花柱管细胞的比较转录组分析鉴定了涉及自不相容反应的新的候选基因柑橘克莱门蒂娜

背景

柑橘的生殖生物学仍然知之甚少。尽管近年来对花粉-雌蕊相互作用和自交不亲和进行了研究，但对这些过程的分子调控机制知之甚少。本文报道了小柑橘花粉-雌蕊相互作用和自交不亲和相关候选基因的鉴定(柑橘克莱门蒂娜长的矮。前任Tan)。这些基因是通过比较激光显微解剖的花柱管细胞(SCC)的转录组鉴定出来的，这些细胞是从两种不同的基因型中分离出来的，这些基因型因自交不亲和反应而不同(“Comune”是自交不亲和的品种，“Monreal”是“Comune”的自交不亲和突变)。

结果

SCC的转录组分析表明，少数特异性的、大多数未表征的转录本的差异调控与“Monreal”的自交不亲和性的破坏有关。其中，一个新的F-box基因在激光显微解剖花柱管细胞和自花全花柱中均表现出显著的上调，同时花粉管生长阻滞。此外，我们还发现了一个与“Comune”中激活的自交不亲和遗传程序密切相关的非特征基因家族。三种不同的富含天冬氨酸(Asp-rich)的蛋白质基因串联在clementine基因组中，在Comune的转录组中被过度表达。这些基因与一个DELLA基因紧密相连，该基因在花粉-雌蕊相互作用过程中被发现在自交不亲和基因型中上调。

结论

对花柱管细胞的高度特异性转录组调查发现了以前在柑橘和其他植物物种中未与自花粉排斥相关的新基因。生物信息学和转录分析表明，导致“Monreal”自相容性的突变影响了位于受限基因组区域的非同源基因的表达。此外，我们假设富含asp的蛋白基因可能作为Ca^2＋“捕获”蛋白质，潜在地调节钙^2＋自花花粉识别过程中的稳态。

在柑橘类植物中，有几种柚子(植物L. Osbeck)和柑橘类品种是自交不相容的[1]。小柑橘(柑橘克莱门蒂娜长的矮。(如Tan.)，由甜橙和柑橘之间的不受控制的杂交而来，可能是表现自交不亲和(SI)的最广泛的柑橘物种。其特征为配子体SI，花粉管在花柱上部或中部停止生长[2，3.]。此外，在该物种中，SI与不同程度的孤雌性相结合。柑橘的单倍体和孤雌性是柑橘生产中非常重要的性状，因为它们导致无籽水果，在市场上比有籽水果有更高的价值。因此，了解SI的分子基础对于计划标记辅助育种以获得新的无籽基因型非常重要。

尽管这一特性很重要，但人们对其遗传基础仍知之甚少，SI的关键基因尚未确定。对SI群体分离的研究可能绝对是一个强有力的策略，可以为其遗传基础提供新的见解。然而，由于在后代中观察到不同程度的孤雌性和雌雄不育现象，难以获得适当种群的特征，这可能限制了这种方法。这种鉴定s位点的策略在不同的柑橘品种和材料中进行了分析，这些品种和材料具有Got-3同工酶，被认为与s位点有关[4]，只提供了它们可能的s基因型的粗略估计。

近年来，不同的研究小组试图更好地了解几种柑橘基因型的SI和花粉-雌蕊相互作用，主要是试图表征已经表征的SI系统的关键基因和蛋白质的假定同源性。外邦人和同事[5]报道了Ca^2＋-依赖的谷氨酰胺转酶(TGase)在柚的自不相容反应中，如已经报道的蔷薇科［6]。在s位点基因方面，从‘秭归沙田’柚中分离到一个s样RNase [7]，但作者认为，该基因可能在卵巢衰老过程中发挥重要作用，而不是在不相容反应中发挥重要作用。另一个S-like RNase已经从柑橘品种中分离出来，并被部分表征[8]，但目前尚不清楚该基因是否是自我不相容反应的关键决定因素。

为了克服这些限制，对表现出不同亲和性的天然突变体进行转录组分析可能更有效地了解控制柑橘程序期的分子基础。在过去的十年中，对天然或诱导柑橘突变体的基因组和/或转录组分析已成为研究重要农艺性状的分子基础的有力策略，如成熟期、果实色素沉着、无籽和其他与品质相关的性状[9- - - - - -12]。在SI方面，一些柑桔自然突变体与其原始品种表现出不同的性行为，已被鉴定和鉴定[13- - - - - -16]。突变体与原品种之间的差异与花粉的差异有关[13]，风格[15]或卵巢[14)功能。在某些情况下，程序期的不同行为与胚胎发育异常有关[13，16]。因此，很明显，在这些基因型中，阻止受精的机制是不同的，因此，假设这些突变影响了与生殖有关的不同基因或途径是合理的。

