番茄乙烯响应因子的功能分析和结合亲和力为乙烯的植物差分反应的分子碱提供了洞察力

背景

植物激素乙烯参与广泛的发育过程，并介导植物对生物和非生物胁迫的反应。乙烯信号通过线性转导途径作用导致乙烯反应因子基因(ERF）代表植物转录因子中最大的基因系列之一。如何将显着简单的信号通路可以解释对乙烯的复杂和广泛不同的植物反应仍然是一个未答复的问题。在最近释放完整的番茄基因组序列中，目前的研究旨在更好地了解ERF蛋白中的独特特征。

结果

番茄中编码ERFs的28个cDNA克隆(茄属植物lycopersicon)被分离出来，并被显示为9个不同的亚类，其特征是特定的保守基序，其中大多数具有未知的功能。除了能够调节含有启动子的GCC-box的转录活性外，番茄ERFs还被证明在缺乏这种典型乙烯响应元件的启动子上具有活性。此外，数据显示，ERF与GCC-box的亲和力取决于其周围的核苷酸环境CIS.表演元素。位点定向突变表明，侧翼核苷酸的性质可以增强或降低结合亲和力，从而赋予各种erf与目标启动子的结合特异性。

根据他们的表达模式，ERF由于基因在生殖或营养组织中的优先表达，它们可以聚类成两个主要分支。几种番茄的调节ERF乙烯和生长素的基因表明，它们对这两种激素的信号通路之间的会聚机制有潜在的贡献。

结论

数据显示，核心GCC盒序列的侧翼区的区域是ERF选择性地与其靶促进剂结合的识别机制的一部分。ERF组织特异性表达结合它们对乙烯和生长素的响应，使我们对这些转录介质的复杂性和精细调控机制有了一些了解。所有的数据都支持这样的假设，即erf是使乙烯能够以一种高度具体和协调的方式调节广泛的生理过程的主要成分。

据报道，气态植物激素乙烯在多种发育过程中发挥积极作用，包括萌发、花朵和叶子衰老、果实成熟、叶子脱落、根结瘤、细胞程序性死亡，以及对非生物胁迫和病原体攻击的响应[1- - - - - -3.］.乙烯信号转导的组分已被广泛研究，主要在拟南芥模式植物中[4.揭示了一个线性转导途径，导致属于乙烯反应因子(ERF)类型的转录调控因子的激活。乙烯信号通路的最后这些组成部分负责调节乙烯调控基因的转录。虽然乙烯转导途径的简单性不能解释植物对乙烯反应的多样性，但使这种激素以适当的方式驱动不同生理和发育过程的分子机制仍有待阐明。ERF蛋白由植物最大的转录因子家族之一编码，是乙烯信号转导中最合适的步骤，乙烯反应的多样性和特异性可能由此产生。

ERF是trans-植物特有的作用因子，显示与GCC盒特异性结合CIS.-乙烯反应基因启动子区发现的作用元件[5.，6.］.ERF家族是含AP2的域超级家族的一部分，其还包含AP2和RAV系列的转录因子[7.］.AP2家族的特征是存在两个最初在拟南芥同源基因中描述的AP2结构域副本Apetala2.［8.]. RAV家族包含两个DNA结合域，一个结合CAACA基序的AP2样域和一个结合CACCTG基序的B3样域[9.］.ERF型家族进一步分为两个主要亚家族，即ERF和转录因子的CBF/DREB (C-repeat binding factor/脱水反应元件binding factor)亚家族[10都包含一个AP2域。DREB亚家族的特征是在AP2结构域的14位和19位分别存在缬氨酸和谷氨酸，而在ERFs中，丙氨酸和天冬氨酸则在相应的位置保守[10］.已经证明，参与DNA结合的氨基酸残基在AP2和ERFs之间并不保守[11，12］.ERF型蛋白首次在植物对生物胁迫的反应中被分离出来，而DREB蛋白则与非生物胁迫相关。erf已被证明能将乙烯反应基因和dreb中的GCC-box与DRE结合CIS.监管元素。在拟南芥， ERF占总ERF/DREB蛋白的53% [13］.在杨树和水稻中，ERF蛋白占ERF/DREB家族蛋白的54% [13，14而在大豆中占51% [15］.已经进行了对拟南芥和水稻ERF的比较结构分析在网上使用整个蛋白质序列进行系统发育分析[16，17]，或保守的AP2结构域[10，13，以推断ERF家族成员之间的关系。在拟南芥中，ERF亚家族包含65个成员，并根据AP2域的保守性分为5个亚类[13］.ERF结构域首次被鉴定为一个保守基序，包含4个dna结合蛋白中的59个氨基酸烟草［5.]的特征是3 β片和1 α-螺旋，并允许erf与gcc盒结合[5.，11]. 除了对完全保守的GCC基序的要求外，有人认为结合亲和力还可能取决于GCC盒的核苷酸环境以及ERF结合域内某些氨基酸残基的性质[17］.此外，符合数据报告的数据Pti4，一种ERF型转录因子，能够结合缺乏GCC盒的启动子CIS.元(18]最近的研究表明ERF也可以结合不同CIS.-元素，例如VWRE(血管创伤反应元素)[19］.

