番茄的功能特性眼镜蛇式基因在果实发育和成熟中的作用

背景

广泛的研究表明眼镜蛇基因是构成根、茎、叶等营养器官结构组织的细胞壁组分生物合成的关键，但其在果实发育和成熟中的作用尚不清楚。

结果

我们鉴定了一个番茄基因(类眼镜蛇)拟南芥同源眼镜蛇，并确定其在肉质果实生物学中的作用类眼镜蛇该基因在营养器官和果实发育早期高度表达，但在果实成熟阶段表达量急剧下降，表明该基因在果实发育早期起主要作用。水果的抑制类眼镜蛇结果表明，在果实发育早期，细胞壁完整性受损，细胞壁降解相关基因表达上调。相反，水果特异性的过度表达类眼镜蛇结果表明，红成熟果实表皮细胞壁厚增加，表皮下厚角细胞增多，果皮细胞纤维素含量升高，果胶溶解减少。此外，转基因番茄果实也存在过表达现象类眼镜蛇表现出理想的早期发育表型，包括增强的硬度和延长的保质期。

结论

我们的结果表明类眼镜蛇在果实细胞壁结构中起着重要的作用，并为延长番茄和潜在的额外果实的货架期提供了一个潜在的遗传工具。

肉质水果的成熟涉及许多生理过程，包括产生芳香化合物、营养物质、色素沉着和使果肉软化成可食用的质地[1，2]。这些加工不仅对水果的硬度、颜色、风味和营养含量有直接影响，而且对货架寿命、消费者接受度、加工质量以及采前和采后的抗病性也有直接影响[1，2].水果过度软化是导致运输、储存和收获后处理过程中受损的主要因素[3.]。水果的硬度和质地也会影响用于罐装和水果制品的切碎和切成小块的水果的完整性[4]。由于鲜果采后因过度软化而造成的损失可达总产量的30~40%，因此对果实软化机理的研究相当多，常用番茄(番茄茄)作为模型系统[3.]。

果实在成熟过程中的软化部分是由于细胞壁的分解，导致细胞间黏附减少，果胶解聚和溶解，半纤维素解聚，果胶半乳糖侧链丢失[3.]。一般来说，果实软化后硬度下降伴随着多种细胞代谢酶的表达升高，其中包括聚半乳糖醛酸酶(PG) [5，6]，果胶甲基酯酶（PME）[7),β牛乳糖(8，以及细胞壁松弛蛋白，如expansin [9，10].编码水果PG的单基因的抑制[3.，11]或PME [7，12]转基因番茄植株在成熟过程中对果实软化的影响有限，但由于对采后病原菌的敏感性降低而延长了货架期。这些结果表明，抑制某些单独作用于纤维素、半纤维素或果胶的酶不足以防止软化，这可能是由于可能是一个复杂的代谢过程中所涉及的酶的重复性[1]。然而，最近的一项研究表明，编码n-聚糖加工酶α-甘露糖苷酶和β- d - n-乙酰己糖苷酶的基因下调显著延长了水果的货架期，这归因于成熟过程中软化减少[2]这些酶已被证明能破坏碳水化合物之间或碳水化合物与非碳水化合物结构分子之间的糖苷键[13]。

膨胀蛋白是一种细胞壁定位蛋白，可促进细胞壁松动。它们在发育过程中通过破坏基质聚糖和纤维素微纤维之间的非共价键参与细胞壁修饰的许多方面[9，10，14，15]。番茄膨化蛋白基因的转基因沉默LeExp1结果增加了果实在成熟过程中的硬度，并改善了果实在贮藏过程中的完整性[16]。