最近，我们选择了两个在自花粉识别方面具有不同行为的小柑橘无性系('Comune'，自交不亲和;和'Monreal'， 'Comune'的自兼容突变[17])作为鉴定与花粉-雌蕊相互作用相关的候选基因的模型。通过组织学分析和花粉管动力学分析来研究两种基因型的花粉管行为，并评估'Monreal'中SI的破坏是否由雌蕊或花粉功能的变化引起。分析表明，‘Monreal’突变影响了雌蕊功能，因为自交亲和突变体的雌蕊中两个品种的花粉管生长相同，而‘Comune’拒绝了两个品种的花粉，认为‘Monreal’的花粉是自交花粉[15]。首次转录组比较分析了带柱头的整个花柱，鉴定出了自花授粉条件下非授粉花和花粉管伸长过程中差异表达的第一组基因[15]包括与应激相关的基因，以及与Ca相关的转录本^2＋荷尔蒙信号。令人惊讶的是，不同类型的反转录转座子的基因标签数量相对较高，表明它们可能在授粉反应中被激活。然而，dna - aflp分析只覆盖了部分转录组，由于花粉管沿着雌蕊生长，分离的基因标签可能不是雌蕊特异性的。

在这里，我们描述了一种互补的方法来鉴定'Comune'和'Monreal'中的另一组候选基因，以更好地了解与柑橘繁殖相关的分子方面。我们使用激光捕获显微解剖技术(LCM)，该技术已被有效地用于研究植物生殖生物学的几个方面[18- - - - - -21]。在我们的方法中，LCM与微阵列分析相结合，以鉴定在花柱管细胞(SCC)中特异性表达的基因。我们证明，我们的SCC转录组学调查是发现参与小柑橘SI反应的候选基因的有效策略。

SCC的激光显微解剖及微阵列分析

小柑橘雌蕊由10个或11个融合的心皮组成，它们围绕着一个内部通道组装，所有的心皮都有一个共同的湿柱头，有单细胞和多细胞乳头。柱头管呈放射状层状通向子房室。每个管的边缘是矩形的乳头状细胞，如图[柠檬]所示。22]和“Nova”普通话[23]。SCC的长轴与根管垂直放置。虽然在某些情况下，可能会看到内部通道内生长的花粉管很少[23大多数花粉管生长在花柱管内。因此，这些细胞在花粉-雌蕊相互作用中起着关键作用。为了分离SCC，在花粉管到达之前，在柱头位于花柱上部三分之一的OCT(最佳切割温度)上切割10 μm的横截面。一旦我们检查了包埋组织的完整性，我们就进行了SCC的LCM(图2)1)，丢弃其他组织，如薄壁组织和维管束。此外，柱头的切片被丢弃，因为柱头不是SI反应发生的部位[15]。每个生物复制体中大约有1万个细胞被显微解剖。分离的RNA不足以进行微阵列杂交，因此进行了两轮RNA扩增。额外的文件1显示生物素标记的扩增RNA (aRNA)在第二轮扩增后的安捷伦生物分析仪概况。aRNA的范围在200 ~ 2000 bp之间，峰值在600 bp左右，表明体外转录后的aRNA质量较好。

生物素标记的aRNA在Affymetrix Citrus基因芯片上杂交^®其中包含30,171个探针组，代表了来自几个柑橘物种和杂交种的33,879个柑橘转录本。该阵列估计代表约15,500个基因[24]。

采用Rank Products (RP)法比较Comune和Monreal的3个生物重复。RP是一种非参数分析方法，已被证明在生物重复数量少、研究间差异大的情况下特别敏感[25]。最后一个方面在我们的实验中非常重要，因为样品处理可能会增加重复之间的可变性[26]。RP分析检测的基因在许多重复实验中始终存在于最强烈的上调或下调基因中[27]。在我们的实验中，在相同生理条件下，高度特异性细胞的转录组比较导致自不相容和自相容基因型之间鉴定出的差异表达基因数量较少(表1)1)。具体来说，10个基因在自交不亲和的“Comune”的SCC中被过度代表，而7个基因在“Monreal”中被过度代表。总的来说，差异表达基因表现出显著的折叠变化差异，特别是在“Comune”中优先表达的转录本。它们没有发现任何功能富集，也不同源于先前被认为参与花粉-雌蕊相互作用的基因。实际上，许多候选基因以前没有在其他植物物种中标注。

对芯片结果进行实时定量RT-PCR (qRT-PCR)验证(图2)2)，从不同的SCC块中分离总RNA，从中合成两轮未标记的aRNA。所有“Comune”上调基因均通过qRT-PCR验证。对于“Monreal”过度代表的基因，只有一个未被验证(引文8702，对应扩展蛋白，数据未显示)，而引文7192因存在非特异性PCR产物而被丢弃。