erf在植物界普遍存在，其功能含义已在各种植物物种和包括激素信号转导在内的广泛过程中得到研究[5.]，对生物[20.，21]和非生物压力[22- - - - - -24]，代谢途径的调节[25- - - - - -28]和发展进程[29- - - - - -31］.表达研究表明，一些ERFs受伤害和盐胁迫等非生物胁迫的调控[17，32，33]，最近的研究表明erf也参与了种子的萌发[3.］.大量研究表明，ERFs除了调控含有GCC-box的乙烯响应基因的表达外，还可以调控茉莉酸和水杨酸响应基因[20.，34，35］.ERF类中不同结构特征的存在表明该家族的不同成员可能显示不同的功能和绑定活动。ERFs的不同结合活性可能代表了乙烯信号以一组特定基因为靶点的方法，从而为观察到的植物对激素反应的组织和发育特异性提供了基础。然而，ERF蛋白的结构表征一直局限于在网上到目前为止，结构/功能关系只被肤浅地处理过[36］.

目前的研究表明ERF番茄中的基因家族被组织成9个由不同的结构特征定义的亚类。基于28个番茄ERF的功能分析，通过测试它们的激活或抑制靶基因的转录活性的能力，数据表明，在共享相同结构特征的ERF蛋白中，功能活性受到保守。此外，数据表明核心GCC盒序列的侧翼区域是ERF选择性地与其靶促进剂结合的辨别机制的一部分。数据也表明了ERF基因显示组织特异性的转录本积累模式，并揭示其调控生长素。

