2样转录因子等。(Duan等人，提交)。此外,我们还发现新的对参与蛋白质降解(由HbmiRn6泛素蛋白连接酶和HbmiRn7),以应对荷尔蒙(由HbmiR166 ABA-insensitive HbmiR2910 ABA反应元件结合蛋白,由HbmiR398 HVA22-like蛋白质,由HbmiRn5 CTR)和microrna的规定由HbmiR167结合蛋白(帽)。需要进一步的分析来验证这些靶点在转录或翻译水平上的抑制作用，并揭示其中的具体调控gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba关于乳胶细胞对压力的反应和乳胶的生产。gydF4y2Ba

氧化还原稳态的保守和分化调节gydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba

在我们的分析中发现了几种参与活性氧产生或解毒的酶。两种ros产生酶Rboh可能是HbmiR2914和HbmiR476的靶标。它们是ROS信号网络的关键调节器，因为它们整合了不同的信号转导途径，如钙、蛋白质磷酸化和脂质信号与ROS的产生[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．仔细注意还支付给归类于GO术语“抗氧化活性”的目标。对于保守的miRNA，二CuZnSOD的叶绿体和过氧化物酶体同种型预测到的通过HbmiR398和HbmiR159分别靶向。令人惊讶地，胞质CuZnSOD的同种型没有预测由学习管道和，甚至手动，没有正确对准是可能的，HbmiR398。到目前为止，通过5' RACE PCR验证了我们的实验条件下失败。相比之下，以往的研究中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba显示HbmiR398同时针对叶绿体和胞质异构体[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

一些miRNA家族被报道为HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba如OsmiR169, OsmiR397, OsmiR528, OsmiR827, OsmiR319和OsmiR408 [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．在水稻中，OsmiR397靶向参与木质素生物合成的漆酶基因，而HbmiR397也靶向参与木质素生物合成的漆酶基因gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

小rna文库进行了深度测序，以鉴定保守和新颖的miRNAsgydF4y2Ba橡胶树取代巴西橡胶树gydF4y2Ba．结合gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba通过对48个miRNA家族和10个新miRNA的鉴定。我们的研究为木本植物的进化研究和潜在的氧化还原稳态的特定调节提供了新的见解gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．所有可能的目标gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba应力生物学和胶乳的生产将实验验证和靶基因和它们相应的miRNA将经历共表达分析。gydF4y2Ba

试管苗的生产gydF4y2Ba

克隆PB 260的CI05538系的胚性易碎愈伤组织在27℃、60%湿度、黑暗条件下的MM培养基上培养[gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba］．试管植株是根据[gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba］．简单地说，将1克愈伤组织在250 mL的瓶中(含50 mL半固态诱导培养基)继代培养即可启动体细胞胚胎发生。然后在临时浸泡系统(RITA)中发育出亲胚胎gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba， CIRAD，法国)，每天在液体显影介质DEV1和DEV2中浸泡1分钟。在植株再生方面，培养8周后只收集形状良好的成熟胚胎[gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba］．在半固态DEV3培养基上，在60 μmol m的光强下，将其转移到玻璃管中1个月gydF4y2Ba^{－２gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}和12小时光/暗光周期，用于胚胎转化为植物。然后在温室中在28℃下植入植株以60％相对湿度。gydF4y2Ba

植物材料栽培和治疗gydF4y2Ba

无性系PB260的出芽植株和2年生离体植株在27℃、50%湿度、自然光照条件下的温室中生长。无性系PB260出芽植株和2年生离体植株在4°C、光照条件下(PAR = 1000 ~ 1500 μmol/m)处理8 hgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/s处理4 h)、干旱(幼芽4周，2年生离体植株10天，不浇水)、淹水(水覆盖4天)、盐胁迫(300 mM NaCl处理4天)和伤害4 h(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．激素处理在密封箱中施用，用5ppm的乙烯处理4h或用0.3 μM茉莉酸甲酯处理4h，如上文[gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

小rna的分离gydF4y2Ba

对于所有处理，叶片、树皮和根在液氮中取样，然后在-80°C冷冻待小RNA分离。小rna用mirPremier microRNA Isolation Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)按照植物组织的制造商说明纯化。简单地说，将100 mg的植物组织粉与溶解剂混合，释放小RNA，同时，灭活核糖核酸酶和干扰植物组织中可能存在的次级代谢物。大RNA和基因组DNA仍然是不溶的，通过简短的离心将它们与其他细胞碎片一起从裂解液中去除。然后在酒精存在的二氧化硅结合柱上捕获小RNA。用洗涤液去除残留杂质，用不含rnase的水洗脱纯化的小RNA。gydF4y2Ba