F-box是自交不亲和型SCC中上调最多的基因

cite .7568是显示最高倍数变化值的单一基因，在“Comune”中超过37倍(表5)1)。该基因在基因芯片中由a的单个克隆表示c . sinensis愈伤组织库。试图推导出cite .7568单基因的氨基酸序列，但没有得到可靠的预测。实际上，通过对cite .7568的部分cDNA扩增和测序发现，在‘Comune’的SCC中表达的转录本长209 bp，与来自Comune的单个EST具有较高的相似性c . sinensis早熟水果[GenBank: EY696233]。对开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)周围的基因组区域进行测序发现等位基因变异，翻译证实了一个非功能等位基因和一个功能等位基因，该等位基因与clementine单倍体基因组的cit.7568位点具有100%的同源性，该等位基因编码无内含子的268个氨基酸的F-box蛋白[GenBank: JN885720]。我们对假设的F-box位点的1.5 kb区域进行了测序，但在“Comune”和“Monreal”之间没有检测到多态性，这表明差异转录调控与核苷酸多态性无关。BlastX搜索显示，预测的功能性ORF与杨树推测的F-box蛋白具有同源性[Uniprot: B9H9G5]。推测的拟南芥同源物(At5g04010)被标注为非特异性F-box。Interproscan鉴定出一个F-box结构域skp2样(IPR022364)，没有其他蛋白基序结构。F-box结构域与拟南芥的SLEEPY (SLY1) F-box结构域(At4g24210)相似，与DELLA蛋白相互作用并参与GA信号传导[28]。但在F-box结构域外未发现与SLY1有明显的同源性。

三个富含天冬氨酸(Asp-rich)的蛋白编码基因在自不相容条件下优先表达

生物信息学分析增加了关于“Comune”中发现的三个unigenes的显著信息(引文11563，引文5456和引文5776)，并且在可用数据库中没有显示功能注释。分离的基因代表三个完整的orf，分别编码含有79、53和74个氨基酸的小蛋白。推导出的蛋白序列具有较高的同源性，并且具有极高的天冬氨酸残基百分比，范围从19% (cit.5456)到27% (cit.11563和cit.5776)，提供了非常低的pI值(分别为3.64、3.54和3.66)。将推导出的氨基酸序列与从不同植物来源分离的其他同源蛋白比对表明，在n端区域的前半部分没有检测到明显的保守序列，而在蛋白质的n端后半段和c端检测到两个高度保守的基序。第一个保守基序是一个聚天冬氨酸组装，通常由甘氨酸残基隔开，其次是第二个YDYAPAA基序，它们都尚未被表征。上述基序可以沿着蛋白质序列串联重复，如在引文5776中所观察到的，在该序列中显示出三个poly-D/G + YDYAPAA基序(图5)3.)。Interproscan搜索没有发现已知的功能域和信号肽。此外，对三个推断的蛋白质序列进行的二级结构预测研究表明，除了小n端可能折叠成β-片外，它们是随机卷曲的，使天冬氨酸残基暴露在周围环境中(数据未显示)。

另一个有趣的特征是通过分析最近发布的clementine (v0.9)和橙子(v.1)基因组草稿(Haploid clementine Genome, International Citrus Genome Consortium, 2011)中富含asp的蛋白基因的位置发现的。http://www.phytozome.net/clementine;甜橙基因组计划2010，http://www.phytozome.net/citrus)。也就是说，3个富含asp的蛋白基因串联在一个约11kb的区域内。具体来说，富含asp的蛋白基因位于clementine基因组的scaffold 9(表2)2)，以及甜橙基因组的支架5。在两个基因组中，该区域高度保守，在非编码区域存在微小差异。主要是clementine中616bp的缺失，经PCR扩增和测序证实，缺失位置在cite .11563和cite .5456之间(数据未显示)。富含asp的蛋白基因得到相对较少的ESTs的支持，这些ESTs大多存在于受胁迫的非花特异性组织中(表2)2)。

在已测序的植物基因组中进行相似性搜索，我们发现了富含asp的同源物拟南芥、拟南芥、毛杨、苜蓿、甘氨酸、蓖麻、可可可可和木薯耐。与柑橘一样，富含asp的蛋白质基因通常是串联的，连接基因的数量取决于每个物种，从2到7不等。例外情况是杨树和木薯，存在单副本。此外，大豆含有两种假定的富含asp的蛋白质，它们位于不同的染色体上Medicago在第7号染色体上，除了位于第2号染色体上的5个聚集的富含asp的基因外，还有两个非聚集的相同的富含asp的基因(Medtr7g104220和Medtr7g104490)，它们是一个重复区域的元件。m . truncatula和答:lyrata拥有最多的富含asp的类似物(分别为7和6)，而答:芥显示三个聚集的富含asp的蛋白;其中两个在TAIR基因组浏览器版本9中预测(At1g47395和At1g47400)，而第三个没有基因ID，但使用Fgenesh预测，并得到37个est的支持。在某些情况下，比如答:芥在美国，基因预测是由ESTs支持的，而在其他方面，如蓖麻和Medicago，没有EST与预测相对应。在该物种中发现的低EST支持度可能是由于数据库中存储的EST数量相对较少，但也意味着该基因在特定代谢过程中具有高度特异性的作用。