分子和遗传学研究已经确定了细胞壁生物合成和细胞扩张的其他调节因子眼镜蛇以前在拟南芥、水稻和玉米中报道的基因[17- - - - - -20]。的眼镜蛇基因编码一个植物特异性糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，在C端有一个ω-连接位点、一个亲水中心区域、一个CCVS结构域、一个潜在的n -糖基化位点、一个n端分泌信号序列和一个预测的纤维素结合位点[21]。有报道称COBRA通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)部分定位于外质膜小叶[22]。遗传缺陷眼镜蛇该基因导致拟南芥和水稻中结晶纤维素微纤维的水平降低和方向不正确[17，18，22，23]。尽管有很多研究眼镜蛇基因在几种植物中，很少了解眼镜蛇在番茄中，肉质果实发育和成熟的模型系统。在这里，我们报道了番茄的功能特征眼镜蛇基因(类眼镜蛇）.我们特别展示了它在果实早期发育中的作用，以及通过操纵其在成熟转基因番茄果实中的表达来提高果实硬度和货架期的潜力。

番茄中的眼镜蛇基因家族成员

为了鉴定番茄的同源基因眼镜蛇基因，我们在SOL基因组学网络（SGN，http://solgenomics.net/)眼镜蛇基因序列(阿特科布，登录号AF319663.1）作为查询。17与阿特科布在SGN数据库中找到，并指定为SlCOBLs（表1）.所有预测的氨基酸序列均含有该植物特有的Interpro IPR006918或IPR017391位点眼镜蛇式基因家族。这些SlCOBL成员，以及来自拟南芥、水稻和玉米的其他类似眼镜蛇的植物蛋白质，可以分为系统发育树的两个分支。11Sl由5~7个外显子组成的COBL成员聚集成分支I，其他6个成员（包含2或3个外显子）聚集成分支II（附加文件）1：图S1）。我们将进一步分析重点放在类眼镜蛇因为它似乎是组成表达在许多番茄组织，表明在番茄生物学的重要作用。总计99类眼镜蛇在SGN EST数据库中发现了来自叶、花和发育果实等组织的EST。

表达类眼镜蛇茄

的长篇类眼镜蛇使用基因特异性引物，通过RT-PCR从番茄幼苗中分离出cDNA（附加文件2:表S1)。推导出的Sl眼镜蛇样蛋白包含一个富含半胱氨酸的中央结构域（CCVS结构域），一个靶向内质网的N端分泌信号序列，一个高度疏水的C端和处理C端所需的ω-位点[21]（表1)此外，在研究中还观察到几个与GPI锚定蛋白和细胞外蛋白相关的潜在N-糖基化位点，以及一个HMM预测的假定纤维素结合域II（E值=0.018）Sl类眼镜蛇序列（附加文件3.:图S2) [17，21，22].基本局部对齐搜索工具（BLAST）分析表明Sl类COBRA蛋白与拟南芥中其他COBRA蛋白有63~80%的相似性，水稻，及玉米［17，18，20，24]。系统发育分析显示Sl类眼镜蛇与在COBL1，因此在同一分支内进行本地化(附加文件1:图S1)。

我们还进行了实时RT-PCR分析，发现类眼镜蛇基因主要在根、茎、叶、花和发育早期的果实中表达。然而，在果实中的表达量在破碎期和成熟期后期急剧下降(图2)1A） ，这意味着可能在早期果实发育中起作用。此外，我们从花后15天的未成熟果实（DPA）的外果皮、中果皮、小柱或室果组织中分离总RNA，用于RT-PCR分析。结果表明，该方法是可行的类眼镜蛇与此特定发育阶段的其他组织相比，房组织中的表达水平相对较高（图1B)。

转基因番茄类眼镜蛇被抑制的基因表现出异常的果实表型

确定类眼镜蛇在果实发育过程中，转基因番茄植株过度表达类眼镜蛇在果实中产生cDNA类眼镜蛇转基因是由一种特定的水果驱动的TFM7促进者[25]。获得了20个独立的转基因株系。如预期的那样，一些转基因株系(包括TFM7-OE4, TFM7-OE5和TFM7-OE6)过表达类眼镜蛇（OE）通过RT-PCR分析得到确认（图2A).这些OE株系没有表现出改变的果实表型(图2C） 。然而，20个转基因品系中有3个在其未成熟绿色果实表面表现出广泛的不均匀开裂（图1）2C） RT-PCR分析表明，在开裂的转基因果实（TFM7-CS1、TFM7-CS2和TFM-CS3）中，内源类眼镜蛇与未转化的野生型(WT)对照植物相比，其表达基本上被共同抑制(CS)(图)2B）.然后我们用RNA干扰(RNAi)为基础的抑制转基因番茄植株类眼镜蛇基因来证实这种抑制作用。不幸的是，我们的RNAi转基因株系没有表现出明显的抑制类眼镜蛇基因（数据未显示）。一种可能性是，对类眼镜蛇在培养组织中由RNAi产生的基因比由CS产生的基因可能在早期发育中引起致命性。

