依赖mapk的JA和SA信号烟草attenuata则影响植物生长和适应性在竞争中同质

背景

对食草动物的诱导防御反应通常被认为是作为节省成本的策略而进化的，它推迟了防御代谢的适合度成本，直到需要这些防御。茉莉酸(JA)介导的防御的适应度成本已被充分记录。那些介导对食草动物诱导抗性的早期信号单元还有待研究。早期信号成分介导草食动物诱导的防御反应烟草attenuata则，已经很好地描述了，在这里我们检查了他们的增长和适应成本在与同质竞争。两种丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)，水杨酸(SA)诱导蛋白激酶(SIPK)和伤口诱导蛋白激酶(WIPK)在感知食草性后迅速激活，这两种激酶调节食草性诱导的JA水平和JA介导的防御代谢产物的积累。由于ja诱导的防御导致以资源为基础的权衡，损害了植物的生产力，我们评估了是否沉默SIPK(红外SIPK),WIPK(红外WIPK)有利于与野生型(WT)植物竞争的植物的生长和适应度，正如在ja信号沉默的植物中所显示的那样，通过减少脂氧合酶3（LOX3)的水平。

结果

正如所料，irWIPK和lox3沉默的植物的表现优于它们的竞争对手WT植物。令人惊讶的是,红外SIPKJA信号减少最多的植物则没有。叶片的植物激素分析显示irSIPK与WT相比，植物积累了更高水平的SA。为了测试假设，这些高水平的SA，以及它们假设的与病原体相关防御的适应度成本SIPK当这些植物的ja缺乏介导的生长益处失效时，我们从基因上降低了ir中的SA水平SIPK植物。降低SA水平可部分恢复ir的生物量和适应度缺陷SIPK植物。我们还评估了SA或JA水平降低的植物适应度的提高是否源于氮或CO水平的增加₂并发现没有证据表明摄入更多的这些限制健康的资源是罪魁祸首。

结论

由WIPK而非SIPK介导的信号传导与竞争中较大的适应性成本相关n attenuata则这证明了这两个mapk在调节植物生长-防御平衡中所起的截然不同的作用。我们讨论了SIPK作为植物适应性的重要调节因子的作用，可能是通过乙烯信号介导的调节SA-JA串扰。

植物已经进化出有效的防御策略来抵御自然敌人，包括病原体和食草动物。将适应性限制资源分配给抗病原体和抗草食动物抗性往往会给植物带来成本，这很容易被视为植物生长和适应性的降低。这些防御生产的适应度成本在大多数植物防御理论中起着基本作用(见[1])。植物并不会永久地产生昂贵的防御代谢产物，而是只有在收到暗示攻击者存在的信号时才会激活防御通路。这种被称为诱导防御的塑料防御途径，通常被认为是作为一种资源节约策略而进化而来的。2])。

诱导抗性途径的适应成本通常通过控制防御激素水平来评估，如茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)，这两种激素分别调节主要的抗草食动物和抗病原体防御反应(在[2- - - - - -4])。SA介导植物对生物营养性、半生物营养性病原体和一些刺/吸吮性食草动物的抗性[5］．启动与sa相关的防御反应增加了田间的抗病性和植物适应性[6］．然而，与SA基因水平降低的植物相比，在无病原体的条件下，维持SA通路对植物的生长和适应性造成了权衡[7］．

茉莉酸信号级联，包括创伤激素ja -异亮氨酸(JA-Ile)，被广泛认为是植物抵抗节肢动物食草动物和各种病原体的主要调节因子(综述在[8])。通过使用JA处理植物或使用JA生产或感知改变的植物，可以测量由JA介导的防御通路激活所带来的适应度代价。JA和SA的施用降低了种子产量，对这些激素敏感性降低的突变体具有较高的适应度相关拟南芥在温室实验的受控条件下生长[9］．当土狼烟草的本地种群(烟草attenuata则)植物经JA处理后，在没有食草动物攻击的情况下，JA介导的抗性性状对种子生产的成本较高，但对植物受食草动物攻击时的适应性有利[10］．

在草食动物或病原体攻击时，内源性SA和JA水平受到上游信号单元的强烈调控，这些信号单元调节对各种攻击者的防御反应。要理解是否有诱导的能力本身可以导致适应性成本，我们需要分析生物量和与这些植物激素途径上游的信号单元相关的适应性相关的权衡。按照这种方法，在答:芥，一个R基因(RPM1)，它涉及到细菌病原体的识别，被证明会导致在田间生长的植物付出很大的适应度代价[11］．同样，研究表明，在调节SA和JA水平的单个基因组位点上的自然变异可以解释大量水稻的生长和抗性表型答:芥登记入册(12］．因此，分析这种上游调控器的成本可以帮助解释自然种群的生长和防御多态性。这些研究描述了成本R与抵抗病原体有关的基因、感知成本和介导抵抗激素上游食草动物的信号单元仍未被探索。