番茄ERF的分离与系统发育分析

番茄ERFcDNA克隆通过TBLASTN搜索初步鉴定[37]在番茄基因数据库(http://solgenomics.net/)，使用AP2/ERF域内的一致序列作为查询序列。根据AP2结构域数量、存在b3样结构域和存在保守氨基酸残基的特点，共发现49个unigenes，其中AP2、RAV和DREB序列被丢弃。采用RACE-PCR扩增方法，获得28个细胞的完整CDSsERFunigenes是主要ERF亚群的代表。随后，基于最近发布的注释的全番茄基因组序列[38是全基因组的在网上通过筛选，可以鉴定出多达146个基因，这些基因编码可能含有AP2的蛋白，分布在77个ERFs、48个dreb、18个AP2和3个RAVs中(表1)1)．由于征询AP2 / ERF域仅被分类为AP2 / ERF域（AP2 / ERF域）10]，我们使用整个蛋白质序列或仅使用AP2/ERF结构域构建了ERF系统发育树。由于AP2/ERF结构域以外的ERF蛋白之间的同源性较弱，因此使用两种聚类方法获得了相同的分类模式（图1） 1)．然而，当10个子类(A到J)定义ERF族拟南芥，只有9个用西红柿表示，它缺少子类I(图1， 桌子 2)．番茄ERF蛋白分布到9个单独的亚类的AP2结构域内的独特基序和氨基酸特征进一步支持了上述每个亚类的分布拟南芥［13]。在缺乏共识命名法和由于缺乏理性命名的小块土地基因在植物物种中,我们试图重命名番茄基因通过给一封信(J)来区分不同的子类和区分成员在同一子类(表3.)．同时遵循拟南芥中最完整的分类[13提出的命名方法更好地阐明了ERF亚纲在不同物种中的对应关系。本文采用的分类与之前提出的番茄erf分类的对应关系[17，39]和拟南芥ERFs [10，13]列于表中2．在这个由Sharma等人2010定义的新提出的分类类XI中，中野(2006)提出了两个子类I和J [13，表明拟南芥亚类I在番茄中没有代表。特别值得注意的是，在拟南芥中，亚类I的成员拥有不完美的AP2结构域，相对于其他亚类而言，它的代表性不足，而在番茄中则缺失。就像在拟南芥在美国，番茄占绝大多数ERF基因(77个基因中有59个)是无内含子的4.)．然而,尽管拟南芥小块土地最多可携带一个内含子，18个番茄内含子基因中有5个含有两个内含子。ERF在拟南芥中的四个亚类中发现了内肠基因，而它们在番茄中的6个亚类分布（表 4.)．虽然西红柿ERF基因可定位于12条染色体上，分布不均匀，1号染色体13个，3号染色体11个5.)．精细映射小块土地在番茄基因组上，这些基因可以单独分布，也可以成簇分布。特别是，染色体1包含5个ERF基因(Solyc01g09300, Solyc01g09310, Solyc01g09320, Solyc01g09340, Solyc01g09370)，它们可能是串联复制事件的结果(表)5.）如邻里文学树的亚组B内的位置所示（图 1)．这里建议的番茄sl - erf命名法与ITAG 2.3命名法(38)之间的对应关系在附加文件中提供1．

番茄ERFs的亚细胞定位

除ERF b外，所有ERF蛋白都显示至少一个典型的核定位信号。1, D.1和H.1缺乏任何可预测的核靶向motif(附加文件2)．由于转录因子的核导入有助于其转录活性，我们通过与35S启动子下表达的YFP产生n端融合(35S:: YFP- erf)来研究这三个番茄erf的亚细胞定位。在烟草BY-2原生质体中的瞬时表达结合共聚焦显微镜分析清楚地表明，ERF B.1, D.1和H.1只针对与ERF e相似的核室。1，其中包含一个一致的核定位信号(图2)．

erf的结构特征与功能活性的关系

为了解决特定结构特征是否影响来自不同亚类的ERF的能力以驱动目标启动子的转录活性，使用单细胞系统中的瞬时表达测定。烟草BY-2原生质体与携带由35s组成型启动子和报告构建体的ERF编码序列的效果构建体共转化，该组成型启动子和由通过GCC的合成促进剂或天然乙烯响应促进剂驱动的GFP编码序列组成。为了区分缺乏活动的情况是由于从ERF结合的那些缺乏与靶促进剂的结合而是对启动子活性保持中性，我们将嵌合构建体作为由与SRDX融合的ERF编码序列组成的效果。压缩主题[45］.由于嵌合结构的主要抑制活动是由表观遗传学机制介导的[46，任何ERF- srdx结构的抑制缺失都可以被解释为ERF无法识别目标启动子的结果。图3表明ERF蛋白不仅可以作为激活子或阻遏子，而且在乙烯反应启动子上可以是中性的。SRDX融合实验表明，除erf - a外，所有的erf都能结合含有启动子的GCC盒。1和ERF.E.2。C类的成员表现出最强的激活活性，而F类的erf表现出最高的抑制活性(图)3)．来自子类A、B和E的erf是GCC框上的弱激活器，而来自类G和H的erf是中性的(图5)3)．

