葡萄莓成熟延迟是由前vsamraison NAA处理诱导的，与生长素和乙烯相关基因表达模式的改变是平行的

背景

生长素是葡萄成熟起始的抑制因子，而乙烯和脱落酸(ABA)是葡萄成熟起始综合征的诱导因子。尽管关于这一主题的信息越来越多，但这些激素之间复杂的相互作用网络仍然难以捉摸。为了阐明这些方面，采用整体方法，在转录组学水平上评估葡萄果实中激素之间的串扰，葡萄果实的成熟进程被施用萘达乙酸(NAA)延迟了一周。

结果

NAA处理导致约1500个基因的转录率发生显著变化，表明生长素也在转录水平上延迟了葡萄果实的成熟，同时其细胞内浓度恢复到稳定状态。用激素测量工具进行的激素指数分析表明，生长素的生物活性浓度是在整个体内平衡恢复过程中达到的。这发生在治疗后的7天内，在此期间，生理反应主要是非特异性的，可能是由于NAA的药理作用。这一假设得到了生长素偶联基因上调的有力支持(GH3-like)和行动(IAA4 -和IAA31-like)。还观察到生长素和乙烯之间的强烈拮抗作用，以及生长素和ABA之间的大量“协同作用”，尽管程度较低。

结论

这项研究表明，在生长素水平改变的情况下，激素之间的串扰涉及多种机制，在激素反应和生物合成水平上都起作用，形成了一个复杂的反应网络。

已知在葡萄果实成熟过程中发生了大量的生理和分子事件，但控制这一关键发育阶段的调控机制仍然知之甚少。成熟的开始(称为vacimraison)伴随着物理(果肉硬度)和化学(糖和风味化合物的积累，花青素的合成和有机酸浓度的降低)水平的重大变化[1，2]，同时对大量相关基因的转录率进行修饰[3.，4]。

生长素、乙烯、脱落酸(ABA)和油菜素内酯(BRs)通过与其他移动信号相互作用的复杂网络，积极参与葡萄果实成熟的调节[qh]5]。有趣的是，在浆果发育早期，生长素的含量最高，然后在成年前迅速下降，两周后就无法检测到[6，7]。另一方面，另一项研究表明，在浆果生长发育过程中，生长素浓度没有显著变化[8]。在几个与成熟相关的生理过程中可以看到，在变黑前应用合成生长素会延迟成熟[7，9，10]，并严重改变与糖代谢、细胞壁翻转和苯丙素生物合成有关的关键基因的转录[11]。其中，编码查尔酮合成酶(CHS)、黄酮3-羟化酶(F3H)， udp -葡萄糖:类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶(UFGT)和MYB转录因子[5，9受到生长素的负面影响。Davies等。[9研究表明，合成生长素BTOA(苯并噻唑-2-氧乙酸)能够通过改变相关基因的表达来改变己糖积累机制。NAA在vvac中的应用也抑制了属于细胞壁结构的基因，如GRIP4编码一种富含脯氨酸的蛋白质，并对ABA代谢产生负面影响[5]。

内源的乙烯、ABA和BRs水平在vsamriison时增加，外源应用这些激素加速成熟阶段的开始，同时刺激花青素的积累，最有可能是通过增强转录Chs, f3h, ufgt，和MYB1基因(8，11- - - - - -14]。这些处理也能诱导浆果对糖的吸收和储存[13]。此外，低剂量的乙烯刺激葡萄果实膨胀，使果肉和果皮细胞伸长，并诱导编码水通道蛋白的基因(AQUAPORIN1和AQUAPORIN2)和细胞壁水解酶/酯酶，如聚半乳糖醛酸酶(PG1)、扩张(前女友)，以及果胶甲基酯酶(中外职业) [12，15]。

由于葡萄中没有成熟受损的突变体，因此研究激素在浆果发育过程中的作用的最佳替代方法是通过外源应用植物生长调节剂来改变特定过程。有关外源激素处理对葡萄转录组的影响的研究主要集中在乙烯[12]，指的是该激素在葡萄果实发育过程中对其生物合成和信号转导的转录调控中起着关键作用。特别是，乙烯处理显示诱导转录ARF8（生长素反应因子),数控（9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶)基因，后者编码ABA生物合成的关键酶[12]。对生长素处理也进行了研究，结果表明，由于刺激编码其生物合成关键酶的基因表达，乙烯含量增加[16，17]和信号转导元件[18]。

为了阐明激素相互作用发生在vsamatison，一个特定的转录组学研究进行了NAA处理的浆果。本研究证实了NAA在转录水平上延迟葡萄果实成熟的能力。这种延迟的持续时间可能与生长素浓度稳定状态的恢复有关。在生长素水平改变的情况下，激素之间的串扰涉及多种特定机制，在激素反应和生物合成水平上都起作用，从而形成一个复杂的转录反应网络。