在n . attenuata则它的主要天然落叶动物之一，鳞翅目幼虫Manduca sexta，可透过昆虫口腔分泌物中的脂肪酸-氨基酸结合物(FACs)察觉(见[13])。据最近的报道，FAC的认知导致生长减少n attenuata则［14，但潜在的机制仍然难以捉摸。FAC感知中最早的分子事件之一是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK， [15])。MAPK的活性对于植物在食草动物攻击时的防御反应的诱导是很重要的，包括各种激素通路的调节(图1)．在n attenuata则、水杨酸诱导蛋白激酶(SIPK)和创伤诱导蛋白激酶(WIPK)，以及它们在番茄中的同源蛋白激酶(Lycopersicum esculentum)、栽培烟草(n .烟草),答:芥介导草食诱导组织中防御相关激素反应的激活[15- - - - - -18］．sisipk和WIPK都调节创面和草质诱导的JA和JA- ile水平，而只有sisipk调节草质诱导的乙烯(ET)水平n attenuata则［15］．LecRK1是食草诱导SA水平的一个重要负调控因子，也受SIPK和WIPK的调控([19];数字1)．

n attenuata则是一种一年生植物，生长在大盆地沙漠(美国犹他州)火灾后的直接环境中，在那里它出现在单一栽培的种群中，周围有相同的竞争者。由于该环境具有氮有效度高度降低、种子同步萌发和种内竞争激烈的特点，它代表了原始农业生态位。在这种短暂的资源丰富的环境中，植物的竞争能力被强烈选择，这取决于获得资源的最大化和获得资源的有效利用。换句话说，选择植物是为了最大化，而不是优化资源获取。在这篇文章中，我们分析了植物在自然中通常发芽的激烈资源竞争条件下生长时，维持和激活草食诱导信号通路的成本SIPK而且WIPK沉默n attenuata则植物。

我们种植用倒置重复(ir)结构转化的植物SIPK(红外SIPK),WIPK(红外WIPK)与野生型(WT)植物进行竞争，并分析了模拟草食和不模拟草食的植物生长和适应度参数。量化真正的植物适合度需要测量多代的繁殖成功，因此很难评估。本研究以相互竞争的植物的花和种囊数为参数，评估防御信号通路的适应度结果。我们的数据表明，虽然两个mapk沉默系在草食后积累的JA较少，但只有irWIPK植物从防御状态降低中受益，生物量和适应度较高。红外SIPK当这些植物与oe杂交时，植物积累了更高水平的SANahG当植物过表达细菌水杨酸羟化酶(NahG)以降低游离SA水平时，我们可以部分恢复sisipk沉默导致的生长和适应度参数。尽管这两种激酶经常被报道调节共同的防御途径，我们的数据表明SIPK和WIPK调节不同的信号系统n attenuata则食草动物攻击后的生理重构及其产生的适应度参数。

在田间和温室条件下，沉默两个草木反应MAPKs对植物生长有不同的影响

两种丝裂原激活蛋白激酶，SIPK和WIPKn attenuata则已经被证明可以调节食草诱导的防御反应[20.］．由于防御是昂贵的，并且被认为是植物生长和繁殖的代价[1，我们评估是否沉默SIPK而且WIPK有利于植物的生长和适宜性。首先在转基因ir中分析了生长SIPK和红外WIPK在美国犹他州大沙漠盆地的自然栖息地中，植物与WT的成对设计。尽管与WT植物相比，转基因植物的直接和间接防御能力都有类似的降低[20.，令人惊讶的是，irSIPK植株明显小于WT(图5)2A，韦尔奇两个样本t-test, p = 0.049)，而irWIPK植株生长与竞争的WT植株相似(韦尔奇两个样本t-test, p-value = 0.17;数字2A).补充材料(补充文件)中提供了包含所有其他统计值的表1:表S1)。

在控制条件下，在温室里进行了类似的实验。与国防相关的权衡n attenuata则只有当植物在同质物竞争中生长时才会发现[2］．因此，我们采用配对设计，让大小匹配的植物在单个花盆中竞争相同的资源，以分析植物的生长和适应性。由于MAPK活性和ja水平在食草动物攻击过程中高度诱导[15]，我们认为，当竞争性植物通过模拟草食处理(缠绕和施用m . sexta口腔分泌物，W + OS，见方法)。除了irSIPK和红外WIPK，我们用JA缺乏的植物(如LOX3) [20.，21]以较低水平的抗草食防御代谢产物作为“阳性对照”，因为这些植物应该比竞争的WT植物表现更好。温室试验结果与田间试验结果基本吻合。独立于治疗，irSIPK植株比WT小，产生的蒴果更少(图2B)，而irWIPK植物和植物LOX3植株在处理后显著地产生了更多的干质量和更多的蒴果数量(图2B).虽然W + OS处理对MAPK活性和JA水平有较高的诱导作用，但对生长有利WIPK而且LOX3-沉默植株在没有W + OS处理的情况下也被观察到，这表明植物持续受到各种环境胁迫的挑战，这些环境胁迫可以激活JA信号(图1)2B)。

在n attenuata则，模拟草食已经可以抑制幼苗的生长[14］．评估的生长效果SIPK而且WIPK-在苗期沉默植株，我们进行了在体外幼苗竞争试验(附加文件2:图S1)。在未经处理的条件下，我们没有发现幼苗的生长差异(数据未显示)，而伤口诱导WIPK(ANCOVA F_5344年= 20.79, p = 0.049)和LOX3(ANCOVA F_5344年= 20.79, p = 3.72^-07年)的生长速度比WT快，而SIPK-沉默的幼苗生长相似(ANCOVA, F_5344年= 20.79 p = 0.95;数字2C).生物量积累WIPK- - -SIPK-沉默的幼苗反映了幼苗根系生长的趋势(Welch两个样品t-test, p = 3.3e-04;数字2C).总之，我们来自三种不同生长试验的数据表明沉默WIPK有益于植物的生长和适应性，但那是SIPK植物没有从JA缺乏中获益。

红外SIPK植物在叶组织中积累了更多的SA

已知SA对植物生长和发育有负面影响[22］．先前的一项研究表明，ir的叶子SIPK在单个花盆中生长的植物，其基础sa水平高于WT植物(见[23),)。要测试，如果SIPK，WIPK或LOX3-沉默的植物在包括种内竞争对手的实验设计中也会改变sa水平，在未处理的叶片组织和W + OS处理1小时后测量sa水平。我们发现ir的sa水平明显更高SIPK植物独立处理(韦尔奇两个样本t-test, control: p = 0.002;W + OS: p = 0.048)(图3.A)其他转基因系中，只有irWIPK植株在W + OS处理后积累的SA略少于竞争的WT植株(Welch两个样本)t-test, p = 0.037)。然而，ja -水平的irSIPK、红外WIPK和红外LOX3与相应的WT相比，W + OS处理后的品系大大减少(图3.B).因此，我们假设较高的sa水平可能会影响这些缺乏ja的植物的生长和适应度表型。为了验证这个假设，irSIPK与水杨酸羟化酶(NahG)过表达系(oeNahG；［24])。交叉的线，SxN， sa水平与WT相似(图3.A)和较WT植株低的ja水平(Welch两个样本)T-test, p = 0.004;数字3.B).值得注意的是，在oe中JA水平也降低了NahG，当与相应的WT植物比较时(图3.B).之前的一份报告显示，单盆种植的oeNahG植株在W + OS处理1 h后，JA水平没有任何差异[19我们假设在我们的竞争环境中不同的生长条件可能导致了oeNahG系中JA积累的改变。

降低ir中的SA水平SIPK植株部分恢复了JA缺乏介导的生长促进作用

目的:探讨SA对ir的影响SIPK的生长和繁殖，额外的竞争实验包括SxN和oeNahG植物被运走了。为了将几个实验的结果合并到一张图中，我们计算了一个花盆中两种竞争植物的相对差异，并将其与单个实验中使用的WT植物的相对差异表示出来(图1)4A)穿越irSIPK与oeNahG导致表型类似于植物缺乏JA和JA介导的防御(irWIPK和红外LOX3)．SxN植物有较大的生物量(方差分析，F_{2, 97}= 11.12, p =4.5e^-05年；数字4B)，囊数较高(方差分析;F:_{1, 58}= 21.18, p = 2.32^-05年；治疗:F_{1, 58}= 8.08, p = 0.006;数字4C)和较高的花数(方差分析;F:_{1, 58}= 45.90, p = 7e^-09年；数字4D)大于相应的WT，而irSIPK表明较高的SA水平是ir的适应性限制因素SIPK植物。自SxN累积的JA比oe少NahG植物，我们推测，交叉将实现更大的健身效益比oeNahG植物。然而，独立于治疗，SxN与相应的WT相比，oeNahG植物(图4)，表示沉默SIPK损害生长和健康n attenuata则也通过不依赖于sa的途径SIPK-沉默不影响oeNahG促进生长和健康。

与图中数据相比2解析:选B。WIPKW + OS处理显著增加了植物的生物量，实验结果如图所示4揭示了红外组分中较高的生物量WIPK当与WT植物比较时。此外，ir对生物量和种囊数的降低也不明显SIPK植物，当两个实验的数据比较。这些影响可能是由于两个实验装置之间的土壤条件略有不同(见方法)。

光合速率的差异不能解释红豆生长和适合度的差异SIPK、红外WIPK和红外LOX3植物

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的沉默n attenuata则模拟草食处理后，会导致光合速率下降，植物生长减少，防御代谢产物数量减少[25］．光合速率也受食草性的影响[26]，生物压力[27和植物激素水平。特别是外源SA施用可通过改变叶绿体结构降低光合活性[28， RuBisCO活性[29]和光合基因的转录水平[30.］．因此，我们假设，irSIPK植物的生长和适合度比红外低WIPK,红外LOX3和WT植物，这可能是由其较高的SA水平介导的较低的光合速率。然而,红外SIPK植株的光合速率与WT和其他转基因植物(ANOVA, F_{2, 56}= 15.7, p = 3.9e^-06年)(图5)．与这些结果一致，SA水平降低SxN与红外相比，植物也没有增加光合速率SIPK植物。这些数据表明:1)在这些生长条件下的光合速率与SA水平无关;2)较低的光合产物量不能解释其原因SIPK植物没有从减少的ja介导的防御中受益。

JA已被证明可以下调光合作用相关基因的表达[21］．因此，较高的光合活性可能支持植物的生长和适合度WIPK而且LOX3沉默的植物。但红外WIPK和红外LOX3尽管与WT相比，它们的JA水平有类似的降低(图3.B) -显示相反的光合速率模式(图5)，甚至具有低于WT的光合活性。因此，我们得出结论，ir的生长促进作用WIPK和红外LOX3植物不受改良CO的调节₂同化。

叶片JA和sa水平不影响叶片氮素获取竞争能力

除了光合速率，氮的有效性影响植物的生长和防御。在低氮条件下，n attenuata则与生长在高氮水平下的植物相比，植物生长速度较慢，氮密集型防御化合物水平较低[31］．此外，当在竞争环境中生长时，植株产生胰蛋白酶抑制剂(TPIs)的能力受损，这是一种ja诱导的氮密集型防御，植株会产生更多的种囊，并且比邻近的WT植株更高[32］．基于这些结果，irSIPK、红外WIPK和红外LOX3人们期望植物放弃在氮密集型防御代谢产物上的氮投资成本[20.，33］．几行证据表明JA [34和SA [35，36会影响植物的氮同化和代谢。基于这些发现，我们评估了三个转基因品系与WT相比的生长差异是否由于氮获取的竞争可利用性的改变。我们将3个转基因品系和WT以竞赛成对的方式种植，并在花盆中以K的形式进行氮脉冲标记¹⁵没有_3.．虽然红外WIPK和红外LOX3伤前植株总氮含量高于WT植株(方差分析，F_2102年= 29.25, p = 9.1e^-11年；数字6A)，处理后它们表现出与WT相似的氮含量。此外，所有转基因系含有相似数量的¹⁵N与相应的WT植株比较(方差分析，F₉₄= 0.98, p = 0.44;数字6B)和only。SxN显示出处理效果(韦尔奇两个样品t-test, p = 0.009)。而且，所有转基因株系的种子总氮和总氮含量相近¹⁵N个内容(附加文件3.:图S2)。因此，我们得出结论，在这些生长条件下，叶片中的JA和SA水平与氮的吸收和含量无关。然而，我们不能排除ir的生长和适应度表型WIPK、红外LOX3和红外SIPK一旦氮被植物吸收，就会受到生长和繁殖过程中氮分配变化的影响。

MAPKs的激活是草食动物感知反应中最早的分子事件之一[15］．在这项研究中，使用反向遗传学方法分析了保持两个草本诱导的MAPKs，即NaSIPK和NaWIPK，是否会给本地烟草物种带来适应度成本。我们的数据表明，虽然沉默这两个MAPKs取消了草生诱导的JA的产生，这是已知的对植物的适合性成本WIPK-沉默的植物从这些减少中受益于生长和适合度的提高。这些结果表明，除了JA信号和JA相关的防御外，SIPK和WIPK还调节植物在食草性感知后的不同生理反应，这些反应对植物的适应性最大化有深远的影响。其中一种反应是SA信号。

SIPK和WIPK沉默对SA水平的影响不同

SIPK和WIPK经常被证明调节对生物和非生物胁迫的类似反应[37］．这两种MAPKs都冗余地调控番茄和植物的防御反应和创面诱导的JA/JA- ile水平n attenuata则（[15，16];［20.])。在n attenuata则，这两种激酶都调节着防御食草动物的重要基因的转录水平[15包括LecRK1，它对草质诱导的SA下调至关重要[19］．有趣的是，沉默导致SA水平升高的只有SIPK-，而不是WIPK-;模拟草食后，WIPK在叶片中积累的SA甚至略少，这表明LecRK1转录本的调控并不是SA水平积累差异的原因(图1)3.B)。沉默SIPK，但不是WIPK，影响植物诱导的ET水平n attenuata则．类似地，只有缺乏MPK6的植物，SIPK的同系物答:芥，但MPK3 (WIPK同系物)缺乏的植物表现出食草诱导的ET水平降低[15，17］．Diezel和他的同事证明了这一点n attenuata则ET生物合成或感知受损的植物积累了更高水平的草生诱导SA;同样，sa介导的信号转导被ET抑制答:芥［38，39］．综上所述，这些结果表明sisipk沉默植物中SA水平的增加是ET信号受损的结果。未来的实验旨在恢复sisipk沉默植物的ET排放，将有助于理解ET在ir中介导SA表型中的作用SIPK植物。

增加SA能掩盖ja介导的ir折衷吗SIPK植物吗?

据报道，JA-和甲基JA诱导的反应对几种植物的生长和适应性有负面影响[10，40，41当JA水平或JA/JA- ile敏感性从基因上降低时，植物的生产力就会提高([9]、[42])。降低JA水平也能促进植物生长和适应性WIPK- - -LOX3沉默n attenuata则植物(数据2而且4)．相比之下，irSIPK这些植物的植性诱导JA水平下降幅度最大(图3.)，对生长和健康都没有好处。通过高SA水平的负串扰抑制ja诱导的防御反应已被深入研究(综述在[43])。在n attenuata则研究发现，SA水平升高会强烈抑制对食草动物的防御反应[19，38］．尽管oeNahG植物在基础SA水平上没有表现出差异，这与[19， oeNahG植物仍然产生更多的生物量和适合度时，与竞争的WT植物。在oe中，除了叶片外，其他组织中的SA水平可能会降低NahG植物。未来的实验旨在分析SA在其他组织(如根)中的水平，可能会揭示这一现象。通过穿过irSIPK与oeNahG在sisipk沉默的植物中，我们测试了较高的SA水平是否可以掩盖JA缺陷介导的生长效益。虽然SxN与oe相比，植物表现出相似的SA水平NahG时，交叉累积的JA显著减少(图3.)．然而，生物量和适合度的提高NahG植株的生长不会因缺乏ja而进一步增加SxN这表明sa独立通路可能也参与了抑制缺乏ja的ir的生长效益SIPK植物。虽然我们没有观察到发育异常的反应SIPK这些植物还可能具有其他多效性作用，可能影响植物的生长和适合度。例如，研究表明沉默拟南芥中nasipk同源基因MPK6会影响气孔模式[44- - - - - -46］．在n attenuata则ir的气孔大小和密度SIPK植物与WT植物相似(数据未显示)。未来的研究旨在确定由SIPK调节的特定磷酸化靶点，将有助于阐明它在植物生长和适应性调节中的重要作用。

JA-和sa介导的植物生长抑制机制

SA对光合作用的对比作用已被描述过[7，29，47- - - - - -49]，而JA被认为对光合作用相关基因表达有负面影响[21］．使用我们的设置，我们没有发现SA或JA水平与光合速率之间的明确相关性(图5)．由于我们的测量只是时空快照，我们不能排除光合作用与SA或JA水平在其他生长阶段或不同组织中是相关的。

植物在资源有限条件下生长的另一个重要特征是吸收氮的能力，这一特征被证明在竞争中被ja处理所改变n的抗旱性植物(50］．然而，与我们的光合作用测量结果类似，我们没有发现能够解释所有JA和SA缺乏品系生长表型的明确的氮吸收模式(图6，附加文件3.:图S2)。我们的数据不排除氮代谢作为生长促进因子的变化。所有ja信号减弱的转基因株系的氮密集型防御代谢产物水平都低于WT [20.，21，从而将氮资源分配给生长和繁殖。鲍德温(51]讨论了作为资源配置过程的适应度优化，并证明了尼古丁(一种ja诱导的氮密集型防御代谢物)的生物合成可以减缓生长[52］．ja诱导的新固定碳和氮分配到附加的次级代谢产物途径最近在n .烟草［53，54]，这可能会导致额外的资源重新分配。进一步的实验需要对不同的氮池进行详细的分析，以充分了解氮分配在JA和SA干扰和不干扰下调节植物生长和适合度的作用。

除了调节代谢物通量，SA和JA还可以通过调节激素途径影响发育过程。SA可以通过调节细胞膨胀来调节生长，可能是通过生长素，[55，56]并可能通过其与细胞分裂素和油菜素内酯途径的串扰调节细胞周期[57，58］．JA还被证明通过调节细胞周期和细胞数量来影响植物生长拟南芥(张等，[59])。因此，其他激素途径的改变也可能影响这里报告的生长模式n attenuata则MAPK、JA和SA水平改变的植株。

诱发性成本

我们假设，MAPK信号传导带来的生长和适应性权衡只会发生在模拟草食诱导植物时，因为这种处理高度激活sisipk和WIPK。除了SIPK-沉默植物，所有其他转基因系，包括LOX3-沉默和oeNahG即使没有模拟草食，植物也会产生更多的干质量和蒴果(图2而且3.)．这些数据表明，WIPK活性的基础水平，JA或SA损害生长和适合的竞争n attenuata则植物。在它们的自然环境中，同步发芽n attenuata则火灾后的第一个生长季节的植物，这反过来是由于检测到烟雾衍生的发芽线索，导致了高度的种内竞争(Baldwin等。60)，我们的增长设置旨在捕捉这种自然环境压力。然而，与同质体的竞争可能会诱导除叶片以外的其他组织(如根系)中的WIPK活性、JA或SA水平。因此，其他组织中防御性状水平的降低可能导致对照、未诱导植物生长和适应度的提高。比较不同组织的防御性状，如根n attenuata则在单个花盆中种植的植物与竞争的植物将有助于回答这些问题。

几项研究表明，食草动物的攻击改变了植物的光合能力[60- - - - - -64]，而且光合作用蛋白通常下调[65］．我们的数据表明，JA和SA介导的生长和适应性成本与光合调节无关，但我们不能排除WIPK活性直接影响光合活性，因为我们的数据显示，在未诱导的ir中光合作用较低WIPK植物(图6)．此外,红外SIPK、红外LOX3和红外WIPK植物的光合活性表现出处理效应(图5)．因此，LOX3、SIPK和WIPK活性可能在草性光合作用调控中发挥多重作用。

对照它们的光合速率，控制irWIPK植物和红外线LOX3植株莲座丛叶中总氮含量显著高于相应的WT植株(图6)．这些结果表明，WIPK和LOX3活性基础水平的成本可能会因氮资源的增加而被摊平。

的生活史n attenuata则植物可能需要基本水平的SA, JA和WIPK活性，这带来了生长和荚膜产量下降的代价。WIPK和ja介导的防御是由自然界中以这种植物为食的大量食草动物的攻击引起的，这些防御利用适应度限制的资源进行生产。然而，sa介导的防御反应的重要性n attenuata则只是被理解得很差。我们的研究表明，保持SA区对健康有重要作用n attenuata则不仅通过调节JA诱导反应，而且SIPK与其他两种成分结合，在OS诱导过程中抑制SA反应，反应允许不受约束的JA介导的防御生产:乙烯爆裂[38和LecRK1 [19］．性能分析n attenuata则需要在自然条件下具有不同SA水平的植物来识别需要明显昂贵的SA途径的适应性增强因素。

在这项研究中，我们分析了维持原生烟草中介导早期草质诱导防御反应的信号元件的适应度结果，烟草attenuata则．我们的数据表明，沉默两个草食诱导MAPKs，NaSIPK而且NaWIPK，强烈降低JA水平，但只是NaWIPK在我们的竞争实验中，沉默的植物从这些减少的防御反应中受益，生长和适应性水平提高。我们证明了这一点irSIPK-植物没有意识到通常缺乏ja的植物所享有的健康益处，部分原因是NaSIPK-沉默导致更高水平的SA。光合作用和氮获取速率不能解释我们设置的生长差异，这表明观察到的生长表型是由资源分配或信号介导的生长减少介导的。未来的实验需要确定具体的代谢途径，通过SA-和ja信号转移资源从生长和繁殖。在这一分析中，确定SIPK的其他监管目标是至关重要的。植物诱导的MAPK活性和JA信号通路在自然资源中有所不同n attenuata则［66- - - - - -68目前正在分析SA途径的自然变异。确定MAPK、JA和sa介导的植物生长和适应性途径的成本有助于我们理解这些诱导防御信号系统遗传变异背后的生态机制。

植物生长条件

发芽

野生型烟草attenuata则托。前，沃森种子30^th(田野和第一个温室实验，图1)和31^th(其他实验)用1988年在犹他州沙漠客栈农场收集的种子繁殖后代。52]和不同转基因株系的种子，根据Kruegel等人的研究，在Gamborg’s 5培养基上进行杀菌和发芽。[69］．对于每一种结构，都有几个独立转化的纯合子系，包含具有相似表型的单插入，并已被完全表征。由于实际原因，我们只使用了前面描述的一个转基因系。在本研究中使用的转化线以前在下列出版物中描述过:irSIPK(A-109)和irWIPK(A-56)，见[20.];oeNahG(A-481)在[24，70]和[19];作为LOX3(A-300)在[21];红外LOX3(A-562)，在[71］．在使用as之后LOX3在第一个实验中，我们使用了新产生的红外线LOX3因为它们的JA水平明显降低(os诱导的JA含量降低22-50%)LOX3［21， ir为81-83%LOX3（[71]，与WT植物相比)。

温室

在温室实验中，植物在发芽10天后被转移到Teku罐中。10天后，植株被种植到2升的竞赛花盆中。转基因植物总是与WT植物配对。以两株WT植物为对照。按照Kruegel等人的描述，植物在26-28°C、光照16小时下生长。[69］．在2010年的温室实验中进行了如下修改:Frühsdorfer Nullerde作为底物，添加0.5 g/L PG Multimix(转移到2 L罐中后14、16和18天)，0.85 g/L磷酸盐，0.05 g/L Micromax (Scotts)， 0.35 g/LMgSO₄7小时₂O添加到土壤中。作为肥料，添加Peters Allrounder (Scotts)(第7-14天20 g/400 L，第14 - 21天40 g/400 L，第21天15-30 g/400 L)和额外的硼砂(第1 - 7天3 g/400 L，第7-14天2 g/400 L，第14天1 g/400 L)。为了在限氮条件下进行试验，所有试验均在植株转移到2 L花盆后停止外部补氮。

场

按照Meldau等人的描述进行了现场实验。[20.］．简单地说:幼苗在发芽后15天被转移到含水泥炭球中。经过14天的逐步适应当地的环境条件SIPK和红外WIPK每株都与一株大小匹配的WT植株配对，移植到莱特尔牧场保护区的灌溉田块中。转基因植株在APHIS通知(06-242-101 n)下释放。移植到田间后30天测量生长。

植物处理和性能测量

8天后转移到2 L的竞赛花盆中，每对植株被脉冲标记10.2 mg (5.1 mg¹⁵N和5.1 mg¹⁴N)氮为KNO_3.(Chemotrade,莱比锡;默克公司)。3 d后，给植株吸收标记氮的时间，用图案轮损伤(W)最老的沉叶、最年轻的源叶和过渡叶，穿刺伤口立即用10 μL 1:5稀释剂处理Manduca sexta口服分泌物(OS) (W + OS)连续3天，以模拟持续的草食动物摄食损伤。这种处理方法有效地模拟了食草动物的攻击，并允许均匀的诱导动力学[72］．

标记时最老的沉叶在第一次处理后8天收获，而未处理的植物样本作为对照。当所有植株伸长并在芽形成之前(最后一次处理后6天)，S1叶被损伤并按照莲座叶处理。在萌发后的第63天到第65天之间，分别计数开花和闭合的花和蒴果。12天后收获植株，烘干3天以测定干质量。

在体外幼苗生长试验

WT和转基因株系(irWIPK、红外SIPK和红外LOX3)n attenuata则在温室试验中用于幼苗生长测定。种子经过杀菌和发芽(Kruegel等，[69)在由H_3.薄_3.10 μM, MnSO₄0.5 μM, ZnSO₄0.5 μM, CuSO₄0.1 μm (nh₄）₆莫₇O₂₄Fe-EDTA 15 μM, KH₂阿宝₄0.5 mM, MgSO₄1.2 mM, acl₂2.0 mM，氮作为KNO提供_3.氮浓度为2 mM时[73］．秧苗转移到1/4^th当根长约为1 cm时，用于竞争试验的强度介质。将固化后的1/4切成120 × 120 × 17 mm的竞赛实验专用方形培养皿^th将介质分成1厘米宽的块，块与块之间的间距为0.5厘米;上面大约两厘米被切开。在每个区块，野生型幼苗与irWIPK或irsiik或irLOX3等长度的幼苗配对(另见附加文件)2:图S1)。这些枝条被放置在上部充满空气的部分。移栽到砧板上后，每株幼苗的子叶，用弯钳的刀尖切开一片(做三个针孔)。用一层织物胶带包裹培养皿(Micropore 3 M Health Care, Neuss, Germany)，以便气体交换，并垂直放置在生长室中(Kruegel等，[69)，以确保树根能长到底部。嫩枝生长在地块上部充满空气的体积中。让幼苗适应转移冲击一天，之后每天监测根系的生长情况。在7 d的竞赛试验结束时，测定了竞赛对的两个成员的根和嫩枝的鲜质量:野生型及其竞赛转化系。

植物激素分析

为了进行植物激素分析，按照上述方法种植植物。这些植物仅用于植物激素分析，未纳入其他分析。将幼嫩源叶移栽到2 L竞赛罐中10 d后采作对照，然后将过渡叶损伤，用20 μL 1:5稀释处理m . sexta口腔分泌。处理过的叶子在去除中脉一小时后收割，并立即在液氮中冷冻。提取后，植物激素在LC-MS / MS系统(Varian 1200三四极-LC-MS系统;瓦里安，帕洛阿尔托，美国，根据[17])。