测试是否由小块土地蛋白质ethylene-responsive启动子的调控是严格依赖规范化GCC主题的存在,番茄osmotin和E4本机启动子包含或缺乏守恒的GCC主题,分别是融合GFP编码序列,作为记者的结构。融合SRDX阻遏因子基序获得的数据表明，在本研究中测试的28个erf中，多达16个erf(图)3 b)能够结合渗透蛋白启动子(p<0.05)。符合的结果合成GCC启动子,osmotin子强烈激活的小块土地子类C和压抑的小块土地子类f .相比之下,本机osmotin启动子的转录调节由几个小块土地从其他子类不匹配与合成启动子的行为。值得注意的是，天然的渗透蛋白启动子含有大量的CIS.-元素可能以更复杂的方式驱动转录活性，而不是仅仅包含GCC-box的合成启动子所显示的方式。总的来说，ERFs对合成GCC启动子的影响最强，对渗透蛋白复合物启动子的影响也最显著。E4启动子是一种乙烯诱导启动子，缺乏保守的GCC基序，而GCC基序是ERFs的一个潜在靶点。数据显示在图中3 c表明ERF.C。5, ERF.D。3, ERF.F。3, ERF.F。4.和ERF.F.5，are capable to bind the E4 promoter and to repress its activity, suggesting that some ERFs can be active on ethylene-responsive promoters lacking the canonical GCC boxCIS.元。

数据显示，ERF蛋白在合成的GCC启动子上比在天然复合体促进剂上更活跃。ERF在GCC框上的活动（图 3)表明，同一亚类的成员倾向于以同样的方式调节目标启动子的活性(方差分析p<10^－5)．测试的ERF中的一半（14个）对合成启动子有显着影响，而在含有含有保守的GCC主题的天然E4上仅在含天然Osmotin GCC的启动子上有8个ERF活​​性。

GCC框侧面区域对erf绑定亲和力的影响

我们之前已经证明[17发现ERF蛋白对含有高度保守GCC-box的各种启动子表现出不同的亲和力。因此，我们假设GCC box的核苷酸环境可能影响ERFs的结合亲和力。共有11个代表所有亚家族类型的erf被天然的sl -几丁质酶GCC盒攻击(5^'——一个₁一种₂G_3.一种_4.GCCGCCA₁₁C₁₂T₁₃一种₁₄- 3.^')或者在凝胶转移分析实验中使用该基序的突变版本（图 4)．侧翼的四个核苷酸（g_3.一种_4.A.₁₁和C₁₂)突变，通过EMSA检测ERFs的结合情况，并通过磷酸化成像评估ERFs的结合情况。A在第4位突变(A_4.)转化为T或G显著降低了除ERF.F.5外的所有erf对GCC盒的亲和性(图4 b)，而替换A_4.通过C增加所有测试erf的亲和力。引人注目的是，A₁₁与其他三种核苷酸中的任何一种都导致erf与GCC盒的亲和性急剧丧失。这些数据表明，在所有测试的ERFs中，GCC盒上游(4位)和下游(11位)的核苷酸以相同的方式影响结合亲和力。相反，G的代换_3.或C₁₂根据测试的ERF，另一个核苷酸对结合亲和力产生了不同的影响(图)4 b)．

的表达模式ERF年代

为了进一步阐明番茄ERFs的生理功能，我们试图在转录水平上了解每个基因家族成员的时空表达。通过qRT-PCR检测了25个erf的转录本积累，而其余3个erf的转录本在9个不同的植物组织中检测不到。全局表达模式的热图表示允许在三个主要分支中聚类番茄erf(图)5.），具有对应于在生殖组织中优先表达的基因的疏水性I（16ERF），对应于具有普遍存在表达的基因的CLADE II（4ERF），没有组织偏好，并且Clade III（5ERF）主要活跃在植物组织中。Subclade IA显示与断路器+2和花级相关联​​的独特表达模式，而Subclade IB包含其表达在断路器+ 2和断路器级更明显的基因。这些结果表明，一些ERF在营养组织（CLADE III）或生殖器官（CLADE I）中特别运行，而少数ERF似乎是普遍存在的并且可能参与各种器官的发展（思工II）。有趣的是，一些ERF在B + 2和鲜花阶段（Clade Ia）强烈表达，表明在水果集和成熟过程中的作用，而其他ERF在成熟期间的作用是在成熟（断路器和断路器+ 2，Clade IB）开始时更具体地有效。这些数据还指出了结构定义的ERF子类和组织类型表达之间的不存在明显的关系。