生化分析

物理(浆果体积)和化学(总花青素含量、可溶性固体浓度、可滴定酸度)参数在对照和naa处理的浆果中进行了评估(图2)1)，以验证治疗的实际疗效。

未处理的浆果在处理后(开花53天后，DAFB)表现出体积的增加，直到达到暂时滞后期(从60到70 DAFB)，在此期间该参数没有显著变化。此后，产量增加，并在收获时达到最大值(110 DAFB)。naa处理的果实在滞后期开始时，其体积显著增加至70 DAFB。此时，处理过的样品的体积大约是对照组的一半。此外，与对照相比，naa处理的果实滞后期(70 ~ 95 DAFB)延长50%以上。此后，体积增加，直到收获时达到(148 DAFB)，与未处理样品中观察到的值相似(图2)1一个)。

对照样品全果花青素含量在滞后期5 d内迅速上升，随后逐渐下降，直至收获(110 DAFB)。在naa处理的浆果中，花青素的积累被显著抑制到几乎检测不到的水平，高达80 DAFB。此后，观察到持续增加，直到收获(148 DAFB)，最终达到与对照组相似的水平(图2)1B)。

对照果实可溶性固形物浓度(SSC)在整个试验过程中不断升高，尤其是在果实生长滞后期。NAA处理对该参数也有抑制作用，与花青素处理相似。事实上，在80 DAFB之前，SSC没有增加，而在此之后，SSC持续上升，在收获时达到与对照相同的值(图2)1C)。

在对照浆果中，在成熟过程中观察到可滴定酸度的不断下降，与苹果酸和酒石酸降解密切相关。另一方面，naa处理的浆果总酸度水平总是明显高于对照，除了收获时的样品，其酸度与未经处理的样品相似。然而，在处理过的浆果中，只观察到可滴定酸度和苹果酸含量之间的明显相关性。此外，NAA处理后立即观察到酒石酸显著增加(65 DAFB)，随后与对照果实相比，酒石酸持续下降，但下降速度较慢(图2)1D)。

差异表达基因及富集分析

通过微阵列实验进行了三次比较。选择比较的样本是为了尽可能多地了解生长素在转录水平上的作用、持续时间以及生理变化和技术相关性方面的影响(见附加文件)1在60 DAFB (N1/C1)条件下，对naa处理的果实和对照果实进行第一次比较，以鉴定生长素处理后3天与对照中v害病发病相对应的基因差异表达。在110 DAFB (N2/C2)条件下，对照未经naa处理的草莓果实的收获情况，分析了naa处理对果实成熟演化的影响。第三个比较(N3/C2)突出了在收获时具有与对照相似的生化和表型参数的处理浆果中存在的转录差异。

在三个比较中，具有显著(P< 0.05)差异表达N1/C1为1511,N2/C2为1016,N3/C2为1136(见附加文件)2)。在N1/C1、N2/C2和N3/C2中差异表达的基因中，分别有239个(15.8%)、289个(28.4%)和74个(6.5%)基因在下调或上调方面表现出至少2倍的倍变变异。值得注意的是，收获时处理的样品(148 DAFB)与110 DAFB的对照相比，几乎完全恢复了转录。

通过对所选基因子集进行的qPCR实验验证了微阵列数据，揭示了相似的表达模式，并通过显着相关性(Pearson系数= 0.77;P= 0.0007)指出它们之间(参见附加文件3.)。

为了对受生长素处理影响的基因进行功能分类，按照bl thgen等人的描述，进行了基因本体(Gene Ontology, GO)项富集分析。[19]和Botton等人。[20.]，在整个数组背景下进行三次比较。从Fisher的精确测试中得到的丰富GO术语的完整列表可以在附加文件中找到4、附加文件5和附加文件6．在第一次比较(N1/C1)中，当a问< 0.05被认为是阈值，尽管与蛋白质合成相关的氧化石墨烯术语(核糖核蛋白复合物、翻译、核糖体、核糖核蛋白复合物生物发生、核糖体生物发生、核糖体结构成分)的代表性明显过高(P< 0.01)。值得注意的是，术语“蛋白质运输”和“蛋白质定位的建立”是那些具有较高意义但代表性不足的术语。在第二次比较(N2/C2)中，很少有项显示出显著性问．然而，考虑到P< 0.01，与细胞壁相关的术语(外包封结构组织、细胞细胞壁组织或生物发生)似乎被过度代表(附加文件)5)。在上一次比较(N3/C2)中，与发育(发育过程、解剖结构发育、多细胞生物发育)相关的GO术语明显过多地代表了问< 0.05。值得注意的是，其中带有显著性的术语P价值尤其丰富的是与1,3-β -葡聚糖(1,3- β -葡聚糖生物合成过程、β -葡聚糖代谢过程、β -葡聚糖生物合成过程、1,3-β -葡聚糖代谢过程、1,3-β -葡聚糖合成酶活性、1,3-β -葡聚糖合成酶复合物)有关的价值。在激素相关术语中，“茉莉酸介导的信号通路”被过度代表。