因为有17个眼镜蛇在番茄成员中，有必要验证抑制的特异性类眼镜蛇在3条可用的CS线。我们检查了的表达SlCOBL1，2和4在CS水果中，我们选择这3种水果有两个原因SlCOBLs:首先，它们代表了高(86.6%相同)、中(59.9%相同)和低(17.9%相同)相似度类眼镜蛇分别;其次是这3种植物的果实衍生estSlCOBLs在SGN EST数据库中发现，表明它们在水果中表达，水果是表型最明显的组织2B，实时RT-PCR检测显示表达SlCOBL1，2和4而在CS株系中则不受影响，说明果裂是由抑制类眼镜蛇表情。

转基因植物果皮解剖结构的改变类眼镜蛇表达式

因为外果皮（表皮）在决定整个果实的膨胀率和机械支撑方面起着重要作用[26]，进行光学显微镜分析，以检查转基因果实组织中可能的变化。将15个DPA果实外果皮切片置于15%盐酸中，并使用徕卡LDM 2500显微镜拍摄。如图所示3.果实外果皮的表皮细胞层无显著性差异t试验，p=0.48)与野生型(26.25±1.45)相比，表皮细胞大小(不包括细胞壁)差异有统计学意义(p=0.48)^-3嗯²)和TFM7-OE（27.04±0.62±10^-3嗯²）.而TFM7-CS外果皮组织的表皮细胞大小为45.52±3.01 10^-3嗯²，远远超过WT或TFM7-OE。此外，与WT和TFM7-OE相比，TFM7-CS果皮的表皮细胞呈放射状扩张。与野生型(18.43±1.75 μm)相比，TFM7-OE(29.11±2.69 μm)和TFM7-CS(11.82±3.84 μm)果实的表皮细胞分离(相邻表皮细胞间距)明显改变，表明TFM7-OE果实的表皮细胞壁较厚，而TFM7-CS果实的表皮细胞壁较薄。分别。

为了进一步比较WT和转基因品系果实的果皮结构，我们进行了详细的细胞学分析。对果皮组织(MG期，35 DPA)的解剖石蜡切片和钙荧光染色显示，与野生型相比，TFM7-OE果实表皮下的厚角细胞数量增加(图)3.与此相反，TFM7-CS果实表面呈“波纹状”，角质层明显缺失，细胞形状和大小分布异常，特别是在果实表面细长的表皮细胞薄层。TFM7-CS果实表皮下的小细胞几乎不存在，中果皮中可见一些塌陷的薄壁细胞(图)3.综合来看，这些结果表明类眼镜蛇该基因在未成熟果实果皮细胞壁发育中起重要作用。

用傅立叶变换红外光谱分析细胞壁大分子

进一步研究改变后的类眼镜蛇细胞壁大分子的表达，利用傅立叶变换红外光谱快速测定野生型和转基因果皮细胞壁大分子组成。如图所示4A、功能纤维素基团的特征峰(波数1374、1164-1160、1102、1063-1060和1033-1026厘米)^-1) [27，28这些结果表明，与WT相比，TFM7-OE果实的细胞壁含有更多的结晶纤维素，而TFM7-CS则含有更少的结晶纤维素。