在Uniprot和dbEST数据库中进行另一次搜索，以从其他物种中识别其他富含asp的同源物和基因标签(表1)2)。在富含asp的同源物中，天冬氨酸仍然是普遍存在的残留物，在预测蛋白质的氨基酸组成中平均占22%。此外，作为柑橘类富含asp的蛋白质，它们的特征是长度较短(在44到94个残基之间)，具有可变数量的poly-D/G结构域(从1到4个)，并且大多数在c端呈现polyD/G + YDYAPAA(图2)3.)。与柑橘的情况一样，大多数已确定的无害环境技术是从受胁迫的组织中产生的，在某些情况下是从花中产生的，这表明在不同物种中可能具有保守作用。有趣的是，其中一个EST属于水母的cDNA文库Clytia hemisphaerica这表明这些基因的作用可能不是植物特有的。

系统发育分析使用ClustalX对整个预测蛋白序列进行比对(图2)3.)。邻居连接(NJ)树将富含asp的蛋白质分成7个主要的组，暂定地称为从A到G的亚家族(图2)4)。具有相同数量的多聚d结构域或相似结构域组织的蛋白质通常组合在一起。A和B亚家族由富含Asp的蛋白质组成，这些蛋白质具有沿其序列分散的2或3个保守结构域和高百分比的Asp残基(从19%到32%)。C家族由来自茄科的富含asp的蛋白质组成，加上一个亚簇，包括摘要以和番薯蛋白质。C组的大多数蛋白具有4个富含asp的结构域。D和E是小的亚家族，分别由富含asp的蛋白质组成非洲菊和Cynara cardunculus(D)和蓖麻豆和可可(E)。Arabidospis在c端含有一个poly-D结构域的蛋白质都被归为F亚家族，而豆科植物中富含Asp的蛋白质则归为G亚家族。预测的F和G组序列中Asp的比例相对较低(10% ~ 20%)。的类比m . truncatula这两个拟南芥物种显示出高度的相似性，并紧密地分组。相反，柑橘、可可和蓖麻中富含asp结构域的长度和数量变化较大。值得注意的是，这些物种的相似物属于不同的亚枝，表明可能存在亚功能化。

富含asp蛋白基因周围的基因组区域在基因组中是保守的

对富含asp蛋白基因周围基因组区域的进一步结构分析证明了另一个显著特征。具体来说，我们在富含asp的蛋白基因下游约40kb处发现了一个DELLA蛋白基因。在之前的转录组分析中发现DELLA存在差异表达[15]。特别是，与“Monreal”花柱相比，“Comune”花柱的mRNA水平更高。

富含asp的蛋白基因与DELLA之间的区域高度保守c·克莱门蒂娜和c . sinensis基因组。此外，该片段与两种不相关植物的基因组共线性，如可可(t .可可)及蓖麻豆(r .普通的)(图5)。在4个基因组中，富含asp的蛋白基因与DELLA的取向一致。在富含asp的蛋白基因和DELLA之间，存在其他预测的orf(图2)5)。4个基因组簇的主要结构和基因取向相同，均存在含五肽重复(PPR)蛋白、类似eama的核苷酸糖转运蛋白和位于富含asp的蛋白基因和DELLA之间的F-box基因。并不是所有的预测基因都得到了表达数据的支持。上游DELLA的F-box推定蛋白(灰色框表示)的编码序列在柑橘GeneChip中没有表示，与cite .7568 F-box没有显著的相似性。

花粉-雌蕊相互作用过程中组织学和转录的变化

为了研究花粉萌发和花粉管伸长过程中mRNA水平的变化，我们对带柱头的整个花柱进行了时间过程分析。我们重点研究了含有f -box的单基因cite .7568，该基因在差异表达基因中折叠变化最大，以及推测的富含asp的基因(cite .11563, cite .5456和cite .5776)。在这项分析中，我们收集了开花前未授粉的花(用T0表示)和授粉后1至8天(DAP)带柱头的自花花柱(用T1至T8表示)。此外，我们还研究了T1、T3和T6采集的未授粉花的表达模式，以确定这些基因是由授粉诱导的，还是相反地受到发育调控的。对两个品种的带柱头的自花花柱进行了每日组织学观察，以监测花粉管伸长率(图2)6)。先前对两种基因型进行了分析[15]。然而，由于花粉管生长受环境温度的高度影响，新的显微镜观察对于检测'Comune'和'Monreal'花粉管行为与候选基因转录变化之间可能的一致性至关重要。从T0到T4，两个品种的雌蕊在花粉管萌发和花粉管伸长方面表现相似。从T1开始花粉萌发明显(图2)6模拟)，直到4点^thDAP萌发管位于柱头水平(图2)6中)，其中一些达到了上层风格。在T0和T4之间，虽然4个基因的mRNA水平普遍较低，但在Comune中观察到所有分析的转录本都略有上调(图2)7)。例外的是cite .11563，它在“Comune”中在T0时已经上调了约9倍。经过T4处理，花粉管动力学和基因表达均有显著差异。自交不亲和基因型“Comune”花粉管仍在柱头管中，仅在花柱上部或中部有少量花粉管(图2)6摄氏度)。相反，在'Monreal'花粉管的显著数量沿着中花柱生长(图2)6 f)， 7天后到达款式的底部。花粉管行为的差异与基因表达的差异一致。从T5开始，在“Comune”中观察到4个基因的明显上调，在T6达到表达高峰，而在“Monreal”中，与之前的采样日期相比，没有观察到任何变化(图5)7)。“Comune”未授粉花在T6时的mRNA水平与“Monreal”相当，表明自交不亲和诱导了F-box和富含aspi蛋白基因的上调。