MapMan分析

为了研究受NAA处理影响的主要代谢途径，采用MapMan分析[21根据选择的差异表达基因进行N1/C1比较P< 0.084，根据qPCR进行的阵列验证分析，这是一个可接受的阈值。选择这个特定的阈值是为了扩大用作MapMan软件输入数据的基因数量。

MapMan指出，在naa处理的浆果中，几种代谢被下调，如涉及细胞壁代谢、碳水化合物、脂质、次级代谢物和氨基酸的代谢，只有光反应途径例外，普遍上调(图2)2)。

研究了与上述生化参数相关的细胞壁和次级代谢仓类别。细胞壁类别包括编码果胶甲基酯酶、内转糖基化酶、聚半乳糖醛酸酶和膨胀蛋白样蛋白的基因(图2)2次生代谢包括编码醇脱氢酶、苯丙氨酸解铵酶(苯丙素和酚类物质途径)和查尔酮合成酶(类黄酮途径)的基因。在这一次生代谢类别中，编码ß-胡萝卜素羟化酶(萜烯途径)和肉桂酰辅酶a还原酶(类黄酮途径)的基因在naa处理的浆果中表现出上调(图2)2)。在所有样品中进行的qPCR实验验证了参与细胞扩增和苯丙素途径的关键基因的表达模式(见附加文件)7)。该验证分析指出所选基因(花青素:CHS1Vv_10010748;CHS3Vv_10004167;F3HVv_10003855;UFGTVv_10004481,MYB31， v17s0000g06190和MYB4Vv4s0023g03710;细胞壁代谢:PG1, Vv_10003791, EX1, Vv_10000426;水吸收:提示,2， Vv_10003817和AQUA1， v_10003711)，与花青素含量和浆果体积动力学平行(图1)，显示出生长素处理的早期抑制效果，随后在收获时恢复，处理过的样品显示出与对照相似的转录水平。

在附加文件中报告了属于每个MapMan类别的具有相应bin代码的基因的详细列表8．

HORMONOMETER分析

为了了解浆果对生长素处理的激素相关转录反应，利用微阵列测量的推定激素指数进行了激素测量分析。这个工具允许描述，在相关(或反相关)，查询转录反应之间的相似性(或不相似性)和转录反应通常评估在某种激素处理，由已知的激素指数在拟南芥中定义。Bonghi等人采用不同的基因子集作为输入，对该工具进行了不同的运行。[22]。亚群是:i)所有激素指数(H)， ii)具有激素特异性反应性的基因(sRG)， iii)编码tf的激素应答基因(tf)， iv)编码tf具有激素特异性反应性的基因(stf)。随着这种分析，平均对数比率(根据加权P对于激素计考虑的8种激素，分别计算生物合成(BS)、代谢(MET)、转运(TR)、感知(PER)、信号转导(ST)和激素反应(HR)类基因的显著性水平(level of significance)。分类依据拟南芥激素数据库2.0 (AHD)网站(http://ahd.cbi.pku.edu.cn/)。这两项分析都是通过微阵列进行的三次比较进行的，所得热图集中在葡萄浆果成熟过程中起主要作用的激素上(即生长素、乙烯、脱落酸和油菜素内酯)(图1)3.)。

拟南芥中激素应答基因的比例在整个转录组的3.8% ~ 9.4%之间(TAIR 10版本;27,416个基因)根据所考虑的激素，而在葡萄中，整个基因集的百分比范围在5.5%到10.1%之间(12X基因组组装，见材料和方法部分)。就葡萄芯片而言(14,562个基因)，激素响应基因的比例与拟南芥相似，范围为4.3 - 8.9%，每种激素的值与拟南芥的计算值相当(见附加文件)9)。因此，当使用葡萄表达数据作为激素计的输入时，可以假设存在最小的偏差，正如最近一项关于桃子的工作所假设的那样[22]。

在与生长素相关的AHD亚类中，编码TR和ST元件的基因发生了显著变化。在第一个比较(N1/C1)中，生长素处理至少在转录水平上抑制了激素的运输，同时其ST元件的显著上调。其他AHD亚型没有表现出任何显著的变化。这些数据与激素测量结果的显著相关性相一致，当分析中只考虑tf时，尤其是生长素特异性tf (stf)，这一相关性更为显著。第二个比较(N2/C2)反映了生长素相关转录反应的典型情况。AHD亚类表明，BS基因被轻微抑制，TR-和st相关基因均显著上调。这可能被解释为一种典型的稳态反应，激素测量结果证实了这一点，这表明生长素靶表达与典型的生长素相关转录反应之间存在普遍的非特异性相关性。在最后的比较(N3/C2)中，AHD分类非常稳定，并且激素测量分析仍然指出对生长素的活跃转录反应，与TFs和sTFs亚群显著相关，表明对激素的反应可能主要涉及生长素特异性转录因子。

关于乙烯，在AHD亚类和激素测量结果方面观察到有趣的数据。就生物合成基因而言，在第二次比较(N2/C2)中发现了较强的上调，而其他两种情况的数据不太显著。在所有比较中，st相关转录均表现出显著的差异，在第一和第二(分别为N1/C1和N2/C2)受到刺激，而在第三(N3/C2)受到抑制。HR基因也有显著变化，除N3/C2外，所有病例的HR基因均下调。当考虑到所有基因和乙烯特异性基因(sRG)时，激素计分析显示在所有情况下都存在强而广泛的反相关。在其他子集(TFs和sTFs)中观察到几乎相反的情况，除了第一次比较(N1/C1)， TFs和sTFs仍然分别显示出反相关和不相关。在N2/C2中，sTFs的相关性强于TFs，而在第三次比较中，没有发现激素特异性TFs的相关性。

编码脱落酸(ABA) BS元件的基因在N1/C1比较中表达下调，而在N2/C2比较中表达上调。在第一次比较中发现编码PER元件的基因存在弱的转录抑制，尽管意义不显著。在st相关基因中发现了与BS相似的转录刺激。激素测量在所有亚群和所有情况下显示普遍相关性，但没有任何aba特异性。

油菜素内酯类在两种分析(AHD亚类和激素测量)中都显示出显著的数据。bs相关基因在三个比较中均有显著差异，且均有下调趋势。编码MET元件的基因也观察到轻微但不显著的变异。在第三个比较(N3/C2)中报道了编码PER元件的基因的下调。与ST相关的基因在N1/C1中下调，在其他病例中明显上调。最后，激素测量分析证明了广泛的反相关，在第二次和第三次比较中，除了所有的tf和stf之外。特别是后一种情况指出了显著的相关性。

生长素、乙烯和脱落酸相关基因的表达

通过qPCR实验验证了生长素、乙烯和aba相关基因的表达模式。就前一种基因而言(图2)4)， NAA处理负向影响色氨酸合成酶-亚基1（TRYPS-like,图4A)，一种参与生长素前体色氨酸生物合成的基因。处理还诱导了负责生长素感知的基因转录本的积累，最高可达95 DAFB (转运抑制剂反应1,tir1样;数字4B)、极性运输(PIN3-like;数字4C)和不可逆共轭(吲哚-3-乙酸氨基合成酶，GH3-like;数字4D)关于信号转导，二辅助/ IAA基因(IAA4-like和IAA31-like;数字4E和F)和生长素反应因子8（ARF8-like;数字4G)在施用NAA后一周(60 DAFB)的处理浆果中表达量上调，而在收获后期及之前，对照浆果中转录本的积累量较高。

ACC合酶（ACS6),ACC氧化酶（ACO2)基因，编码乙烯生物合成的关键酶，在vsamission处理的浆果中被强烈上调(图5A和B)。两个基因编码乙烯受体，即。乙烯不敏感（EIN4-like),乙烯响应传感器1（ERS1-like)，在对照和naa处理的果实中具有相似的表达水平，直到对照(60 DAFB)开始成熟时，未处理的浆果比naa处理的浆果更早地记录到显著的增加(图2)5C和D)乙烯响应因子基因(ERF3-like，ERF-AP2-like和ERF5-1)，参与乙烯反应调节的基因均受到NAA处理的正向影响，尽管时间不同(图2)5E, F和G)。

由于激素测量分析显示脱落酸(ABA)靶点的表达也有一些显著的变化，因此我们也研究了两个ABA相关基因。的9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase3（NCED3)是参与ABA生物合成的关键基因，在naa处理的样品中，处理一周后显著下调(60 DAFB)(图2)5 h),脱落酸不敏感（ABI3)，参与ABA感知，在naa处理的浆果中下调至95 DAFB。此后，naa处理的样品中其mRNA水平达到未处理样品的水平(图2)5我)。