乙烯与生长素的调节ERF基因

据报道，除了乙烯的调节，ERF其他激素也可以诱导基因，其中生长素[47］.测定番茄的反应性ERF通过QRT-PCR评估用乙烯或植物素处理5和3小时处理的幼苗的幼苗的转录物的基因分别进行QRT-PCR。E4和索尔，分别被称为乙烯和生长素反应基因，作为对照来验证激素处理。转录本积累水平(图6.)表示13个番茄小块土地乙烯显著(p<0.05)诱导，4显著(p<0.05)下调。有趣的是，表达多达12小块土地也通过植物蛋白积极调节。其中，4ERF基因(ERF.B。1，Sl-ERF．E.1, Sl-ERF.F.4,和Sl-ERF.H.1)被两种激素上调ERF.F.5受生长素和乙烯的相反调控。更令人吃惊的是,6ERF基因(ERF.A。1，ERF.A。3.，ERF.C。4.，ERF.C。6.，ERF．D.4和ERF.F.1)它们被生长素显著上调，而对乙烯没有反应。

已知广泛的发育过程至少部分地依赖于乙烯作用，但植物对这种激素的植物反应的多样性依然存在的分子机制仍在等待一些深度表征。本研究提出了对影响亚乙基反应因子（ERF）对乙烯反应促进剂影响的结构特征的新见解。在ERF的上游，乙烯信号通过线性转导途径传播，这几乎不能考虑到广泛的乙烯反应。在其下游部分中，乙烯信号传导导致ERF的激活，所述ERF是由最大的多烯族转录因子之一编码的ERF [7.，这些转录介质可能是乙烯反应多样性和选择性发生的主要步骤之一。本文对番茄ERFs的结构和功能特征进行了研究，为乙烯如何以组织特异性和发育定义的方式选择能发挥适当生理反应的靶基因提供了一些线索。利用最近发布的完整注释的番茄基因组序列[38是全基因组的在网上通过筛选，鉴定出146个可能含有AP2蛋白的基因，分布在77个ERFs、48个dreb、18个AP2和3个RAVs中1)．随后，功能分析集中在番茄ERF家族的28个成员，包括该基因家族9个亚类中的8个。

数据表明，所有ERF蛋白都有明确的核定位，尽管家族中有三名成员缺乏任何可预测的核靶向基序，这表明他们可能通过非传统的定位信号进入细胞核，或者他们可能通过与未知的核定位伴侣的相互作用被传递到这个隔间。

erf之间的巨大差异很好地通过显著的母题的存在来说明，这些母题足以区分不同的子类。最近的研究已经表明ERFs的结构分类与其生理功能之间存在联系[13，然而，这一假设尚未得到整个ERF家族水平上强有力的实验数据的支持。有报道称，在E类中，保守的特异n端结构域最初在番茄ERFs中被描述[17，致力于氧依赖的翻译后修饰序列，导致蛋白质在有氧条件下的降解。在缺氧条件下，RAP2.12 ERF蛋白从质膜转移到细胞核，激活与缺氧适应相关的基因表达[48］.这些结果表明E亚类的成员参与了缺氧反应。

瞬时表达测定表明，合成GCC盒启动子对ERF的活性良好地与它们的结构分类相关。也就是说，来自子类C的ERF是强的活化剂，并且属于子类A，B和E的那些是弱激活器，而子类F的成员是清晰的压缩机。相比之下，来自子类G和H的ERF在与GCC框中挑战时无效。值得注意的是，ERFS在本地复合体蛋白蛋白促进剂上表现出比合成启动子的较弱活动。这可能是由于高基础性表达在不存在效应ERF，这可能最小化的诱导作用在ERFS的存在下观察到的显示在由天然渗透蛋白启动子（附加文件3.)．此外，实验数据表明，ERFs可以调节两种乙烯响应启动子的转录，无论是包含(渗透蛋白启动子)或缺乏(E4启动子)GCC-box，从而揭示了它们的结合能力CIS.-没有规范GCC基序的元素。但不能排除ERFs可能间接诱导细胞凋亡E4启动子通过激活一级靶基因编码的转录蛋白上的活性E4启动子，我们的数据表明erf可以与其他CIS.-规范GCC母题旁边的作用元素。这与最近的研究一致，这些研究表明，除了GCC框之外，ERFs还可以绑定CIS.-作用元素如VWRE和GCC-like [19，49- - - - - -51.]. 根据其在GCC盒上的活性对ERF蛋白进行聚类，表明相同亚类的成员倾向于以相同的方式调节目标启动子的活性（图1） 3)．虽然数据显示ERF的抑制因子和激活因子的活性与它们的结构分类密切相关，但特定ERF对GCC-box的识别似乎取决于所使用的启动子，并可能受到其周围核苷酸环境的影响CIS.表演元素。