在体外培养的花粉管上进行额外的qRT-PCR，以评估在时间过程分析中检测到的不同mRNA水平是否可能受到花粉管水平差异表达的影响。从培养约24小时的试管中分离出RNA，两个小柑橘之间的伸长率相似(图2)8)。在citd .7568、citd .11563和citd .5456中，mRNA水平极低且无差异表达(图5)8 b)，而没有检测到cite .5776的表达式。时间过程分析还分析了DELLA的表达模式，在T6和T7时，DELLA优先以带有柱头的“Comune”风格表达(附加文件)2)。

在这项研究中，LCM被用于特异性分离两种不同的小柑橘基因型的SCC。“Comune”是一种广泛存在的自交不亲和品种，而“Monreal”是一种自交不亲和品种，源于一种自发的芽突变[17]。SCC的显微解剖允许对参与雌蕊和花粉管相互作用的细胞的转录组进行高度特异性的研究，其主要目的是确定参与自花粉排斥的候选基因。微阵列分析结果表明，少数特异性转录本的差异调控可能导致'Monreal'中SI的分解。根据从数据库中检索到的功能信息，这些基因没有显示出任何明确的功能富集，其中许多基因没有注释，因此很难将我们的结果与模式植物上表征的SI系统进行比较。另一方面，我们的实验提供了一组新的转录本，这些转录本很可能在柑橘的程序阶段发挥关键作用。在数据库中的搜索显示，这些基因中的大多数不是花特异性的，这表明可能导致SI分解的突变并未影响s位点决定因子。然而，已知非s位点基因与SI有关[30.]。大多数优先表达基因在EST数据库中表达较低，且在SI反应发生前在柱头的整个花柱中表达较弱。这表明LCM在鉴定高特异性和/或低表达基因方面是有用的。

LCM的花在授粉后一天采集，当时花粉刚刚萌发。进行自花授粉，以评估花粉在柱头中的存在是否可能引起自交亲和与自交不亲和条件下SCC的差异反应。因此，虽然花粉管仍在柱头中，但我们的目标是位于花柱上部/中部的矩形SCC，这是'Comune'中发生不亲和性的部位，没有花粉管污染。虽然我们没有分析未授粉花的微解剖SCC的mRNA，但qRT-PCR显示，授粉前带柱头的整个花柱中基因表达也存在细微差异，这表明，至少在cit.7568、cit.11563、cit.5456和cit.5776中，“Comune”和“Monreal”的SCC中mRNA水平的差异不是由柱头花粉萌发引起的。

在鉴定的基因中，我们的分析集中在“Comune”中过度代表的4个单一基因(引文7568，引文11563，引文5456和引文5776)。通过时间过程分析和花粉管伸长的组织学观察，研究了‘Comune’和‘Monreal’花粉管行为与基因表达差异之间的关系。直到第4个DAP，我们才观察到4个被分析基因的mRNA水平有明显差异，两个品种的花粉管行为也没有明显差异。形成5^th我们观察到自交不亲和性组合有显著的上调。所选候选基因在花粉花柱互作过程中表现出明显的差异表达(甚至> 100倍的变化)(图2)7)，与组织学观察一致(‘Monreal’花粉管生长，而‘Comune’没有生长)。与花粉管阻滞同时出现的上调高峰表明，所分析的所有基因在花粉管伸长的阻滞中都起着关键作用。花柱中的花粉管明显诱导了这种上调，T6时自花和非授粉花的表达水平比较证实了这一点(图6)7)。候选基因在花粉管中表达较弱，Comune和Monreal在mRNA水平上没有差异(图2)8)。因此，花粉管转录组不太可能影响时间过程分析中检测到的mRNA水平。事实上，我们的表达数据表明，花柱组织中mRNA水平的剧烈变化是对自交不亲和花粉管的反应。此外，这四个基因的急剧上调不应该代表对SI的下游反应，因为在SI发生之前，这些基因已经在SCC中受到差异调节。

生物信息学分析提供了有用的信息来假设这四个单一基因的作用。与拟南芥F-box基因(At5g04010)同源的推测的F-box蛋白基因匹配的探针组标注为非特异性[28]。该蛋白属于F-box超家族的C2组，而SLY1也属于该超家族。然而，与SLY1的相似之处在于F-box结构域，而负责靶向底物泛素化的c端与SLY1没有任何同源性。