此外，探索性主成分分析（PCA），一种通常用于光谱数据判别分析的统计方法[29，对从野生型和转基因果皮组织收集的54张FTIR谱图(每个种群18张FTIR谱图)进行分析。提取了3个主成分负荷(PCs)，其中PC1占总变异性的61.74%，且具有特征纤维素峰(图)4D） PC1-PC2或PC1-PC3的PCA分数显示WT和转基因果皮组织之间的差异（图4B和C):在这个散点图,集群TFM7-CS样本显示集群的一个清晰的分离WT或TFM7-OE样本,尽管只有WT之间的细微差别和TFM7-OE样本观察,而更积极的分数在TFM7-OE发现样品和更多的负面分数在WT样本(图4B)。

转基因果实细胞壁组成改变类眼镜蛇在红熟（RR）期表达

接下来我们调查了改变的影响类眼镜蛇转基因果实细胞壁成分的表达。果皮细胞壁纤维素定量分析[30.]对野生型和转基因RR果实进行处理。与野生型相比，TFM7-OE果皮的纤维素水平显著升高(平均为1.46倍)，而TFM7-CS果皮的纤维素水平降低了约40%(图)5A） 。由于果胶的改性对果实成熟过程中的结构变化很重要，所以采用一系列连续的溶剂提取果胶组分[31]，并以半乳糖醛酸(UA)的量来测定。如图所示5B，共价结合果胶的量(Na₂有限公司_3.结果表明，TFM7-OE果实中粗提物含量高于WT和TFM7-CS果实。此外，与WT或TFM7-CS相比，TFM7-OE果实的可溶性细胞壁分数显著降低(图5)5B） .结合果胶的比例（CDTA+CO_3.结果表明，TFM7-OE果实可溶性果胶含量(4.5~5.0)显著高于WT(2.0)和TFM7-CS(1.9~2.0)。

为了定量水果细胞壁中的糖组成，将三氟乙酸(TFA)可溶性(非纤维素)细胞壁馏分转化为醋酸糖醇，并用气相色谱(GC)分析[32]。如图所示5C，发现TFM7-OE果细胞壁具有更多的非纤维素葡萄糖(Glc)和细胞壁半乳糖(Gal)残基。相反，TFM7-CS果实细胞壁的阿拉伯糖(Ara)、Glc或Gal含量较少，木糖(Xyl)含量较多。

转基因水果质地和货架期的改变

我们进行了渗透和压缩分析（TA-XT Plus，稳定微系统）确定WT、TFM7-OE或TFM7-CS果实在不同发育阶段的质地参数。对于所有基因型，分别由渗透质量和压缩质量表示的果皮机械强度和果肉硬度，从MG到RR显著降低，而果皮弹性（由渗透距离表示）MG和RR阶段之间没有显著变化（表1）2）.而TFM7-OE水果的皮肤穿刺强度大于WT，而TFM7-CS水果的皮肤穿刺强度低于WT, TFM7-OE水果的皮肤弹性增强。此外，尽管在MG期硬度略有降低，但在RR期TFM7-OE的硬度是WT的1.6 - 1.9倍。相比之下，TFM7-CS果实在同一时期的压缩质量约为WT果实的33%2)因此，这些结果表明类眼镜蛇基因活性表现在果实的结构表型上。

TFM7-OE机械强度和果实度的增强促使我们评估是否过表达类眼镜蛇可延长水果货架期。WT和TFM7-OE水果在RR期（破碎后7天）收获，并在相同条件下储存，直到完全变质。我们发现，在储存期间，TFM7-OE水果比WT水果减重（水分）（图6D） 事实上，WT水果在贮藏15天后开始收缩，汁液溢出，质地和完整性丧失，而TFM7-OE水果直到40天后才显示出这种变质迹象（图1）6A、 B和C）。