的确，凝胶位移实验表明，GCC box的环境极大地影响ERF蛋白对保守分子的亲和力CIS.元。特别是数据(图4.)清楚地证明了N位核苷酸的性质_3.和N₁₂可能对不同erf有不同甚至相反的作用，这表明这些碱基有助于不同erf与目标启动子的结合特异性。综上所述，这两个核苷酸直接位于N_4.和N₁₁是任何ERF与gcc盒结合所必需的，因此，它们的性质决定是否CIS.-element用于绑定到ERF。相反，N_3.和N₁₂可以增强或降低结合亲和力，这支持了它们在确定各种erf与目标启动子的结合特异性方面的贡献。先前对天然启动子进行的研究已经强调了GCC box侧翼区域在影响erf结合活性中的假定作用[17］.同样的研究还假设，结合域内氨基酸组成的变化也可能影响ERFs对其目标启动子的结合亲和性[17］.还推测，位于DNA结合域外的保守基序也可能导致ERF蛋白对含GCC盒的启动子表现出不同的亲和力。最近的研究表明trans-部分ERFs的激活活性定位于酸性区域[52.］.与这个观察一致，ERF.D。1和ERF.D。2are lacking the acidic activator domain and accordingly are unable to activate the synthetic GCC box promoter. On the other hand, subclasses A, B, C and E ERFs harbour one or more acidic domains, however, not all of them display transcriptional activation of the synthetic promoter. Members of class F have an EAR repressor domain in the C-terminal region of the protein and accordingly they are all repressors of the activity of the GCC box-containing promoters.

解析的表达模式ERF基因为阐明其生理功能提供了重要线索，因为转录介质的生理作用不仅取决于其激活或抑制功能，而且还取决于其特定的表达模式。而与之前关于ERF基因表达的描述一致，如Pti4［53.] 和ERF1-4［17，数据区分不同的ERF组，取决于它们是否优先在营养或生殖组织中表达，或是否普遍表达而没有组织偏好。值得注意的是，结构亚类并没有显示出组织或器官的特化，正如水果发育过程所示，整个过程中，ERFs从结构上不同的亚类表达了从开花到果实成熟的过程。这可能与不同组织和发育阶段对乙烯的不同反应是由不同ERF蛋白介导的假说相一致。番茄ERFs的组织和非生物胁迫表达模式已有报道[39，然而，激素依赖的表达仍不清楚。正如所料，有很多ERF基因是乙烯响应13小块土地上调，4次调节乙烯处理。少预期，我们的研究表明，最多12个番茄ERF其中6个基因受乙烯和生长素的双重调控，其余6个基因仅受生长素的响应。据报道，除了乙烯，小块土地可由水杨酸和茉莉酸调节[20.，35，54.]，但生长素对这么多ERF基因的调控尚未见报道。生长素对erf的调控在乙烯响应启动子上显示出活性，表明它们可能对两种激素之间的相互作用有贡献。植物激素生长素和乙烯是植物发育的重要调节器，乙烯和生长素调节常见的生理方面，如钩的形成[55.，56.，根毛分化[57.，根伸长[58.，根生长[59.，下胚轴向光性[60.］.两种激素相互作用的机制正在得到更好的理解，尽管到目前为止这种相互作用的分子中只有少数被确定。乙烯和生长素除了独立作用于相同的靶基因外，还可以相互调节彼此的生物合成和反应途径。为了支持这一观点，我们之前报道了Sl-的下调IAA3，编码Aux/IAA型番茄转录调控因子，导致与经典生长素和乙烯调控过程相关的表型反应[61.，62.］.因此，揭开了一些成员的促进响应性ERF基因家族，可以定义可能涉及两种激素之间交叉谈话的新演员。在表达下番茄素的全局转录组分析SL-IAA9，另一个番茄Aux/IAA基因[63.，64.，揭示了大量乙烯相关基因的表达改变，进一步支持了生长素和乙烯信号转导在花果转化过程中存在积极联系的观点。与erf在介导各种激素反应中的复杂作用一致，erf - a。1和ERF.D。4.that are highly expressed in mature flowers, display strong up-regulation by auxin but not by ethylene. On the other hand, ERF.A.2 and ERF.C.1 are up-regulated by ethylene but not by auxin, and they are strongly expressed in the flower. Interestingly, many ERFs are expressed in flower and at early ripening stages (B and B+2), suggesting their putative auxin-dependent role in fruit set and fruit ripening process.

本研究提供了一些关于ERFS如何促进乙烯反应的特异性和选择性的分子线索，通过（i）基因家族成员的差异表达，（ii）对转录活动产生负面或积极影响的能力，（iii）基于GCC箱的核苷酸环境选择特异性其靶基因的能力。考虑到他们转录活动和表达模式的多样性，小块土地具有将乙烯信号传导到适当发育反应或对环境信号的期望反应所必需的一组基因的必要特征。这项研究为分配单个ERF在控制发育过程中的具体作用以及识别ERF家族每个成员的直接靶基因开辟了新的前景。

植物

番茄 （Solanum lycopersicum cv.Microtom）植物在气候室生长。条件如下：14-H-日/ 10-H夜周期，25/20°C日/夜温度，80％湿度测定，250μmol.m^－２授予了^－1辐照度。

ERF过表达和抑制结构的克隆

RACE使用BD SMART获得全长CDS^TMRACE cDNA Amplification kit (Clontech，http://www.clontech.com.)和完整的ERF CDS，在过表达载体中克隆，c端有或没有SRDX融合[45(附加文件4.，5.)．

乙烯和养羊酸治疗

用空气或乙烯气体（50μl/ L）处理五天历史的深色种植幼苗5小时，并从相应的组织中提取RNA。通过浸润（3小时）在含有香蒲（20μM）或无鞘内的MS溶液中的7天历史的幼苗上进行养蛋白处理。对每个实验进行三个独立的生物重复。

ERF基因表达分析

RNA样本取自不同的植物组织:未成熟的青果(花后17天)，成熟的青果(破果前1天)，破果，破果+ 2天，破果+ 7天，叶，花，根和茎。根据Pirrello et al. 2006(附加文件)进行实时定量PCR6.)．通过对ΔCt值的居中和归一化进行热图表示，利用R软件可视化聚类。

系统发育分析

为了识别Sl-ERF以番茄乙烯反应因子AP2/ERF结构域(GenBank号NP_001234308)作为番茄ITAG2.30(Sl2.40)蛋白数据库的BLAST查询序列。使用典型AP2/ERF域PF00847作为查询，通过HMM分析筛选相同的数据库。146个基因可能编码含有AP2/ERF结构域的蛋白(见表1)1)．进化的历史是用邻居连接法推断出来的[65.］.图中给出了分枝长度总和为13.53632771的最优树。系统发生树被线性化，假设所有谱系的进化速率相同[66.]. 该树按比例绘制，分支长度与用于推断系统发育树的进化距离的单位相同。使用泊松校正方法计算进化距离[67.]以每个位点的氨基酸替换数为单位。包含间隙和缺失数据的所有位置均已从数据集中删除（完全删除选项）。最终数据集中共有63个位置。在MEGA4中进行了系统发育分析[68.］.使用MEME 3.5.5版本确定保守基序[69.］.