小RNA的深度测序gydF4y2Ba

合并来自愈伤组织和对照和治疗植物的小RNA样本。一个gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba小RNA图书馆由Skultech公司（法国）构建。简而言之，在变性15％聚丙烯酰胺凝胶上分离小RNA。切除含有约15-50个核苷酸尺寸的RNA的凝胶切片，并洗脱RNA。使用T4 RNA连接酶连接到5'和3'适配器的小RNA。从第二根连接的产品纯化然后使用PCR逆转录并扩增以产生cDNA。用两种引物进行PCR，其退火到适配器的末端。用溴化乙锭染色在15％聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物。切除含有约92个核苷酸大小的DNA的凝胶切片，并洗脱DNA。使用SOLEXA / ILLUMINA技术（Illumina Inc.，San Diego，CA，USA）测序所得cDNA。使用Trim_Adaptor应用程序（非开源应用程序）修剪原始读取，其中最小夹子长度固定在6个核苷酸。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

这项工作得到了SouthGreen生物信息学平台(SouthGreen . CIRAD .fr - UMR AGAP - CIRAD)的高性能集群的支持，该集群由26个计算节点(208个Nehalem核)和通过低延迟Infiniband网络连接的16到存储容量组成。Sun Grid Engine用作工作负载管理器，在不同的计算节点上调度作业。gydF4y2Ba

识别保守的gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2BamicrornagydF4y2Ba

使用交叉匹配软件从Illumina测序获得的原始读取中除去适配器和低质量序列gydF4y2Bahttp://www.phrap.org/phredphrpconsed.htmlgydF4y2Ba;非冗余的数据集使用WU NRDB软件产生的。独特的小RNA序列，然后用的BlastN [比较gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba)对gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组(Phytozome V6)和PMRD数据库[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]gydF4y2Bahttp://bioinformatics.cau.edu.cn/pmrd.gydF4y2Ba从而对小rna进行分类，并识别出成熟的miRNAsgydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba已经在一些物种中被发现。gydF4y2Ba

鉴定gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Bamicrorna的前兆gydF4y2Ba

保守miRNA和推定新颖miRNA前体在PB260转录被确定gydF4y2Bahttp://bassigny/cgi-bin/esttik_dev/quick_search.cgigydF4y2Ba使用LeARN管道gydF4y2Bahttp://symbiose.toulouse.inra.fr/LeARN/release_1;5.0gydF4y2Ba［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，一个检测、聚类和注释非编码rna的平台。根据mirna在茎环结构上的位置将其分为4类。Class 1前体只产生与预测miR和miR*相对应的小rna(即miR周围25 bp区域的小rna:miR*预测区域考虑与DCL作用相关的两个核苷酸悬移);第2类发夹包含预测的miR和miR*和额外的小rna，丰度较低，在该区域以外;第3类涉及仅在小RNA区域上具有reads的前体(3a，至少两个reads;3b，只读一遍);第4类由包含定义小RNA的前体加上预测miR:miR*双链外的低丰度reads组成。最后，第5类含有发夹，其产生的小RNA比预测miR:miR*区域外的定义RNA更丰富[gydF4y2Ba77.gydF4y2Ba］．每个miRNA前体按照[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．具体而言，我们认为占优势，成熟驻留在茎 - 环结构的茎区和20-22个核苷酸之间的范围内具有-25千卡mol的最大自由折叠能量序列gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}．允许MiRNA和miRNA *之间最多六个未配对的核苷酸。miRNA和miRNA *之间的距离在5至240个核苷酸之间。gydF4y2Ba

识别推定gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Bamicrorna的目标gydF4y2Ba

microrna的目标进行的计算识别米兰达工具箱包含在管道使用默认参数(gap_value = 2, mm_value = 1, gu_value = 0.5, score_threshold = 3, min_length_alignment = 20 no_mismatch_positions = 10, 11)与psRNAtarget守恒的microrna其次检查gydF4y2Bahttp://plantgrn.noble.org/psRNATarget/gydF4y2Ba(length_alignment = 18)， [gydF4y2Ba78.gydF4y2Ba］．对于推测的新miRNAs, psRNAtarget server (length_alignment = 18)和Miranda (gap_value = 2, mm_value = 1, gu_value = 0.5, score_threshold = 3, min_length_alignment = 18 and no_mismatch_positions = 10;被用来扫描gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2BaEST数据库（Duan等，提交，gydF4y2Bahttp://bassigny/cgi-bin/esttik_dev/quick_search.cgigydF4y2Ba)．第一个组装集是由叶片、树皮、乳胶、胚胎组织和根分别读取生成的，以创建组织特异性转录数据库，序列名称为CLxxcontigxx。然后，从所有组织读取数据，生成一个转录序列数据库gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba克隆PB260使用序列名称HEVEA_454_XXX。gydF4y2Ba

基因本体分析与BLAST2GO计划进行[gydF4y2Ba79.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．使用geneously软件进行比对、BLAST等序列分析[gydF4y2Ba81.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