由于生长素的使用而导致的成熟延迟在更年期和非更年期的水果中都有记录[9，23]。在葡萄中，在大量品种中观察到在葡萄变黑之前，在浆果上施用天然或合成生长素(包括NAA)引起的成熟延迟[6，11]。本研究的结果证实，施用NAA后，cv的成熟期明显延迟。梅洛(图1)。所有用于监测成熟进程的参数(特别是浆果体积、SSC和可滴定酸度)，除了在处理过的浆果中出现的初始延迟外，在处理过的和未处理过的水果中都显示出重叠的动力学。这些数据表明，正如Böttcher等人已经假设的那样，生长素处理只是导致了成熟开始的转变。7]。微阵列数据分析也证实了这一观察结果，显示在整个实验过程中差异表达基因的数量在减少(见附加文件)2)。在对照果(60 DAFB)中，MapMan分析清楚地表明，施用NAA下调了参与细胞扩增(细胞壁代谢和水分吸收)和次级代谢的基因，特别是那些负责类黄酮生物合成的基因(图2)2)，与生化分析结果一致。这种抑制作用一直保持到110 DAFB，而此后观察到部分恢复，正如Davies等人已经报道的那样。9]和Jeong等人。[11]。在naa处理的果实(148 DAFB)收获时，与对照果实相比，黄酮类生物合成途径相关基因的转录水平仍有所提高，而细胞壁代谢和水分吸收相关基因的转录水平则完全恢复(见补充文件)7)。这些观察结果表明，NAA在对抗类黄酮积累方面比浆果膨胀更有效，如Böttcher等人所证明的那样。[24]。

在对照和处理过的果实中，决定细胞扩增的基因的转录调控有明显的协调。例1和PG1)和肿胀(即Pip1)，与Cosgrove提出的细胞扩增模型(25]，特别是在治疗后的早期阶段和高达95 DAFB。在这一阶段，NAA处理明显抑制了参与这两个过程的基因，这与浆果体积测量一致，从而反映了浆果膨胀的几乎完全转录控制。此后(在95 DAFB之后)观察到这种趋势的反转和完全恢复到对照的水平，尽管与处理过的浆果在收获时达到与对照果实相同的最终体积的更快的体积增长无关。这可能是由于控制浆果扩张的不同机制，而不是生长素控制的转录，最有可能是在转录后水平，正如之前证明的水通道蛋白的门控行为可受磷酸化、异聚化、pH、Ca的影响^{2 +}、压力、溶质梯度及温度[26]。水通道蛋白运输的调节也可能是调节膜透水性的一种方式。综上所述，这些数据表明，浆果的膨胀过程是在多种调控途径的控制下进行的，这些途径是根据一个明确的发育程序时间顺序进行的。

为了阐明生长素及其与其他激素的串扰在浆果成熟调控中的作用，利用贺尔蒙生物信息学平台对激素相关基因进行了具体分析[27]。这与特定基因类别(即AHD类别)的合并分析相一致。这种方法允许建立一个假设模型来描述NAA治疗后生长素相关反应的情况(图2)4)。NAA的应用导致生长素的过度可用性，很可能被包括合成、分解、结合和运输在内的稳态机制所抵消[28，29]。然而，在60 DAFB时，生长素的生物合成和代谢基因类别在对照和处理样品之间没有显著差异，运输普遍受到抑制，生长素特异性转录反应伴随着信号转导元件的普遍激活。因此，体内平衡机制很可能在治疗后的前7天内就已经被激活。这一假设得到了qPCR表达数据的支持，特别是与GH3-like，IAA4-like,IAA31-like基因(图5D, E, F)。在57 DAFB的naa处理的浆果中，这三个生长素相关基因中的第一个基因的表达量比对照高6倍，然后在60 DAFB时其表达量下降到仅2.5倍，随后不断下降的趋势导致在95 DAFB时与对照测量的水平相同。GH3（格雷琴·哈根基因，特别是属于II类的基因[30.]，编码将IAA与氨基酸结合的酶。有趣的是，最近有研究表明GH3.1在葡萄果实成熟初期，ABA -天冬氨酸的形成中起作用，并对ABA与蔗糖和乙烯的联合施用有积极响应，与成熟过程的控制有关[24]。尽管如此，国际宇航科学院从57 DAFB到60 DAFB，基因表现出良好的相关分化趋势，后者的差异最大，也与naa处理的浆果中它们的最高表达水平相一致。也ARF8-like基因在60 DAFB时显示出最大的差异，激素测量数据表明一个非常活跃的转录控制与生长素特异性反应兼容。这四个基因的表达模式以及激素测量数据和总体生理反应表明，生长素的生物活性浓度是在治疗后7天内发生的稳态恢复过程中达到的，在此期间，生理反应主要是非特异性的，可能是由于NAA的药理作用。在此期间，结合和运输可能导致生长素水平下降，导致成熟开始前的浓度范围相同，从而产生发育障碍。这种阻滞很可能是由生长素初级信号介导的，其主要参与者包括IAAs和东盟地区论坛，正如它们的表达模式所表明的那样。在110 DAFB时，在naa处理的样品中观察到生物合成基因的总体抑制以及编码TR和ST元件的基因的刺激。激素计显示了非生长素特异性的特定基因靶点的激活，尽管它们与生物活性生长素水平相容。在这一阶段，可能发生了次生稳态反应，主要发生在生物合成水平，如上游生长素BS基因的抑制TRYPS-like．如生化参数所示，在110 DAFB内实现的主要转录反应触发了恢复级联反应，该级联反应此后也处于活跃状态。然而，在这个阶段，体内平衡恢复的生物学意义与60 DAFB之前不同。早期的体内平衡反应很可能只是为了从高浓度的生长素中解毒，而发生在110 DAFB时的反应是正常成熟过程的症状，类似于自然成熟开始，在此过程中生长素水平显示出下降[24]。一些生长素特异性靶点，主要是tf编码，被证明在148 DAFB时具有活性，很可能触发基因的转录调控，如CHS1和F3H显示下调(见附加文件)7(A和C)。然而，从生理生化参数可以看出，在这个阶段，由于浆果成熟肯定已经完成，因此整体的转录响应很少。