抑制类眼镜蛇导致细胞壁降解和细胞壁信号基因的上调

TFM7-CS转基因果实的形态改变促使我们研究是否类眼镜蛇影响编码参与细胞壁降解的蛋白质的基因类眼镜蛇成熟时mRNA水平通常较低，选取15 DPA的未成熟CS转基因果实进行分析。如图所示7， mRNA积累升高聚半乳糖醛酸酶（PG），β-半乳糖苷酶（TBG4)及棒曲霉素（LeExp1)在TFM7-CS水果中检测到。值得注意的是，LeExp1转录本增加50~100倍。此外，在TFM7-CS果实中，包括壁相关激酶(WAK)、THESEUS1 (THE1)、FEI和凝集素受体激酶(LecRK)在内的几个编码受体激酶(RLKs)的基因也上调(图)7C)，表明细胞外基质中控制细胞壁结构和完整性的一些相关信号通路受到缺失的影响类眼镜蛇表达式内稳态。值得注意的是，这些基因在3个TFM7-CS果实间的诱导水平存在相当大的差异。我们推测这可能是由于不同程度的抑制类眼镜蛇在3个TFM7-CS转基因果实中(图2B)。

眼镜蛇属于一个多基因家族，在拟南芥中有12个成员，在水稻中有11个成员，在玉米中有9个成员[18，21，33].拟南芥眼镜蛇，AtCOBL4，玉米ZmBK2和大米一样OsBC1已经证明是纤维素合成所必需的[17- - - - - -20，24]，而拟南芥AtCOBL9和玉米ZmBk2L1根毛发育过程中的冲击尖端定向生长[34- - - - - -37]。最新公布的番茄基因组序列表明至少有17种眼镜蛇西红柿家庭成员（表1）1).但是眼镜蛇在水果的发育和质地方面一直是难以捉摸的。我们的研究解决了这个问题，并提供了一个潜在的策略，通过修改番茄果实的硬度和货架期类眼镜蛇表情。

的作用类眼镜蛇果实发育中的基因

的类眼镜蛇该基因在果实发育的早期阶段高度表达，但在破碎期后表达水平急剧下降（图1）1A） ，表明在早期果实发育中起作用。这进一步得到了水果特异性抑制的表型分析的支持类眼镜蛇结果表明，在转基因番茄植株中，TFM7-CS基因的表达与果实发育早期解剖结构的变化有关。值得注意的是有17个眼镜蛇因此，有必要验证抑素的特异性类眼镜蛇在3个TFM7-CS系中，允许准确解释我们的结果。RT-PCR结果显示，3SlCOBLs，表示与的最高、中、低相似性Sl类眼镜蛇在TFM7-CS果实中不受抑制（图2B，暗示抑制类眼镜蛇可能是特定的。但是，其他SlCOBL成员在果实发育中也发挥着重要作用。其他材料的进一步表征SlCOBL特别是成员SlCOBL1/4/9/14也包含COBRA的所有特征域(表1)并以水果的形式表达，将有助于解决这个问题。

的影响类眼镜蛇果实细胞壁生物合成与完整性的基因研究

过度的类眼镜蛇转基因水果中的基因导致纤维素含量显著增加（图4一个和5A).另一方面，更多的细胞壁结合Na₂有限公司_3.在TFM7-OE - RR果实细胞壁中发现了-可溶性果胶和细胞壁半乳糖残基(图)5B、 C），表明类眼镜蛇是果实成熟过程中细胞壁大分子溶解/解聚较少的原因。这些结果结合TFM7-CS未成熟果实的开裂表型，表明Sl类眼镜蛇蛋白不仅参与调节纤维素的合成，而且在细胞的伸展和组装过程中维持细胞壁的完整性。先前的研究也证明了细胞壁完整性的复杂性。例如,脆表型，在水稻中观察到bc1［18]，拟南芥cobl4［19)和玉米bk2［24]，不一定是纤维素缺乏的结果，因为拟南芥纤维素合成酶（塞萨斯而纤维素含量降低的突变体则不表现出脆表型[38]。

类眼镜蛇也可能在微调参与细胞壁降解和细胞壁信号传导的编码酶的若干基因的表达中发挥重要作用。PG，TBG4和LeExp1在未成熟的TFM7-CS果实中mrna水平升高(图7A, B).这些基因编码细胞壁降解蛋白，通常在成熟时(BR)和整个成熟后期被诱导[8，9，39].相反，在细胞中检测到的表达几乎没有变化PME和TBG6(图7B)，其表达通常在果实开始成熟时迅速下降。8，40，41]。同样值得注意的是，下调了类眼镜蛇导致编码多个受体样激酶(RLKs)的基因表达升高，这些基因可以通过胞浆激酶结构域将信号传递到胞浆(图)7（C）[42，43]与眼镜蛇蛋白类似，阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）通常具有N端GPI锚定位点[44]，并在细胞扩张、增殖和分化中发挥重要作用[44，45]细胞壁与细胞质之间的信号传递[46]。有趣的是,镇压类眼镜蛇在TFM7-CS中，未成熟果实抑制番茄的mRNA积累LeAGP-S1编码AGP的S1亚基(图7 c)，从而表明遗传相互作用眼镜蛇和AGP然而，这种相互作用的机制仍有待阐明。

过表达类眼镜蛇提高水果的硬度和保质期

植物细胞壁是一个高度组织的纤维网络，为细胞、组织、器官和整个植物体提供机械支持[43]有人认为，超过400个带注释的蛋白质定位于细胞壁（拟南芥基因组计划[AGI]，2000年），基因组中超过1000个基因与细胞壁的生物发生和修饰有关[47]。此外，细胞壁修饰被认为是果实软化的主要决定因素，尽管膨压、解剖特征和细胞壁完整性的变化也可能发挥重要作用[11]。事实上，转基因番茄中单个细胞壁修饰酶的活性对果实成熟过程中的软化影响不大[3.].这里我们展示的是类眼镜蛇主要表达在果实发育的早期，它是在成熟过程中正常的果实软化所需要的，特别是通过减少抑制。增强表达类眼镜蛇在转基因TFM7-OE果实中，果实硬度增加，采后货架期延长2图形6）.硬度的增加可能是由于纤维素含量的增加以及果皮解剖结构的改变，特别是表皮下厚角细胞数量的增加。果皮结构的变化对果实硬度有深刻的影响。Guillon和他的同事报道了番茄的抑制作用DR12基因（一种生长素反应因子）导致果皮细胞异常分裂，表皮下厚角组织细胞比例增加，导致多效性表型，包括增强果实硬度，这与我们在此报告的相似类眼镜蛇超表达(48]。

我们提供的数据表明类眼镜蛇基因在肉质果实发育过程中对细胞壁结构的调控起着重要作用。转基因植物overexpressing类眼镜蛇表现出增强了果实的硬度和延长了保质期。而监管方面类眼镜蛇在番茄果实发育过程中的表达和细胞壁修饰仍有待进一步研究，本研究为番茄果实品质和货架期的遗传调控提供了一种潜在的策略眼镜蛇表情。

植物材料

番茄植物(Lycopersicon esculentum个人简历艾丽莎克雷格)在日光照射下的温室中种植，每隔一天人工灌溉一次。对于细胞学、结构、细胞壁组成和分子分析，WT和T的果实₁在花期标记花后，在未成熟绿（15dpa）、成熟绿（MG，35dpa）、破绿（BR）和红熟（RR，BR后7天）阶段收获第二代转基因系。

氨基酸序列分析

使用SignalP版本3.0预测信号肽和GPI修饰(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) [49]和big-PI (http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html) [50),分别。使用NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)进行n -糖基化位点预测。SUPER-FAMILY 1.69 (http://supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/hmm.html) [51]用于预测纤维素结合结构域。利用ClustalX比对蛋白质序列[52]结果比对被用作输入，使用MEGA2.1生成系统发育树[53]。树节点的统计置信度基于10,000个引导重复。

转基因植物

的长篇类眼镜蛇利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)和基因特异性引物(附加文件)，通过反转录(RT) -PCR从番茄幼苗中分离cDNA2：表S1）。将cDNA克隆到修饰的二元载体pBI121中，以产生由水果特异性基因驱动的过表达结构TFM7启动子(Accession no.X95261) [25]。转基因植物由根癌农杆菌-介导转化，如Fillatti等人所描述的[54]在含有卡那霉素（70 mg/L）的培养基上选择转化系，并通过PCR进一步确认是否存在NPTII（Kan^r)标记基因(附加文件2：表S1）。经RT-PCR分析验证类眼镜蛇从原代转基因(T0)群体中鉴定出3个独立过表达株系(TFM7-OE)和3个独立共抑制株系(TFM7-CS)的mRNA积累量。