总RNA提取gydF4y2Ba

采用Sambrook改良的氯化铯缓冲法提取受非生物胁迫处理的叶片、树皮和根的总rna [gydF4y2Ba82.gydF4y2Ba段等[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．将1克新鲜物质磨碎，转移到一个含有30毫升提取缓冲液的试管中，该缓冲液由4 M异硫氰酸胍、1%肌氨酸、1%聚乙烯吡啶酮和1% ß-巯基乙醇组成。均质后置于冰上保存，然后在4℃下10000 g离心30分钟。将上清转移到含有8 ml 5.7 M csl的新管中。在摆动铲斗中进行了89,705度的超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在20°C下保存20小时。丢弃上清液和铯垫，用70%乙醇洗涤RNA颗粒。风干30分钟后，用200 μl无菌水溶解。rna在-80°C保存。gydF4y2Ba

miRNA靶点的实验验证gydF4y2Ba

GeneRacer试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)用于在逆转录前将5'RNA适配器连接到汇集的rna。将得到的cdna作为模板，利用预测miRNA下游设计的基因特异性引物(GSP)进行PCR扩增:靶标结合位点和GeneRacer 5'正向引物。所使用的引物为HbCuZnSODchl R: GGGTAACCAGCAAATGCAAGCAGC, HbARF R: CTTGTGTTGAGTTGCAGCGCG和HbSquamosa R: TGGAGCCTAATTGGCTTCCTTCTGC。第一个PCR产物用巢式GSP引物和巢式GeneRacer 5’正向引物进行巢式扩增。所使用的嵌套引物为HbCuZnSODchl嵌套R: GCAGGGAACAATGGCTGCC, HbARF嵌套R: ATGTTCAGCTCAGTGGACACGG, HbSquamosa嵌套R: TTGTTTGGCACCACGCTTGTGGAAG。PCR产物经凝胶纯化，克隆到PCR2.1 TOPO TA载体(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中并测序。gydF4y2Ba

互补DNA (cDNA)合成和茎环RT-PCRgydF4y2Ba

在cDNA合成之前，我们检查了是否有污染的基因组DNA。如果检测到基因组DNA，则按照制造商的说明使用TurboDNAse (Ambion, Texas, USA)进行DNA酶处理。在40 μL反应混合物中使用4微克无dna rna，使用RevertAid™M-MuLV逆转录酶，按照制造商的说明(MBI, Fermentas，加拿大)。用于茎环扩增的引物见表gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．RT-PCR循环条件为95℃变性2 min, 95℃扩增20 s, 58℃扩增30 s, 72℃扩增30 s，共35个扩增周期，所有引物均通过实时PCR进行验证。实时荧光定量PCR反应混合物由2 μL RT产物cDNA、每5 μM引物各1 μL和3 μL 2 × SYBR绿色荧光定量PCR母混合(LightCycler)组成gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba480 SYBR Green I Master，罗氏应用科学)，6 μL体积。PCR循环条件为95℃变性10 min, 45个扩增周期(95℃5 s, 60℃20 s)，分析熔化曲线，检测PCR扩增的特异性(表2)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．使用来自混合cDNA样品的三份稀释系列10个点产生标准曲线。该标准曲线允许计算引物效率（表gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

mirnas：gydF4y2Ba

microRNA.gydF4y2Ba

TPD：gydF4y2Ba

挖掘面板干燥gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

PMRD:gydF4y2Ba

植物微数据库gydF4y2Ba

DCL1:gydF4y2Ba

RNAse iii样dicer样IgydF4y2Ba

仓促：gydF4y2Ba

植物与出口的关系gydF4y2Ba

RISC：gydF4y2Ba

RNA诱导的沉默复合物gydF4y2Ba

AGO1:gydF4y2Ba

Argonaute 1gydF4y2Ba

est：gydF4y2Ba

表达序列标签gydF4y2Ba

这项工作得到了gydF4y2BaInstitutfrançaisdu caoutchoucgydF4y2Ba．作者感谢GéraldOliver和Maryannick Rio进行技术援助。我们感谢Kuswanhadi博士和Tetty Chidamsari从在Sembawa研究中心（印度尼西亚）种植的树木的乳胶和树皮中的RNA隔离。作者感谢Peter Biggins为他的英语修订。gydF4y2Ba

注:稿件通过后，所有前体和成熟miRNA序列将提交到MiRbase注册中心进行发表gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. CIRAD, UMR AGAP，蒙彼利埃，F-34398，法国gydF4y2Ba

   Virginie Gébelin, Xavier Argout, Worrawat Engchuan, Bertrand Pitollat, Cuifang Duan, Pascal Montoro & Julie LeclercqgydF4y2Ba

2. 泰国通武里蒙库特国王理工大学gydF4y2Ba

   forrawat benchuan.gydF4y2Ba

3. 2 .海南农业科学研究院，海南儋州571737gydF4y2Ba

   翠木段gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba帕斯卡MontorogydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

GV、AX、AW和PB进行了生物信息学研究。AX利用LeARN流水线进行EST装配和管理工作。PB安装了集群，并进行了所有IT更改，以使LeARN程序适应集群。提供的直流gydF4y2BaAP2 /小块土地gydF4y2Ba序列来自gydF4y2Ba橡胶树gydF4y2Ba．GV, MP和LJ起草了手稿。MP和LJ设计了研究项目，并参与了设计和协调。所有的作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文在“生物资源”中央有限公司的许可下公布了这是一个开放式访问条款，分配根据创意公约归因许可证的条款（gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0.gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上无限制地使用、分发和复制，但必须正确引用原作。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba