共表达分析确定了CBP60g和SARD1调控的假定靶点gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水杨酸是植物防御反应中的重要信号成分。在拟南芥中，由gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba是水杨酸生物合成的关键，以应对生物挑战。最近，钙调素结合蛋白CBP60g及其最近的同系物非钙调素结合蛋白SARD1已被证明能结合钙调素启动子区域gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．损失两者gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba严重影响植物产生SA的能力，以应对细菌接种，使植物易受感染的植物。在电泳迁移率偏移测定中，显示CBP60G和SARD1与序列Gaaatttggg的10mer寡核苷酸特异性结合。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在定制微阵列上的基因表达分析鉴定了一组基因，如gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba，下调gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba突变体植物。通过一组确定的ATH1全基因组微阵列实验进行共表达分析，扩展了该基因集;然后应用聚类分析对紧密相连的基因进行分组。严格的共表达阈值确定了两个相关的钙调素样基因紧密相关gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba被发现与促进者区域显着富含GaAatt主题的基因。基因聚类gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba在gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba双突变体。发现来自GaAATT基序的其他簇的代表性基因在双突变体中进行各种下调，不变或上调。以前表征的共同表达gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba和gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba在该分析中未复制，但包含在实验的子集中gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba与之联合表达gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

CBP60G SARD1信令网络的推定组件已通过共表达分析揭示。除了那些规定的基因gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba有些人被CBP60G和SARD1压制。gydF4y2Ba

存在具有重叠组件的两个主要机制来保护植物免受感染。模式触发的免疫（PTI）涉及识别保守的不可或缺的微生物结构，例如鞭毛蛋白。这些微生物相关的分子图案（MAMPS）被诸如FLS2的模式识别受体（PRR）识别，其识别鞭毛素，并刺激信号网络以详细说明适当的防御。为了摆脱这种基础免疫免疫反应，适应的病原体必须生产和提供能够解除植物监测和对策的效果。因此，第二种保护机制是效应触发免疫（ETI），由此植物植物效应或其具有抗性（R）基因产物的靶标。对病原体效应器的识别再次刺激信号网络，其中许多元素与PTI相同，但通常更加剧烈后果[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．植物激素在PTI和ETI之后的信号转导中发挥关键作用，水杨酸(SA)在介导对生物营养和半生物营养病原体的保护中起关键作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．在感染后，水杨酸可在局部和全身积累，对于建立全身获得性耐药(SAR)和发展持久的、广谱的对通常毒性病原体的耐药至关重要[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

对于ETI和PTI, SA的积累和作用依赖于几个共享组分。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaEDS1 / PAD4节点位于SA生物合成的上游，因为两个相互作用蛋白对于激活SA信号扇区是必不可关键的[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．SID2已被确定为SA生物合成中应对生物挑战的关键成分;gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba编码一种能够催化催化来自Chorismate的SA前体的形成的等致肥料合酶[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．对SA的积累也至关重要的是MATE转运体EDS5，它可能参与SA生物合成前体的运输[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．在SA生物合成的下游，NPR1参与了SA依赖性基因表达的激活。适当的SA水平和适当的氧化还原条件导致NPR1单体化，使其进入细胞核并与TGA家族的转录因子相互作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．最近的研究已鉴定NPR1或副病剂NPR3和NPR4，为SA受体[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．吴gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．结果表明，SA与NPR1相互作用产生构象变化，使NPR1 BTB/POZ结构域与TGA2相互作用。而傅gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．没有观察到NPR1的SA结合，他们表明NPR3和NPR4可以充当SA依赖性适配器，用于对SA的不同亲和力的NPR1的蛋白酶体降解巧妙地调节对不同SA浓度的响应。gydF4y2Ba

随着SID2占据防御信号通过SA的转换中的关键作用，已经努力了解其规定。正稳压器gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba已经鉴定了表达，例如Wrky28，其已被证明已与之结合gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba促进者和诱发gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba转染检测中的表达。电泳迁移迁移分析(EMSA)显示，WRKY28与保留TGAC核心的共识W-box motif的一个修改版本结合[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．消极的监管机构gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba表达也被揭露了;EIN3已被证明绑定到gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba启动子和组合突变gydF4y2BaEIN3.gydF4y2Ba及其密切的同源物gydF4y2BaEIL1.gydF4y2Ba显示升高gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba表达，SA积累和增加对细菌感染的抗性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．类似地，发现存在三种相关的NAC转录因子（ANAC019，ANAC055和ANAC072）抑制gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba表达，SA积累和对细菌感染的抗菌感染显示anac019所示与gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba推动者[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