研究表明，生长素水平和反应的波动与成熟进程有关，并假设了一种可能的机制来解释浆果对NAA处理的反应，但生长素的作用如何与其他激素(如乙烯、ABA和油菜素类固醇)联系起来，这些激素已知可以调节相同的发育过程?

激素测量分析可能有助于解释这方面，特别是考虑到第一个比较(N1/C1)，其中生长素和乙烯之间存在强烈的拮抗作用，在较小程度上，生长素和ABA之间存在实质性的“协同作用”。这两个方面在整个转录指标子集(H)和特定转录指标子集(sRG)上都很明显。NAA对转录的短暂积极作用ACS6和ACO2基因(图5A和B)，已经在其他水果中测量过了[17，31，32]，可能被解释为对生长素处理的二次稳态反应的一部分，如上所述。因此，生物活性生长素浓度特异性诱导的乙烯生物合成的短暂增加将通过激活下游机制来抵消生长素的过剩，在这种情况下，与激素的生物合成有关(即TRYPS基因)，从而将浆果从发育障碍中释放出来。

根据拟南芥乙烯信号模型，受体表达和活性的降低增加了对乙烯的敏感性，而受体表达和活性的增加则降低了敏感性[33]。我们也知道，乙烯受体是合作的，根据相互的，但往往是独特的作用，因此不同的调节乙烯反应，并根据受体复合物的组合给出不同的输出[34]。此外，在拟南芥中，EIN4被证明在乙烯信号传导中具有独特的作用[35，36]和对ers1功能的协同作用，因为它需要在一个环境中保持乙烯不敏感ers1背景(34]。考虑到这些数据，葡萄果实成熟过程中的相关作用可能由假定的AtEIN4在对照和naa处理的样品中，由于相应的基因以成熟依赖的方式表达，在vsami后表达水平增加(图2)5选CERS1-like基因显示了相似的表达模式，尽管移到了前面(图2)5D). Deluc等人也报道了类似的转录行为[3.] Chervin和Deluc [37]与乙烯生物合成的高峰同时出现，这可能与在成年期(因生长素处理而延迟)对激素的较高敏感性相一致，此后在整个成熟过程中，这种敏感性会降低。

生长素对参与乙烯反应的基因的影响非常弱，从AHD和激素测量分析中可以看出(图2)3.)，除了一个ERF5-1基因，在60 DAFB时显著上调(图2)5G)。该基因的表达模式与ACS6，导致假设ERF5-1可能介导生长素诱导的葡萄乙烯生物合成基因的上调．这一假设目前正在进行专门的实验试验，以阐明这两种激素之间的相互作用，这对葡萄果实的发育和成熟至关重要。

虽然NAA处理引起乙烯生物合成和作用的普遍刺激，但对参与类黄酮生物合成、细胞壁代谢和水分摄取的基因转录产生负面影响，这些基因先前被证明与乙烯有关[12，14]，观察到。一些研究在转录水平上考察了生长素和乙烯之间的相互作用，并提出了不同的模型[38- - - - - -40]。考虑到这些信息，NAA的作用可能已经绕过了两种激素之间的初级串扰水平，导致仅激活了一些与乙烯相同的靶标，这些靶标可能属于次级串扰。与这种可能性相一致的是，生长素和乙烯诱导的许多基因的上游调控区域被证明含有假定的生长素反应元件(AuxRE)和乙烯反应元件(ERE)序列，它们分别是ARF和EIN3/EIL结合的位点[39]。未来的研究应该专门针对这方面。

生长素和ABA之间的协同作用的存在是出乎意料的，考虑到之前这些激素在调节葡萄果实成熟中的相反作用[5]。然而，这些数据可能表明，HORMOMETER分析能够揭示以前未被认识到的生长素对aba相关过程调节的选择性，正如Volodarsky等人已经报道的那样。27含有水杨酸和生长素。事实上，本文的数据指出，生长素下调了ABA生物合成相关基因(图2)5H)，而信号转导通路元件基本上不受影响或受到刺激(见附加文件)2)。这些模棱两可的结果在之前的研究中已经被指出，揭示了ABA和生长素信号通路属于一个非常复杂的调控网络，具有意想不到的特征[41]。

考虑到有关葡萄和番茄成熟综合征的激素调节的现有数据，本文组装了一个假定模型，以便更好地理解我们实验中发生的激素串扰(图1)6)。根据这个目前正在验证的工作模型，油菜素内酯(BR)可能通过增加乙烯水平启动导致成熟的级联事件，正如在番茄[42]。众所周知，在葡萄果实成熟开始时，内源性BR水平会急剧增加[8并且在vvac之前，乙烯峰值也是可测量的[43]。此外，一旦催熟被触发，乙烯似乎会抑制br调控基因(Tonutti等人)。，未发表的数据)，从而表明一种可能的反馈机制，通过下游事件的协调，允许综合征的时间进展。根据这一观点，乙烯可能在成熟初期起着核心作用。一方面，它独立而直接地作用于成熟相关过程的激活，例如与细胞壁修饰相关的过程[12]，另一方面，它与ABA合作，间接触发与成熟相关的几种生化变化，如浆果的颜色[14，15]。它还抑制生长素的生物合成，从而使浆果从这种激素施加的发育障碍中解脱出来[7]。当进行NAA处理时，浆果最有可能经历乙烯控制的这种发育转变，这仍然是可逆的。因此，外源处理造成的生长素水平的短暂增加通过抵消乙烯施加的发育控制引起了逆转，从而导致浆果回到vsamision前阶段，随之而来的是成熟进程的延迟。

植物材料及处理

实验是在葡萄l .简历。梅洛浆果采自一个商业葡萄园(Vini e vigne, Monselice PD，意大利)。从50株同质植物(每株2株)中挑选100株进行处理在足底用合成生长素(萘乙酸，NAA, 200mg /L);根据Jeong等人的建议，SIGMA-N640)在与盛开后53天(DAFB)对应的vvac前阶段。[11]。在57、60、70、95和110 DAFB采集处理过和未处理过的整株浆果(见附加文件)10)，要么立即用于生化分析，要么冷冻在液氮中，并在-80°C保存，用于RNA分离和转录组学评估。由于处理后观察到的延迟成熟，从naa处理的束中收集了额外的样品，最高可达160 DAFB。选择148 DAFB的样品事后不仅根据红葡萄颜色指数(CIRG)，而且根据与收获时对照样品相似的生化参数(详见结果部分)，作为处理浆果采收期的代表。在每个时间点，采样三个生物重复进行生化分析，两个进行转录组学评估。根据Carreño等人提出的CIRG指数，每个重复从5到7串收集至少50个浆果。44]在集群内的同一位置(中位数位置)。使用WineScan FT 120多参数分析仪(FOSS，丹麦)评估每个重复的汁液的生化指标(可滴定酸度，pH值，酒石酸，苹果酸，可溶性固体)，同时根据Mattivi等人的描述测定花青素含量。45]。之所以选择比色指标，是因为在成熟起始阶段对单个葡萄果实的基因表达分析表明，色素沉着强度可以被认为是集群内发育阶段的有效指标[46]。

RNA提取，微阵列分析和实时定量PCR

用于微阵列和实时PCR实验的总RNA都是从Rizzini等人报道的-80°C储存的整个浆果中提取的，使用高氯酸盐方法。47]。

微阵列实验采用葡萄AROS V1.0平台(http://www.operon.com)，如Rizzini等人所述。[47]。对以下样品进行杂交:60 DAFB下naa处理的浆果与60 DAFB下未经处理的浆果(N1/C1)， 110 DAFB下naa处理的浆果与110 DAFB下未经处理的浆果(N2/C2)， 148 DAFB下naa处理的浆果与110 DAFB下未经处理的浆果(N3/C2)。对于三个比较中的每一个，使用对应于两个生物重复的靶杂交三个载玻片(至少一个生物重复是染料交换的，除了N1/C1比较，两个重复都是染料交换的，因此四个载玻片杂交)。