单个电池系统中的瞬态表达转录活性测试

合成报告基因(4XGCC-GFP)是通过融合一个合成启动子生成的，该启动子包含4个gcc盒重复序列，位于第35S启动子的最小−42到+8 TATA盒上游花椰菜马赛克病毒到绿色荧光蛋白(GFP)的编码区。报告基因也由原生启动子生成，E4（S44898）和Sl-Osmotine(C08HBa0235H18.1)，与GFP融合。通过将35S启动子融合到ERF基因的CDS上生成效应子。对于瞬时测定，烟草(烟草）通过-2种原生质体与报告和效应构建体共转化[61.］.转化测定在三个独立的重复中进行。16 h后，在流式细胞仪平台(IRF31)上采用流式细胞仪(FACS Calibur II, BD Biosciences)对GFP表达进行分析和定量。使用Cell Quest软件对数据进行分析。对于每个样本，100-1000个原生质体通过正向光散射门定，每个细胞群体的GFP荧光值相当于细胞群体减去未转化BY-2原生质体测定的自荧光值后的平均荧光强度。将该报告载体转化原生质体后，结合缺乏Sl-ERF编码序列的效应质粒载体进行实验，将数据归一化。

亚细胞本地化

用ERF.B1，D.1，H.1和E.1获得YFP N-末端融合，并根据Chaabouni等人使用烟草原生质体By-2转染。2009 [61.］.20小时后用共聚焦显微镜测定荧光的亚细胞位置。

电迁移率位移分析

用于凝胶转移试验的蛋白是使用“TNT®T7 PCR DNA快速试剂盒”(Promega，http://www.promega.com)．ERFs扩增引物根据厂家推荐设计，包括Kozak T7序列。根据Tournier等人2003年所描述的程序，使用在侧翼核苷酸中突变的gcc box探针进行凝胶阻滞实验[17]（附加文件7）。扫描和放射性量化是通过“磷酸富吉菲尔姆BAS 5000”和软件“图像规”（富士薄膜）实现的（富士薄膜）实现http://www.fujifilm.com)．

序列

28个研究erf的编码DNA序列在附加文件中提供8.．

这项工作构成了JP博士学位要求的一部分。本研究得到了欧洲综合项目EU-SOL (FOOD-CT-2006-016214)、IFCPAR-CEFIPRA印法项目(Grant 3303-02)和“卓越实验室”(LABEX) TULIP (ANR−10-LABX-41)的资助。BCNP获得了IFCPAR-CEFIPRA的博士后奖学金。这项工作得益于欧洲成本行动FA1106内的联网活动。在A. Jauneau和J.C Lepert的技术支持下，在里约热内卢成像平台上进行显微镜和细胞计数分析。

作者指出

从属关系

1. INP-ENSA图卢兹，图卢兹大学，GBF，法国托洛桑Castanet Tolosan农业生物港大道BP 32607，F-31326

   Julien Pirrello, BC Narasimha Prasad, Wangshu Zhang, Isabelle Mila, Mohamed Zouine, Alain Latché， Jean Claude Pech, Farid Regad & Mondher Bouzayen

2. Inra，UMR990Génomique等生物技术德尔果，Chemin de Borde Rouge，Castanet-Tolosan，F-31326，法国

   Julien Pirrello, BC Narasimha Prasad, Wangshu Zhang, Isabelle Mila, Mohamed Zouine, Alain Latché， Jean Claude Pech, Farid Regad & Mondher Bouzayen

3. 浙江大学果树研究所，浙江杭州310029

   王舒张坤洞陈

4. 日本国立先进产业科学技术研究所基因组生物工厂研究所，筑波中部4号305-8562

   学者Ohme-Takagi

相应的作者

对应到Mondher Bouzayen.．

作者的贡献

JP和BCNP参与了研究的设计，进行了实验，并参与了手稿的撰写。WZ为克隆ERF进行qRT-PCR实验。KC参与了项目的设计。IM在单细胞系统中进行转录活性实验。MZ对在网上的分析ERF基因家族。AL和JCP参与乙烯和生长素处理实验。MOT为srdx阻遏因子基序实验的设计做出了贡献。FR对研究和实验的设计、生物信息学分析和手稿的起草做出了贡献。MB构思了这项研究，并参与了它的设计和协调，并为最终手稿的写作做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

Julien Pirrello，公元前Narasimha Prasad对这项工作也做出了同样的贡献。

开放获取本文在“生物资源”中央有限公司的许可下公布了这是一个开放式访问条款，分配根据创意公约归因许可证的条款（https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

再版和权限