基因表达分析

按照制造商(Invitrogen, Carlsbad, CA)提供的方案，使用Trizol试剂提取总rna，并使用DNase (TaKaRa，中国大连)处理。从每个样品中提取约1 μg总RNA用于第一链cDNA的合成。对于实时定量RT-PCR，采用SyBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)和基因特异性引物(Additional file)进行PCR反应2表S1)的icycle PCR系统(BIO-RAD, Hercules, California, USA)。每个样本扩增三份。其他软件(55的mRNA水平进行量化类眼镜蛇和其他被选择的基因UBI3基因（登录号X58253）作为内部参考。通过2-Ct方法进行标准化。本研究中使用的所有引物在附加文件中列出2S1:表。

组织化学染色和细胞学检查

对果实表皮进行分析时，用剃须刀片将组织从果实表面仔细分离出来，将组织结合的载玻片用蒸馏水冲洗两次，并将其安装在15%的盐酸中，置于盖玻片下，使用徕卡LDM 2500显微镜拍照。在15 DPA的条件下，从相同的果皮位置分离出3个不同果皮的6片外果皮。使用ImageProPlus软件(IPP6.0, Media Cybernetics, Inc.)在三个不同位置(每个位置10个细胞)测量每个外果皮切片的表皮细胞大小(不包括细胞壁)和细胞分离(细胞间的间距)。值表示180 (6×30)单元格的平均值。

为了进行细胞学评估，在MG期采集每株植物的三个果实。新鲜手切果皮切片（约0.1mm厚）在0.005%的钙氟（荧光增白剂28；Sigma）水溶液中培养2分钟[18]为了检查果皮细胞壁结构，使用徕卡切片机（RM 2265，Meyer Instruments，Inc.）获得石蜡包埋的横切面（厚度为10μm），并用藏红O（一种细胞壁特异性染料）染色，然后使用徕卡显微镜（LDM 2500）进行摄影。

RR果皮细胞壁物质分离及细胞壁成分分析

从未转化的WT和3个独立过表达或共抑制品系中分别采集每株3个RR果实，将其果皮组织混合，在液氮中快速研磨成细粉，在−80℃下保存至使用。在每种情况下，约15 g冷冻功率与70%乙醇在70°C下孵育90分钟，以防止自溶活性。不溶性物质依次用95%乙醇、氯仿:甲醇(1:1,v/v)、丙酮洗涤。干燥的颗粒组成粗细胞壁提取物/酒精不溶性固体[AIRs]，使用蒽酮作为着色剂，以α-纤维素(Sigma)为标准，根据前面描述的方法测定纤维素含量[30.]。

剩余的空气随后用90% (v/v)二甲基亚砜(DMSO)在室温下提取22小时以溶解淀粉，最后用丙酮洗涤壁球并在真空烘箱中干燥[31]。颗粒(细胞壁材料，CWM)储存在玻璃干燥器中直到使用。确定非纤维素糖成分,约5毫克cwm和2 M三氟乙酸水解(组织)包含4毫米的肌醇作为内部标准在105°C 3 h,然后TFA-soluble分数转换成alditol醋酸纤维素和如前所述气相色谱仪分析32]。将等摩尔标准品转化为醋酸糖醇，以计算相对于肌醇标准品的摩尔%定量的响应因子。

果胶分馏按照Rose等人（1998年）的程序进行[31]。使用水提取约100 mg CWMs，在50 mM醋酸钠（pH 6.0）中使用50 mM CDTA提取100 mM Na₂有限公司_3.含有0.1% NaBH₄,按顺序。以半乳糖醛酸为校准标准，比色法测定果胶不同组分中糖醛酸(UA)的含量[56]。