原始杂交数据经过质量过滤、背景减去和阵列内归一化处理黄土方法。以上计算都是随包装一起进行的limma和其他R for Mac OS X v2.13.1 (http://www.r-project.org/)。同样的包也被用于通过线性建模方法发现差异表达基因(lmFit)和经验贝叶斯统计(易趣)，两者都在limma［48]。

所有实验程序都符合阵列数据的微阵列实验(MIAME)标准的最小信息[49]。基因表达数据已提交给Gene expression Omnibus (GEO)(登录号:GSE37341)于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

采用总RNA 2 μg、2.5 μM (dT)18引物、M-MLV逆转录酶(Promega) 200单位、RNAguard (Amersham Biosciences) 1单位，在37℃、20 μL的终体积下，90分钟合成cDNA。qPCR一式三份，每个样品有两个生物重复，使用StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)，使用附加文件中列出的特定引物11．根据Botton等对扩增特异性进行评估。[50]。使用StepOne Software version 2.1 (Applied Biosystems)获取、阐述和导出数据，而所有最终计算都使用Simon设计的自动化Excel电子表格Q-Gene进行[51]，采用Pfaffl [52]。基因表达值归一化到管家基因UbiCF（泛素偶联因子;CF203457)已被Castellarin等人使用。[53]，并使用Q-Gene的公式2作为平均归一化表达的任意单位。

微阵列注释和富集分析

通过Blastn算法将AROS V1.0微阵列上发现的寡核苷酸序列与Padova大学CRIBI中心获得的12X基因组组装转录本进行匹配，并在网站上公开http://genomes.cribi.unipd.it/．检索基因本体术语，导入Blast2GO软件v2.5.0 [54]，并透过附件功能增加约16% [55[Botton等人的报道]。[20.]。利用内置的Fisher精确测试函数对每组差异表达基因进行富集分析P≤0.01,FDR校正。

HORMONOMETER分析

荷尔蒙测量仪工具(http://genome.weizmann.ac.il/hormonometer/) [27]采用了Bonghi等人在桃子中采用的相同管道。[22]。由于该生物信息学工具仅接受拟南芥基因表达数据，因此，如上所述，将定位到葡萄微阵列上的探针与12X基因组组装进行匹配，然后，通过将各自的蛋白质序列相互对照(葡萄推断蛋白与TAIR10蛋白)，将后一版本中预测的基因与拟南芥的基因进行匹配。通过这种方法，获得了一个关联“阵列探针-葡萄基因-拟南芥基因”，允许将葡萄基因表达数据与相应的位点名称和假定的拟南芥同源物的Affymetrix探针id相结合，作为激素测量的输入数据。在不同的葡萄基因匹配一个拟南芥基因的情况下，它们的表达值是平均的，只考虑一次。除了在微阵列上发现的整套葡萄基因外，还向贺尔蒙测量仪提交了三个子集:1)具有激素特异性反应性的基因(即不是激素的多个靶点)，2)编码转录因子的激素应答基因(转录因子)，3)编码具有激素特异性反应性的转录因子的基因(前两组之间的交集)。Bonghi等人对激素测量工具的基本功能原理作了简短的描述。[22]。

作者要感谢Angelo Ramina和Aiman Jajo对手稿的有益评论和批判性阅读。本研究由Progetto AGER“SERRES”资助，批准号为2010-2105。

作者指出

从属关系

1. 帕多瓦大学农学、食品、自然资源、动物与环境学院，意大利帕多瓦大学，莱纳罗，意大利，35020

   Fiorenza Ziliotto, Massimiliano Corso, Fabio Massimo Rizzini, Angela Rasori, Alessandro Botton和Claudio Bonghi

2. 意大利帕多瓦大学葡萄栽培与酿酒跨部门研究中心-意大利帕多瓦大学莱纳罗分校，意大利帕多瓦，35020

   克劳迪奥·Bonghi

相应的作者

对应到克劳迪奥·Bonghi．

相互竞争的利益

作者没有任何竞争利益。

作者的贡献

CB和FMR设计了该研究并参与了其设计和协调;FMR和AR采集果实材料并进行微阵列实验;FZ和MC通过qRT-PCR对芯片数据进行验证;CB, AB和MC分析数据并解释结果;CB, AB, AR, MC和FZ撰写论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Fiorenza Ziliotto和Massimiliano Corso对这项工作也做出了同样的贡献。

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