另外两个基因参与了gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba是gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba．CBP60G是钙调蛋白（CAM）结合蛋白系列的成员，该蛋白质被鉴定为响应于伴随处理的强烈诱导。植物携带gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba无效突变在诱导gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba和Sa的积累[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．CBP60g在Ca中结合CaMgydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba依赖的时尚;gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba在废除凸轮相互作用的凸轮结合结构域中具有突变的转基因是不能补充零突变体的。独立地，在全身获得的抗性缺陷的筛选中鉴定了CBP60G的最近同源物理学，并命名为SARD1 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．SARD1虽然与CBP60g的关系比CBP60家族的其他成员更密切，但并不与CaM结合[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．这两个gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba和gydF4y2Basard1gydF4y2Ba在SAR中受到损害，双突变体更受强烈影响[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．线过度表达gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba累积比野生型植物更多的sa [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，而双敲除突变体在应答感染时SA积累严重受损[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．显示CBP60G和SARD1都被证明与启动子结合gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba在EMSA实验中，发现两种蛋白质的中央DNA结合结构域与选自的序列Gaaatttggg序列结合gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba推动者[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba在SA信号中具有部分冗余功能，其两个突变体影响SA累积和病原体生长，但具有较大的双突变体比添加剂效果更大[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．虽然功能明显重叠，但除了凸轮绑定的要求外，还有各种区别：CBP60G似乎对防守信号传导的早期事件的影响更大，并在稍后扮演更加突出的角色;通过CBP60G的损失比SARD1的丢失更大，MAMPS触发信令更大地影响[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．在转录组水平的表达式指纹gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba更紧密地相似gydF4y2BaSid2.gydF4y2Ba比gydF4y2Basard1gydF4y2Ba在伴随的反应期间，虽然趋势在较毒性的细菌感染的时间点越来越逆转[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

而gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba突变体急剧减少gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba双突变体对生物胁迫下SA的表达和积累更为敏感gydF4y2Ba假单胞菌含油gydF4y2Ba光伏gydF4y2BamaculicolagydF4y2BaES4326（gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326）比gydF4y2BaSID2-2gydF4y2Ba表明CBP60g和SARD1在sa独立防御信号中的作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．使用定制微阵列鉴定CBP60G SARD1调节的潜在靶标，其中25个基因（来自571个基因的阵列），包括gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba在双突变体中被下调。这些基因的启动子分析发现了Gaaattt基序的显着性富集，张某使用的低聚物片段gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。的EMSA学习。同样张gydF4y2Ba等等gydF4y2Bal.注意到在其他PTI和ETI研究中上调的基因中aattt基元的富集。gydF4y2Ba

随着全基因组转录谱的出现，许多研究利用丰富的微阵列数据来识别新的途径成分，基于它们与已知元素的共表达。例如，在纤维素合成和类黄酮生物合成中涉及的其他酶的发现，是基于它们与公开的阵列数据中的已知基因的相关性[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．这种类型的分析也揭示了控制硫代葡萄糖苷生物合成和脂肪酸生物合成的新的调控元件[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．事实上，正是共表达分析首次揭示了gydF4y2BaSID2gydF4y2BaWrky28 [gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．有趣的是gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba和gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba仅在涉及压力处理的一系列实验的子集中观察到。假定CBP60g SARD1基序在下调的基因样本中富集gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba我们决定使用共表达分析来扩展这个子集，并寻找类似的motif富集，以确定CBP60g SARD1控制的额外潜在靶点和信号网络的额外成分。gydF4y2Ba

表达式模式gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba，gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba,gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba是相关的gydF4y2Ba

我们以前的工作表明gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba的作用大于gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba在MAMP响应期间，而在对gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326。来测试在表达水平的关系中是否有类似的效果gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba到那样gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba，我们在用鞭毛蛋白片段FLG22或叶片浸润后监测这三种基因的表达gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326，对感染后的前9小时的每小时抽样，然后在24小时后进行最终取样。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表明，在FLG22处理后，CBP60G诱导前面gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba归纳，表达gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba已经在1小时内显着上调，并在整个时间内保持更强烈的折叠诱导。表达剖面gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba被那个紧密镜面gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba略有不同的是，CBP60g诱导更迅速地被激活。因此，皮尔逊的相关性为相似性之间gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba表达模式较高(0.92)gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba：gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba相关性（0.66）。接种后观察到不同的模式gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326。而gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba从3小时开始对感染反应更快吗gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba上调监管与gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba然后从8小时开始超过。后来的上升gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba转录更紧密地匹配gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba比gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba．相关值相对于FLG22接种相反，0.64gydF4y2BaCBP60G：SID2.gydF4y2Ba和0.93gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba．这些结果与这个想法一致gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba有更大的效果gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba在gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba使用MAMPS响应的表达式，而反向在响应期间是真的gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326。gydF4y2Ba

用于定义的数据集的选择gydF4y2BaCBP60g / SARD1gydF4y2Ba调节龙gydF4y2Ba

我们假设，通过挖掘与45个表达被抑制的基因共同表达的基因的公共基因表达数据，可以识别CBP60g和SARD1控制下的基因gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba，gydF4y2Basard1gydF4y2Ba或gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba使用小型防御相关的自定义微阵列（Geo：GSE18865 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba])。为了做到这一点，我们想要选择一组合适的数据，因为包含许多没有诱导防御基因的实验可能会增加分析中的噪音。例如，WRKY28和SID2之间的关系仅在ATTEDII共表达数据库的一个子集中观察到，该数据库仅限于应力相关分析实验，并排除了其他数据[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．我们从使用Affymetrix Ataz1拟南芥阵列进行的308表达分析实验中收集了数据，该治疗方法与病原体感染，应激反应，激素治疗或相关突变有关，以及发育系列。实验范围为六到几百个阵列。每个实验的数据相同地处理;保守的方法是通过在批量标准化之前除去的任何偏远阵列进行质量控制，并通过RMA摘要。在每个实验中，Spearman等级相关系数gydF4y2BaCBP60G：SID2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba与相关显著性的相关p值一起计算。结果如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．在许多实验中，两个相关性都是强烈的，但也有实验gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或者只是gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba与之强烈相关gydF4y2BaSID2。gydF4y2Ba在应用MAMPs激发子的几个实验中gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba是否大于两者之间的相关性gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．例如在标记(a) (NASCARRAYS122)的实验中，用flg22、细菌蛋白HrpZ、真菌蛋白NPP1处理幼苗或制备细菌脂多糖gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba相关性是0.83而gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba相关是0.39。同样在（B）（Ausubel Lab IMDS - FLG22和OGS [gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba[含有FLG22的治疗和植物衍生的危险信号寡糖醛糖苷gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba相关性为0.81，而SARD1相关性为0.52。然而，并非所有的MAMP治疗实验都产生了相同的辨别，In（c）（Ausubel Lab IMDS-chitin 8mer）用真菌衍生的甲壳素片段处理对两者产生同样强烈的相关性gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba分别为0.88和0.90。其他实验显示出更强gydF4y2BaCBP60g SID2gydF4y2Ba相关性包括研究塑性函数的实验。在（d）（EBI ArrayExpress E-MEXP-2927 [gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]）体积生物生成组分中的禁止突变SCO3产生agydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba相关0.89的相关性gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba相关性为0.2。过量光或施加电子传输抑制剂在（e）（EBI Arrayexpress E-MTAB-403）的影响也导致了特定的gydF4y2BaCBP60G：SID2.gydF4y2Ba相关性，0.90与0.28相比gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba．阵列实验更强大gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba：gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba相关性包括:(f)gydF4y2BaPhytophthora parasitica.gydF4y2Ba感染的根源;(g) ABA信号转导和SA生物合成的联合突变;(h)胞外成分EXO70A1突变;(i)钾饥饿和铯中毒的比较(NASCARRAYS468;GEO GSE16913, (gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba];NASCARRAYS435;NASCARRAYS105)。虽然在具体的、歧视性的联系方面有一些有趣的趋势gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba目前没有足够的数据集来构建特定的共表达网络。在大多数实验中在哪里gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba强烈而且明显相关gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba同源物也呈正相关，提供足够大的数据集以形成鲁棒的共表达网络。根据这些结果，我们决定使用包含2,245阵列的125个实验，其中gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba表现出强烈而显着的相关性gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba至少为0.7,p值不超过0.05。gydF4y2Ba

一些基因簇与gydF4y2BaCBP60g / SARD1gydF4y2Ba- 依赖基因具有富含GaAatt主题的启动子gydF4y2Ba

我们推断，通过将表达模式类似于45个表达减少的基因聚类gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba，gydF4y2Basard1gydF4y2Ba， 要么gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba植物，我们可以识别额外的防御基因，其表达水平由CBP60G和/或SARD1控制。在聚类之前，我们探讨了选择共表达基因的不同标准。我们将Spearman的等级相关性作为相似度的量度，并确定使用0.85至0.70的不同截止值获得的探针数量（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.对于所获得的每组基因，我们计算了他们的启动子中Gaaatt主题的数量。以前的差异表达基因的启动子分析已经得分为GaAatt，作为CBP60G SARD1结合基序的最重要的子组分[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．然而，在试点聚类分析中，并且在所有后续分析中，发现缩短的GaAATT主题在包含的簇中具有更大的统计过度表示gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1）。因此，我们使用Gaaatt主题而不是长长的Gaaatt图案来评估分析的各种阈值和聚类度量。0.85相关切断显然太严格，因为它识别了59个探针，只有14个超过45次用于开始分析。0.80截止鉴定的128个探针，每种基因2.77个图案。这似乎是一个合理严格的标准，我们使用了对一个聚类分析的这些128个探测器 - 实验＃1。当相关截止截止放松至0.70,518探针时，鉴定了518个探针，尽管具有2.52基因的较低平均电泳的平均密度。然而，这些包括许多对应于其启动子中具有4个或更多基因的基因的许多基因，表明0.80截止可以排除CBP60G SARD1调节的一些潜在靶标。我们使用了第二集群分析的更大集合 - 实验＃2。gydF4y2Ba

对于这两个聚类实验，我们使用DPClus [gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba[识别与实验＃1和0.7或更高的连接的连接内部的密集互连节点，与实验＃1和0.7或更大的相关性。簇的生成受到集群内的最小连接的阈值的限制，并且即使平均连接密度通过阈值，也会从集群中喷射群集的簇的周边跟踪的参数。这两个参数影响聚类分辨率和区分共表达网络内的子网的容量。可以形成重叠簇允许一个基因节点跨越多个簇，而一些稀疏连接的基因可以被排除在所有簇之外。测试各种参数，群集或群集含有gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba评估。在每一个例子中，GAAATT基序在gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba聚类和能产生观测到的最大统计显著性的参数被选择用于最终分析——最小密度值为0.75,CP阈值为0.75。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA显示实验＃1的结果。128个探针形成15个簇，范围为3至16个基因，每个基因的平均基序数为每种基因1.4至4.33个序列。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab显示实验＃2的结果。518个探针形成58个簇，范围为5至113个基因，每个基因的平均基序数为每种基因0.86至4.2个基序（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S2和附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S3）。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba簇被GAAATT基序和防御基因富集gydF4y2Ba

作为gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba已被报道为CBP60g和SARD1的直接靶标，我们研究了含gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba接近一点了。在实验＃1，gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba属于集群3。该集群的内部结构如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2Baa.它还包括五个基因gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba：群体的连接密度为1，基因最强烈地表达gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba是gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba．gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba是编码含有钙的钙调蛋白样蛋白质的基因家族的两个成员。它们与在ATH1阵列上没有代表的第三个家庭成员密切相关，gydF4y2BaCML45gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba包含在该群集中（尽管它仅由其两个探测器更可靠地表示）与推定的重金属运输车一起表示gydF4y2BaAGP5gydF4y2Ba．五个基因与之相关的gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba只要gydF4y2BaAGP5gydF4y2Ba存在于用于种子此分析的自定义阵列上。如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2BaB，POBO对这些基因的启动子的GaAATT基序分析表明该基序的富集是高度显着的（P值<0.0001）[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．qPCR证实，所有簇内成员的表达都是由感染引起的gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326，这种诱导显着抑制了gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba突变体gydF4y2BaAGP5gydF4y2Ba，gydF4y2BaAT5G52760gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba；gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba双突变体的表达较低，但p值较高，为0.097(图gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)。有趣的是,gydF4y2BaCML45gydF4y2Ba的最接近的同系物gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47，gydF4y2Ba是响应的上调gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326和这种诱导显着增强gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba植物（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

在扩展的实验集群中＃2gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba也是只有一个群集 - 群集2.图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba展示了gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba来自实验＃2的群集包含来自更严格的分析的所有基因，但包括31个探测器。图中所示的pobo分析gydF4y2Ba5gydF4y2BaB表示Gaaatt主题的富集在该集群中仍然非常重要。gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba是否是具有7个图案的Gaaatt主题密度最高的集群成员gydF4y2BaArck1.gydF4y2Ba，参与抑制ABA响应的受体样激酶具有6 [gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．QPCR用于调查该影响gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba在两个具有GAAATT丰富启动子的基因ark1和磷脂酶At4g38560上发生了双重突变，这两个基因之前未被确认参与防御(图4)gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）。除了两者gydF4y2BaSARD1.gydF4y2BaProbesets和gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba，该群集还包括许多已知在植物防御中起重要作用的许多基因，因为功能突变损失抗性。这些包括gydF4y2BaPAD4gydF4y2Ba［gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]，gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，gydF4y2BaADR1-L1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]，gydF4y2BaSobir1.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaWRKY46gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．对于使用Mapman过度表示工具的阵列上的所有探测器相比，该簇具有已知或推定受体激酶功能和涉及钙信号传导的基因的基因（gydF4y2Bahttp://mapman.mpimp-golm.mpg.de/general/ora/ora.shtml.gydF4y2Ba，[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba])。实验中的重金属转运蛋白基因＃1gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba群集被邻近的亲密同源物联接。预计群体中的三个基因含有Ankyrin重复。gydF4y2Ba

QPCR测试的所有7个成员被发现响应于A中的细菌感染而上调gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba依赖的时尚除外gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaC和gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）。虽然某些集群成员可能被证明是CBP60G SARD1调节的目标，但遗传分析和转录组分析已经放置了其他组分（gydF4y2BaPAD4gydF4y2Ba，gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba)的上游gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba因此，共表达网络揭示了SA介导的防御信号控制的多个阶段。这两个gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPAD4gydF4y2Ba先前已被描述为SA诱导，并且它们在前馈循环中的角色放大SA信号可以最好地解释它们的共同表达gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

除了Gaaatt之外，观察到其他图案在该群体中被过度代表。CCT N7 TCC Dyad过度，而CCT或TCC潜水物或与7以外任何介入长度的Dyad都被代表欠代表（图gydF4y2Ba6gydF4y2BaA-C）。这个主题被发现了gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba促进者接近转录开始网站。在群集中存在的23个CCT N7 TCC基序在1500bp启动子的近端750bp中，与Fisher精确测试的基因组分布相比，偏差显着偏差（p值= 0.005）（附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S2）。在任何簇中对于GaAATT位置或链没有观察到这种偏差。共有衣物转录因子结合位点的各种排列和[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba也观察到富集在SID2集群中（图gydF4y2Ba6gydF4y2BaD-F）。gydF4y2Ba

富含Gaaatt主题的其他簇的基因被抑制，引起或不受影响gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

将分析扩展到GAAATT motif的显著过代表的其他簇(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S4）均匀鉴定的病原体诱导基因表达（图gydF4y2Ba7gydF4y2BaA和B）。然而，虽然来自GaAATT的集群的一些代表性（Gaaatt丰富）基因，例如集群17，但是gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba依赖于qpcr完全诱导（图gydF4y2Ba7gydF4y2Baa）或已知从自定义微阵列研究中如此（gydF4y2BaPBS3gydF4y2Ba，gydF4y2BaAIG1gydF4y2Ba)，例如其他GAAATT富集群成员gydF4y2BaCNGC13.gydF4y2Ba从集群60开始，发现在一个中被诱导gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba独立的时尚。由于GAAATT是拟南芥启动子中普遍存在的基序，当被POBO重复取样时，小簇可能会因存在一个或两个具有大量基序的基因而被过度扭曲。gydF4y2Ba

发现一个较大的聚类，有26个基因富含Gaaatt主题的群集14群体含有gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba以及多种囊泡运输成分，包括一些被证明对SA稳态很重要的成分[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．但是,没有gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba依赖性表达gydF4y2BaSYP122gydF4y2Ba或gydF4y2BaSNAP33gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种）。W-Boxes和另一个主题，AAGTC都观察到这一集群中的显着过度表示，并且可以更好地解释集群内的潜在共调节（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S4)。代表明显相关的功能基因的另一个簇是簇15，含有病原体响应基因gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba和gydF4y2BaPNP-A.gydF4y2Ba．然而,尽管gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba之前已经证明需要CBP60g和SARD1进行充分诱导，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba没有显着影响。gydF4y2Ba

在某些情况下，发现选择监测给定群集的Gaaatt富含基因被上调gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba双突变体相对于野生型。gydF4y2BaAT1G51890.gydF4y2Ba和gydF4y2BaAT1G64610gydF4y2Ba．这一现象在12群的几个成员中被观察到gydF4y2BaPBP1.gydF4y2Ba在双突变体中具有显着增强的感染响应gydF4y2BaAt5g41750gydF4y2Ba和gydF4y2BaAt2g32030gydF4y2Ba在嘲弄接种突变体中上调。有趣的是gydF4y2BaMPK11gydF4y2Ba，编码PTI期间激活的地图激酶[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba[突变体中，观察到显着抑制的病原体反应和升高的基础表达。gydF4y2Ba

WRKY28：SID2.gydF4y2Ba共表达出现在本分析中包含的条件的子集中gydF4y2Ba

生物应激微阵列数据的先前共同表达分析已揭示了该调节gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba经过gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba以及SA生物合成组分的调节gydF4y2BaPBS3gydF4y2Ba经过gydF4y2BaWRKY46gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．而gydF4y2BaWRKY46gydF4y2Ba聚集gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba， WRKY46的拟议下游目标，gydF4y2BaPBS3gydF4y2Ba不与gydF4y2BaWRKY46gydF4y2Ba．同样的,gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba并没有发现与gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba在本研究中，并没有包含在实验2中选择的518个基因中。在选定的2245个数组的数据集中gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba排名为1775.gydF4y2Ba^TH.gydF4y2Ba最密切相关的基因gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba具有0.34的Spearman等级系数。通过EMSA鉴定为Wrky28的结合位点的修饰的W字幕基质在群集2中富集，但与研究的其他基序相比弱（图gydF4y2Ba6gydF4y2Baf).识别导致先前报告的情况gydF4y2BaWRKY28：SID2.gydF4y2Ba共表达，微阵列研究具有重要gydF4y2BaWRKY28：SID2.gydF4y2Ba相关图沿gydF4y2BaCBP60G：SID2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba热图中的相关性(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.协会gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba包括重要的研究子集gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba共同表达。然而，分析包括386阵列的31个实验gydF4y2BaWRKY28：SID2.gydF4y2Ba表达显着，大于0.7仍然导致了更强的关联gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba比gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba和gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba只上升到了69gydF4y2Ba^TH.gydF4y2Ba基因与gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在测量微阵列数据集时，加强了指向部分冗余的CBP60G和SARD1在介导免疫应答的不同方面的鉴别作用的各种证据链（图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.与flg22时间进程一样(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba更紧密的联系gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba在几种伴随的处理研究中观察到，有趣的几个实验与防御无关。不幸的是，尽管公开可用的微阵列实验丰富和各种各样的微阵列实验，但目前有太多的建立独立的相关网络gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba．青木gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道，基因共表达网络密度的稳定性需要至少100万阵列[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]并且需要在早期时间点进行采样的几个采样的特定实验，以将此阈值传递出不同的阈值gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba分析。存在gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba并且没有gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba在gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba用实验1中更严格的相关阈值聚类(图1)gydF4y2Ba4gydF4y2Baa）暗示组合的数据集可以朝向以后的感染时加权，因此，由于这些具有更高的揭示大规模差异表达在相对昂贵的基因表达分析研究中具有更高的差异概率。最近CBP60G致力于向非生物压力等反应介绍诸如干旱[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．虽然包括了许多非生物应激研究，但通过阈值的很少gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba与之相关gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．对干旱和渗透胁迫的两项特征明确的研究(NASCARRAYS - 139和141)进行更仔细的检查，发现了强的上调gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba响应于只有弱势的压力gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba响应，因此相关性低。在非生物应激处理的其他几个实验中也观察到类似的模式。初步分析显示gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba与实验2中使用的518个基因中的一个子集共同表达gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba仅在此数据集中仅用一个基因表示（附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：图S3）。一旦有关CBP60G在中介非生物应激反应中的作用，再次发现更多信息，重新审视这种共表达分析可能会证明富有成效。gydF4y2Ba

可能是来自Co-表达分析的最令人兴奋的发现gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba一直是核心中的两个钙调蛋白样基因gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba从实验1聚类。它们的相关强度与GAAATT基序的频率相结合gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba启动子及其与CBP60g的物理相互作用的潜力使它们成为进一步研究的理想候选者。而病原菌相关诱导gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba依赖于CBP60G和SARD1，但对此有薄弱和微不足道的影响gydF4y2BaCML46。gydF4y2Ba两者之间的进一步区别是在主要分析中gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML46.gydF4y2Ba在附加文件中使用的非生物应力数据集中具有0.84和0.74的Spearman相关共同效率gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S3，而在之间gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba该值从0.76落下，表明CML46潜在的非生物应激特定作用。上调gydF4y2BaCML45gydF4y2Ba(不受ATH1微阵列监控)gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba突变体也令人惊讶，并指出在控制这些假定的CBP60g相互作用体的表达中，反馈回路可能存在复杂的相互作用。gydF4y2Ba

在实验2中，通过放松共表达阈值来缩小核心SID2簇，揭示了更多可能的CBP60g和SARD1调控靶点。该簇中的激酶等信号元件为研究敲除突变体中的病原体易感性提供了关键靶点，因为这些可能位于关键防御反应的上游。群集2已经包含了几个已知的抗感染基因。然而，其中一些(gydF4y2BaPAD4、EDS1 WRKY46gydF4y2Ba）躺在上游gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba因此，虽然他们在此集群中的存在提供了一个有趣的深入了解管理其同事的各种反馈循环，但他们不会解释SID2独立的防御响应。两种基因影响可能在下游的病原体抗性gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba是gydF4y2BaSobir1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaADR1-L1gydF4y2Ba．gydF4y2BaSobir1.gydF4y2Ba是防御反应的消极调节者[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba所以候选人较差但NB-LRR受体gydF4y2BaADR1-L1gydF4y2Ba已牵连是在毒性病原体的PTI，ETI和基底防御中涉及一个积极的监管机构[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在包含gydF4y2BaSID2,gydF4y2Ba实验＃2的群集17包含最大的观察密度gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba相关的基因gydF4y2BaPBS3gydF4y2Ba和gydF4y2BaAIG1gydF4y2Ba，已知自定义数组研究，并且gydF4y2BaFMO1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCML47.gydF4y2Ba经qPCR证实[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaFMO1.gydF4y2Ba管理gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba- 依赖，gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba- 独立的防御信令，抑制的过程gydF4y2BaNUDT7.gydF4y2Ba它的同系物，gydF4y2BaNUDT5gydF4y2Ba，存在于此集群中[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