F-box蛋白超家族是植物中最大的蛋白质家族之一[31，32]。这些蛋白是蛋白水解的关键调节因子，赋予SCF (Skp1, Cullin, F-box) E3泛素连接酶复合物特异性，该复合物负责识别泛素介导的蛋白质降解的底物。尽管不可能将新的clementine F-box基因的作用与任何表征的同源物联系起来，但数据库搜索和转录数据显示，clementine F-box基因先前未在clementine cDNA文库中被发现，并且证明了高度特异性的表达模式，因为它在SCC中上调了近250倍(图2)2)，整个花柱带柱头向上调节约50至300倍(图1)7一个)，同时阻止花粉管伸长。这种剧烈的上调和数据库中没有相同的ESTs支持了该基因的高特异性，并指出它可能参与了自不相容反应期间风格中发生的高度特异性蛋白水解事件。对SI系统已经被表征的家族(即十字花科,茄科和罂粟科)表明蛋白水解在自交花粉排斥过程中起关键作用。通常蛋白水解事件发生在最初的SI信号感知之后，导致雄性配子体最终死亡[33]。功能分析将有助于揭示小柑橘F-box在花粉-雌蕊相互作用中的作用。

另一个引人注目的发现是鉴定了三个假定的富含asp的蛋白质编码基因，cite .11563, cite .5456和cite .5776，在“Comune”中上调。除了它们的初级结构高度相似外，它们还在克莱门汀基因组中共定位(图2)5)。聚类基因显示出相似的表达模式(图2)b, c, d)，这可能表明它们通常受到其他类别的管制[34，35]。虽然它们的功能尚未被研究，但已知的是拟南芥同源的At1g47400在暴露于3-(30,40-二羟基苯基)- l -丙氨酸(L-DOPA)(一种植物毒性化感化学物质)的植物中急剧上调。36]。在其他研究中，这种基因被证明是由缺铁强烈诱导的[37]和用多环芳烃菲处理[38]。这些结果支持了一种假设，即编码富含asp的蛋白质的基因可能会在不同类型的压力下被触发。由于其他信息仍然缺乏，我们试图赋予一个假定的函数柑橘类并提出了一个模型，该模型总体上可能解释“Comune”品种的SI调节。由于其丰富的天冬氨酸残基，富含asp的蛋白质被认为是新的Ca^2＋“诱骗”蛋白质。虽然它们与其他已知的Ca没有序列相似性^2＋相互作用蛋白，如钙调蛋白、钙调蛋白和钙调蛋白，富含asp的蛋白与这些蛋白共享天冬氨酸残基丰度，这与钙的蛋白质能力有关^2＋绑定(39]。因此，假设Ca^2＋水平在花粉-雌蕊相互作用中起决定性作用，正如已经报道的几种植物[40]，在“Comune”中观察到的富含asp编码基因的上调可能会增加作为Ca功能的蛋白质的数量^2＋-陷阱元素，并导致Ca的异常下降^2＋可用性，从而有助于关闭通常由细胞质钙增加引起的信号级联^2＋浓度或Ca的变化^2＋花粉管伸长需要梯度。花粉管生长可能代表着下游生理过程受到这一缺失触发事件的显著影响。为了支持这一假设，值得一提的是，上述At1g47400基因在p型atp酶阳离子泵的T-DNA插入突变体中被上调雄配子体发育受损的花药（米娅);突变体表现出雄性生殖力下降和阳离子平衡失衡[41]。此外，a Ca^2＋泵(自抑制Ca^2＋- atp酶- ACA)，它可能泵送Ca^2＋排出细胞质[42]，在花粉与雌蕊相互作用过程中，两种基因型受到不同的调控，在“Comune”基因型中受到上调调控[15]。将进行进一步的强制性工作，以验证花粉-雌蕊相互作用的假定作用和功能模式柑橘类基因型和，如果它们被证实，这可能代表一种特定的调节机制涉及不同的基因座，而不是基因年代-基因座可能是决定SI的共同原因。

转录组学数据与合成分析的整合表明，一个特定的基因组区域包含一个在自花粉排斥过程中激活的基因簇(图2)5)。具体来说，富含asp的蛋白质基因与DELLA基因有关，该基因先前在带有柱头的自花授粉“Comune”花柱中被分离出来[15]，在自交不亲和基因型中表现出优先表达。这提出了一个有趣的问题，即位于该基因组区域的非同源基因可能有助于与自花粉排斥相关的共同功能。在过去十年中，真核生物中出现了共表达和功能相关的基因簇的例子[34，43并可能随着来自基因组计划的大量数据而增加。植物中研究最多的操纵子样组织是次生代谢途径[44]，主要与植物防御反应有关。群集似乎已经发生新创通过某种形式的趋同进化过程[43]。在我们的案例中，这些基因不太可能是偶然聚集在一起的，因为这个集群至少在另外两种植物物种中是保守的，可可和蓖麻(图2)5)。含有富含asp蛋白基因和DELLA的柑橘基因组片段与其他不相关基因组片段的共线性支持了选择可能有利于这些基因连锁的假设。聚类的优势与紧密相连的基因可能在核组织和/或染色质水平上共同调节有关[43，45]。三个上调的富含asp的蛋白基因和DELLA在clementine基因组v0.9的scaffold 9中的共定位表明，导致自相容性的突变可能影响了紧密连接基因的功能。我们将进一步对富含asp蛋白基因周围的其他基因进行转录分析，以研究它们在花粉-雌蕊相互作用的不同阶段可能发挥的作用。