红外光谱

对于FTIR光谱分析，从三个独立的过表达、共抑制或WT系中收集了每株6个RR果实，并如上所述从54（6×9）个果实中提取了相应的果皮AIR。在每种情况下，将空气薄薄地铺在氟化钡窗口上，在37°C下在窗口上干燥20分钟。选择50×50μm的面积进行FTIR显微光谱分析[57]。所有数据集均经过基线校正和面积归一化后才进行统计分析。探索性PCA使用PASW统计软件18(以前称为SPSS statistics, SPSS Inc.)进行。用纤维素的参考红外吸收光谱确定峰位[27，58]。

结构和保质期分析

使用TA-XT Plus (Stable Microsystems Texture analyzer, UK)，以MG (35 DPA)和RR(破碎后7天)采集新鲜完整的果实，通过压缩质量和皮肤穿刺强度确定果实的硬度。在压缩试验中，每株果实在每个阶段有15个。每个果实以2 mm s的测试速度压缩至50%菌株⁻¹用100毫米压缩压板(P/100)和10克的施加力。使用2mm圆柱探针(P/2N)，触发力为5 g，加载时间为2mm s，测量新鲜完整水果的皮肤穿刺强度和穿透距离^-1为了达到50%的菌株。每个果实在沿果实赤道面的等距点上测试三次。每个阶段每株取6个果实。数值代表平均值±SE（n=18）。

在货架期，将RR期果实分离，在室温(23~25℃，相对湿度55~60%)下保存约40天。每株取6个重复。平均鲜重损失每5天进行一次测定，直到它们失去了质地和结构的完整性。

统计分析

使用PASW统计软件18.0进行统计分析(以前称为SPSS statistics, SPSS Inc.)。对于表皮细胞，纤维素含量，果胶组分和糖含量的分析，显著性是使用学生的t测试。对于WT和CS植物的基因表达，采用LSD (Least significant difference)方法进行多重比较。

登录号

的登录号类眼镜蛇本文报道的序列是BT013422和JN398667。其他SlCOBL序列列于表中1．图中序列数据7已在附加文件中列出2S1:表。本文的其他序列数据可以在GenBank中找到，其登录号如下:

拟南芥在COB（At5g60920），在COBL1 (At3g02210),在COBL2（At3g29810），在COBL4 (At5g15630),在COBL5 (At5g60950),在COBL6 (At1g09790),在COBL7 (At4g16120),在COBL8 (At3g16860),在COBL9 (At5g49270),在COBL10 (At3g20580),在COBL11 (At4g27110);玉蜀黍Zm评选BK2 (ACF79122.1),ZmBK2L3（NP001104946），ZmBK2L6 (NP_001105970),ZmBK2L7（NP001105971.1），ZmCOBL4（EU955798.1）；栽培稻的操作系统BC1（Os03g0416200），操作系统COBL2 (Os03g0416300),操作系统COBL3 (Os05g0386800),操作系统BC1L6 (Os07g0604300);操作系统COBL6（Os07g0604400）。

这项工作得到了国家杰出青年科学基金(30825030),国家自然科学基金(31171179),中国国家科技重点项目(2009号。2011 cb100401 zx08009 - 072 b和2009 zx08001 - 011 b) YL、爱达荷大学内部外汇资金。

作者指出

从属关系

1. 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，水力学与山河工程国家重点实验室，成都，610064

   曹颖，唐晓峰，刘永生

2. 合肥工业大学生物技术与食品工程学院，安徽合肥230009

   刘永胜

3. 美国农业部-农业研究服务部，罗伯特·霍利中心和博伊斯·汤普森植物研究所，康奈尔大学，纽约州伊萨卡，14853，美国

   吉姆Giovannoni

4. 爱达荷大学植物、土壤和昆虫科学系，莫斯科，ID, 83844-2339，美国

   肖方明

5. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳621010

   曹颖

通讯作者

通信刘永胜．

作者的贡献

YL、FX和JG构思了这项研究，设计了实验并起草了手稿。YC和XT进行了实验。所有作者都阅读并批准了最终手稿。

曹颖、唐晓峰对这部作品贡献相当。

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