启动子具有丰富的Gaaatt主题的基因，并且在Gaaatt富集的康宁中的哪个集群可能有四种方式来解释其表达不是的那些gydF4y2BaCBP60g / SARD1gydF4y2Ba依赖。首先，由于Gaaatt在拟南芥基因的启动子内具有相对丰富的序列，并且平均每1500 bp启动子的两个基序接近两个基因的机会发生两个基因，其中包括几个小集群中的几个基因，例如，五个基因将很容易产生假积极的。然而，很难说，由于在实验＃1集群的较高严格性上，我们知道感兴趣的群体的较高严格可能相对较小，因此群体应该是值得调查的。第二种可能性是，对于CBP60G / SARD1功能，与GaAATT基序的结合是必要的，但不能充分并且不需要额外的转录因子及其结合位点进行合作激活。图中的热爱图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba意味着Wrky28对这种激活不是必不可少的。然而gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba群集和其他几个Gaaatt富含群体丰富了WRKY BORTING的共识W-BOX元件。第三，对于一些簇，尽管Gaaatt富集可以准确地意味着CBP60G SARD1结合，但另一个转录因子可能在响应生物攻击时对诱导产生主导控制。因此，当不存在此因素时，只能观察到CBP60G和SARD1的影响。最后，CBP60家族的其他六个成员尚未证明DNA结合潜力，但在某些情况下，响应于生物应力的响应于生物应力而温和的诱导，这可能与一些类似于CBP60G和SARD1定义的那样相互作用。gydF4y2Ba

CBP60g和SARD1在抑制具有多个GAAATT基元的基因表达和与其他GAAATT富集基因共表达的作用令人惊讶，因为我们之前发现在上调基因的启动子中GAAATTT基元的表达显著不足gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba双突变体(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．然而，这种复杂性并非没有优先权。钙调蛋白调控的转录因子gydF4y2BaSR1gydF4y2Ba已被证明积极调节gydF4y2BaCBF2gydF4y2Ba但负面调节gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．Ca的复杂性gydF4y2Ba^2+gydF4y2BaSR1可抑制上游两个重要的正调控因子的表达，这进一步强调了sa介导的防御信号的调控作用gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba，gydF4y2BaEDS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNDR1.gydF4y2Ba，也抑制负调节器gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba表达，ein3 [gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]．有趣的是，许多簇似乎富集了SR1结合位点，一些重叠的GAAATT富集(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S4)。聚类8显示，在CBP60g和SARD1缺失的情况下，多个基因上调，该聚类的多个成员作为防御反应的抑制剂(gydF4y2BaBON1，BAP1，GILP，NUDT7gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．此外，PBP1介导生长素信号，这是sa介导的防御信号的潜在抑制剂[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．该集群的另一个重要防御组件是gydF4y2BaMPK11gydF4y2Ba．而gydF4y2BaMPK11gydF4y2Ba显着下调gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba植物24 HPI与gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326，可能是在生物攻击分钟内激活MPK11和稳态转录水平的MPK11激活，所以接种或基础状态的中等增加更重要的可能是重要的[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．该簇的另一个特征是钙结合蛋白显著过剩，包括BON1、BAP1、PBP1、CML37和At3g10830，以及钙调蛋白依赖的激酶CPK底物CZF [gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．这些特征结合在一起，使这一特定的规则成为一个值得进一步研究的有趣目标。gydF4y2Ba

作为监管机构识别Wrky28所涉及的过程gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba让我们期待gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba会形成一些部分gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba簇。明确的证据gydF4y2BaWRKY28的gydF4y2Ba联系gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba存在作为条件的子集，在其中存在强大和重要的关联gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba暗示WRKY28具有某些特定的作用。然而，在这种情况下并没有明显的趋势gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba与之相关gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba．在这种情况下出现了一种趋势gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba与之相关gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba但不是gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba是实验，其中治疗是SA的外源性或SA的一些类似物，如苯并噻唑（Bth），3,5-二氯蒽酸（DCA）或2,6-二氯硅酸（INA）。例如，在外源SA应用的实验中，NASCARRAYS192和NASCARRAYS365，gydF4y2BaWRKY28：SID2.gydF4y2Ba相关性是-0.17和0.18gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba相关性是0.71和0.68。在BTH应用程序，GSE9955和NASCARRAYS392的实验中，gydF4y2BaWRKY28：SID2.gydF4y2Ba相关评分是-0.48和-0.03gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba评分0.86和0.89。在实验中GSE13833 [gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]，其中应用DCA和INA，得分分别为0.16和0.85。虽然这些实验不足以构建一个稳定的共表达矩阵，他们建议的作用gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba通过一个独立的前馈回路放大现有的sa介导的信号gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