LCM结合微阵列分析无疑是一种强大的工具，可以识别先前未与SI相关的参与自花粉排斥的候选基因。转录组水平的数据强烈表明，有限数量的差异调控转录本与自花粉识别有关。虽然功能信息缺失，我们假设蛋白质水解和Ca^2＋内稳态可能对克莱门汀的SI反应至关重要，在一定程度上反映了其他SI系统中发生的分子事件。然而，为了了解候选基因在自花花粉识别过程中的作用，需要在蛋白质水平上进行进一步的研究。此外，基因芯片所代表的单一基因并不覆盖整个转录组，因此其他策略，如RNA-seq可能有助于提高转录组的覆盖范围，以识别与自花粉识别有关的其他基因。

植物材料

植物材料采集自意大利Lentini (SR) Palazzelli的Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione Agricoltura (CRA)试验站生长的“Comune”小柑橘及其自亲和自然突变“Monreal”成树。

SCC的激光显微解剖

自花授粉后24小时采集的柱头花柱，立即在OCT包埋培养基(Sakura Finetek, Zoeterwoude，荷兰)中快速冷冻，并放入pel - a - way塑料包埋模具(Polysciences, Polysciences, Warrington, PA, USA)中。包埋后的样品在-80℃保存至使用。用Leica CM1900低温恒温器(Leica Microsystems, Germany)在-20°C下切割样式上部10 μm厚的横截面。冷冻切片安装在涂有pet膜的不锈钢载玻片上(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)，并按前面所述进行处理[46]。每张幻灯片包含15-20个风格部分。采用徕卡AS激光显微解剖系统(Leica Microsystems)从横切面分离柱体管。为了避免花粉或花粉管污染，柱头上的管被丢弃。显微解剖采用X40放大镜，孔径:6;强度:46;速度:2;抵消:40;桥:中等。SCC收集在0.5 ml微管的帽中，微管中充满RLT缓冲液，来自RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany)。

RNA的分离和扩增

每个基因型制备3个生物重复。每个生物复制由来自两种不同霉菌的大约200个微解剖区域(平均由50个细胞组成)组成。按照制造商的说明，使用RNeasy Micro Kit (Qiagen)从约10,000个细胞中分离RNA。RNA样品按照制造商的说明进行两轮扩增targestamp™2轮生物素- RNA扩增试剂盒3.0 (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)。通过OD260/OD280测定、琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100生物分析仪检测aRNAs的质量。

微阵列分析

采用基因芯片进行微阵列实验^®柑橘基因组阵列(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)。用10微克生物修饰的aRNA进行芯片杂交。从微阵列实验中获得的数据使用Robin [47]，它包含一个易于使用的图形界面，用于R/BioConductor的微阵列分析功能。采用鲁棒多阵列分析(RMA)方法对CEL文件进行归一化处理。所有微阵列数据已存入Gene Expression Omnibus (GEO)数据库，登录号为GSE33014。使用Rank Products法比较每个基因型的三个重复，计算具有显著差异表达的探针集列表[25]。假阳性百分比(PFP)截止值，对应于错误发现率，设置为0.06，并基于100个排列计算。从Harvest: Citrus数据库中检索探针集信息http://harvest.ucr.edu，http://www.harvest-web.org。差异表达的unigenes使用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)对GenBank NR数据库进行检索。Interproscanhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/用于鉴定推导出的蛋白序列中的保守结构域。

差异表达基因的验证

从额外的SCC块中进行两次RNA分离(每种基因型各一次)，以验证微阵列结果。每个RNA从10,000个细胞中提取，并使用targestamp™2-Round aRNA扩增试剂盒2.0扩增，以产生未标记的aRNA。通过OD260/OD280测定和琼脂糖凝胶电泳检测aRNAs的质量。cDNA由500 ng aRNA用Ready-to-go RT-PCR珠(GE Healthcare Technologies, Little Chalfont, UK)和引物dT合成。在进行qRT-PCR之前，进行RT-PCR以检查可能存在的非特异性产物。转录物水平通过实时定量RT-PCR (qRT-PCR)测定，使用ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和Power SYBR Green PCR Master Mix，如前面所述[15]。每个基因型实时进行3次cDNA合成，每次扩增重复2次。所使用的引物列在附加文件中3.。不显示单个解离峰的引物对被丢弃。通过5倍稀释系列标准曲线计算mRNA水平，并根据GeneChip (AFFX-Cit-ubq11-3_x_at)中柑橘泛素单基因归一化。