光合作用测定

通过测定CO间接测定光合作用₂同化率。采用含400 μmol/mol CO的LI-COR 6400便携式光合系统(LI-COR Bioscience)进行了至少5次重复的光合分析₂浓度和光强1200 μmol/m²/s表示测量值。

同位素比质谱法样品制备

¹⁵采用元素分析仪-连续流动-同位素比质谱(EA-CF-IRMS)分析种子和叶片的氮含量。每株在发芽后71天收获一粒胶囊。当胶囊出现第一次开放的迹象时，就被收割了。种子在室温下干燥2周后测量。在标记时间点最老的沉叶叶片在最后一次处理后5天收割，在60°C下干燥48 h，均质后分析。

为了适应IRMS的高灵敏度，样品被稀释到约1原子%的最终标记¹⁵N通过加入标准物(乙酰苯胺;爱丽丝-1)到样本。种子重0.3 mg±20%(约2粒)，与标准含量0.7819 mg±20%的锡胶囊装入40 μL。约0.1250 mg±20%的均质干燥植物材料用0.8325±20% mg的标准品稀释。准确的样品和稀释质量被确定并用于计算¹⁵N丰度。对每个样品进行3个技术重复分析。

同位素比质谱分析

锡胶囊被密封并燃烧(在1020°C氧化，在650°C恒定的氦流中还原(80毫升每分钟)^－1)定量转化为CO₂N₂和H₂元素分析仪中的O (EuroEA CN2 dual, Hekatech, Wegberg，德国)。通过产地来源证后₂/疏水阀(NaOH/MgClO .₄)和85°C的cn色谱柱，剩下的N₂通过开放分裂转移到耦合同位素比质谱仪(IsoPrime, Micromass, Manchester, UK)。实验室工作标准采用IAEA-N-1标准物质与δ¹⁵N值+0.43‰。咖啡因标准(cafe -1)与样品一起分析，作为整个分析过程的长期性能监测的质量分析参考材料(详情见Werner等人，[74])。

氮的同位素比

与国际标准N₂(空气)¹⁵R_性病= 0.0036765。

通常以‰(每百万)表示

根据δ符号，同位素丰度¹⁵N(%)用1.6计算。

根据下面的方程

用乙酰苯胺(alice-1， δ¹⁵N_alice-1=−1.36,10.36% N)的计算基于以下关系:

与¹⁵N(%) =原子百分比¹⁵N;R_圣=标准同位素比值;Alice-1 =用于稀释的乙酰苯胺;Sa =被测样品;m =质量;%N =总氮含量;Pt =植物组织样品;totN =总氮质量

统计分析

所有的统计分析都使用软件程序R (R development Core [75]及其图书馆(http://www.r-project.org/)．对于方差分析，如果方差的同方差假设被违反或残差不服从正态分布，则在分析之前使用Box-Cox变换对响应变量进行转换[76］．Box-Cox-lambda使用Venables’和Ripley’s MASS库对r进行估计，所有模型使用Akike的信息准则简化为最小充分模型[77］．韦尔奇二样本T-test用于解释某些数据集的异方差。为了便于所有统计分析的比较，在所有情况下都采用了这种检验方法。

感谢Shiva Jung Pandey和Willi Brand的技术支持;Karin Groten, Matthias Erb, Dorothea Meldau和Michael R. Zeunert为手稿提供了有益的评论，杨百翰大学使用了它了不起的野外工作站，Lytle牧场保护区，马克斯·普朗克协会提供了资金。

作者指出

1. Geetha Govind

   现通讯地址:德国莱布尼茨植物遗传与作物植物研究所分子遗传学系，科伦斯特3号，盖特勒本，D-06466

从属关系

1. 马克斯·普朗克化学生态研究所分子生态学系，Hans-Knöll-Str。8，耶拿，D-07745，德国

   斯特凡·梅尔道，林恩·厄尔曼-泽纳特，吉塔·戈文德和伊恩·T·鲍德温

2. 马克斯·普朗克化学生态研究所生物有机化学系，Hans-Knöll-Str。8，耶拿，D-07745，德国

   巴特拉姆Stefan

相应的作者

对应到Stefan Meldau或伊恩·T·鲍德温．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

SM和ITB进行了田间试验;SM和LUZ进行了温室实验;GG和ITB的建立和GG的执行在体外幼苗竞争试验;SB、SM和L UZ进行IRMS测量;SM、LUZ撰写稿件，GG、SB、ITB编辑稿件;LUZ进行了统计分析;SM、LUZ、GG和ITB设计了实验。所有作者阅读并批准了最终稿件。

Stefan Meldau, Lynn Ullman-Zeunert对这项工作做出了同样的贡献。

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