组织学观察

从授粉后第1 ~第8天，每24 h采集各基因型自花10朵，监测花粉萌发和花粉管动力学。按照Distefano等人的描述进行南瓜制备和显微镜观察。[15]。

时程分析

带柱头的自生'Comune'和'Monreal'花柱从0(处女花)到8 DAP收集。为了检验其表达模式是否受到花粉-雌蕊互作的影响，在1、3和6 DAP处采集了未授粉花的对照样品。收集后立即将约25株带柱头的花柱散装保存在液氮中，并根据产品手册(Qiagen)使用RNeasy Plant Mini Kit进行总RNA分离。根据制造商的说明，用RNase-Free DNase set (Qiagen)处理总RNA。用PCR扩增总RNA以证实样品中不存在基因组DNA。cDNA合成从总RNA 2 μg开始。实时运行和数据分析执行如上所述。每个采样日期使用两个生物重复，所有扩增重复两次。利用时间序列对优先表达于“Comune”(探针集名称为cite .7568)上的4个与sly样F-box基因对应的单基因的表达模式进行了评价;和引文11563，引文5456，引文5776，对应于假定的富含asp的蛋白基因)，以及先前通过dna - aflp从'Comune'带柱头的自花花柱中分离到的DELLA基因[GenBank: GH733267]。

离体花粉管萌发及RNA分离

大约30朵花在花期前被采集，花瓣和雌蕊被移除。将花药置于室温下使其崩裂24小时。新鲜花粉在培养皿中用Mesejo等描述的花粉萌发液和管状培养基培养。48]。培养24 h后，将花粉管离心成球，用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)采集，用于RNA分离。

富含asp蛋白基因的相似性搜索和系统发育分析

利用Phytozome网站v 7.0上已测序的基因组，对柑橘富含asp蛋白的DNA序列进行了比对http://www.phytozome.net。其他富含asp的同源序列从GenBank、Uniprot和可可基因组数据库中检索http://www.cacaogenomedb.org。

ORF预测是基于每个被分析物种的基因组浏览器数据以及Fgenesh分析http://www.softberry.com。所有预测的蛋白序列(3个柑橘富含asp, 44个来自其他物种)通过ClustalX进行比对[29]。使用Mega 5包分析校准[49]，基于p-距离和间隙的两两缺失，采用邻居连接法构建了1000个bootstrap重复的系统发育树。

cite .7568 F-box功能等位基因的鉴定

利用附加文件中提供的引物，在两种基因型中扩增了一个跨越cite .7568位点的1448 bp片段3.。将该区域划分为三个PCR产物，克隆到pGem-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA)中，使用ABI310遗传分析仪(Applied Biosystems)进行测序或直接测序。横跨cite .7568位点的区域序列已存入NCBI GenBank数据库[GenBank: JN885720]。

aRNA:

放大RNA

Asp-rich:

天冬氨酸的acid-rich

衣冠楚楚的:

授粉后的天数

美国东部时间:

表达序列标签

中国大陆:

激光捕获显微解剖

10月:

最佳切削温度

子:

开放式阅读框

存在:

实时定量RT-PCR

总机:

等级的产品

鳞状细胞癌:

柱头管细胞

如果:

Self-incompatibility

SLY1:

困了。

我们感谢Giuseppina Las Casas博士、Sergio Currò、Nicoletta Zingale博士提供的技术援助，以及Giuseppe Russo博士(CRA-ACM)，他使我们有可能在Palazzelli实验站工作。这项工作得到了意大利大学部门的支持- prinin项目“果树品种的生产过程:花不亲和性的分子、生理和农学方面及其控制策略”;西西里亚省-“西西里亚省蔬菜遗传研究”项目。Genómica中心(IVIA)的工作得到了西班牙科学部Innovación-FEDER基金PSE-060000-2009-008和INIA基金RTA 2008-00065-00-00的支持。

从属关系

1. 意大利卡塔尼亚农业与食品生产科学学院，卡塔尼亚巴尔迪萨瓦大街5号，卡塔尼亚95123

   Marco Caruso, Gaetano Distefano, Stefano La Malfa, Angela Roberta Lo Piero和Alessandra Gentile

2. 西班牙瓦伦西亚调查研究所Agràries -中心Genómica，蒙特卡达'Horta-Náquera公里4,5，蒙特卡达奥尔塔(瓦伦顿西亚)，46113

   Paz Merelo, Francisco R Tadeo和Manuel Talon

相应的作者

对应到亚历山德拉外邦人。

作者的贡献

MC进行了LCM, RNA提取和扩增，芯片分析，差异表达基因的qRT-PCR验证，时间过程分析，显微镜观察，体外花粉萌发试验，生物信息学和系统发育分析，并起草了手稿。PM优化和辅助LCM和RNA扩增实验。GD进行取样和组织包埋进行LCM分析，辅助qRT-PCR分析和显微镜观察。ARLP执行和监督生物信息学分析，帮助解释结果并参与手稿的起草。SLM协助实验设计，协助撰写稿件。FRT构思了整体研究，设计并资助了LCM和aRNA实验，协助对富含asp的蛋白编码基因进行微阵列分析和系统发育分析，并参与了稿件的撰写。MT和AG协调，监督和资助实验，并严格修改手稿。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

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