共表达分析促进了在两种不同程度的分辨率下识别SA介导的防御信号调节件。这些基因的启动子富集用于结合CBP60G和SARD1的低聚物的片段，表明这些簇的一些成员可能是CBP60G和SARD1调节的靶标。已经在单独的簇中鉴定了其他推定的靶标，并且已经显示了通过CBP60G和SARD1抑制了GaAATT丰富的启动子下游的有趣的一些基因，表明在防御基因表达反应中的潜在复杂作用。这种共同表达分析也阐明了这种关系gydF4y2BaWRKY28gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba这可能允许监管模式的微调。gydF4y2Ba

植物生长条件和病原体培养物gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba加入Col-0作为野生型对照gydF4y2Bacbp60g-1gydF4y2Ba（Salk_023199）[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaSARD1-2gydF4y2Ba（Salk_052422）[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]作为突变线。在高压灭菌的BM2发芽混合物（BERGER）上生长在生长室中，在22℃下具有12小时光周期，75％湿度。在细菌感染或伴随处理前生长植物4-5周。gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326培养物在含有100 μg ml的King’s B培养基中过夜gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}链霉素在室温下。培养物离心，洗涤，用5 mM MgSO重悬gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba到了od的密度gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.01。FLG22肽购自Ezbiolab并制备至1μm。用不必要的注射器制备伴随的伴随的伴随注射器;模拟处理为5 mm mgsogydF4y2Ba_4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

定量rt - pcr分析gydF4y2Ba

使用Trizol（Invitrogen）纯化RNA，并用DNASEI（NEB）处理。使用光环晶符480实时PCR系统（Roche）进行定量RT-PCR实验。根据制造商的方案，将24 ng总RNA与上标III铂SYBR绿一步数量RT-PCR试剂盒（Invitrogen）用于每种10μl反应。热循环循环速度为50℃，10分钟，95℃10分钟，然后均为40℃，95℃持续15秒，60℃持续1分钟。对于每个反应扩增曲线，使用2计算交叉点（CP）gydF4y2Ba^ndgydF4y2Ba利用Lightcycler软件提供的导数max方法。每个反应都有两个技术重复，并对这些重复的Cp值取平均值。每个基因有4个或5个独立的生物重复gydF4y2BaActin2gydF4y2Ba（gydF4y2BaAt3g18780gydF4y2Ba）被用作内部参考。以下模型适合使用R环境中NLME包中的LME函数的CP值数据：gydF4y2BaCpgydF4y2Ba_{gytrgydF4y2Ba}＝gydF4y2BaGYTgydF4y2Ba_gytgydF4y2Ba+gydF4y2BaRgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba+gydF4y2Baε.gydF4y2Ba_{gytrgydF4y2Ba}， 在哪里gydF4y2BaGYTgydF4y2Ba基因：基因型：治疗相互作用作为固定效果，和gydF4y2BaRgydF4y2Ba（复制）和gydF4y2Baε.gydF4y2Ba(残差)是随机效应。一旦建立模型，将基因:基因型:处理交互作用的平均值作为Cp值和相对对数gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过减去CP值获得的表达值gydF4y2BaActin2gydF4y2Ba基因。双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba-检验时，使用从模型拟合得到的方差和协方差值计算每个比较合适的标准误差。所使用的引物的完整列表可以在附加文件中找到gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S5。gydF4y2Ba

微阵列数据分析gydF4y2Ba

Affymetrix Ath1整个基因组微阵列数据集按照以下数据存储库的形式下载：NASCARRAYS（gydF4y2Bahttp://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/experimentbrowse.pl.gydF4y2Ba）;NCBI基因表达综合(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba）;EBI ArrayExpress (gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/gydF4y2Ba）;Ausubel Lab IMDS（gydF4y2Bahttp://ausubellab.mgh.harvard.edu/imds/gydF4y2Ba）.本研究中包含的实验列表可以在附加文件中找到gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：表S6。使用Affyqcreport包评估各个实验的各个阵列的数据质量，R环境中的Biocondions的一部分程序的一部分进行了评估gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]．那些似乎扭曲了实验正规化的外围阵列被丢弃了。使用gcrma R包的justRMA函数实现的RMA算法对每个实验进行预处理和分位数归一化[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]．对于每个实验，Spearman等级相关系数，并且在代表的探针之间进行该测试的相应P值gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba(262177 _at)和gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba（246821_at）或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba(260046_at, 260068_at)用cor和cor.test R函数确定。由于先前的错误注释gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba，两个概念报告gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba在ATH1芯片上表达，但对所选实验的分析表明，260046_at探针组是两种探针中更可靠和敏感的，如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．相关性使用斯皮尔曼等级相关系数进行评分，假设非参数检验在面对假定的大范围变化的数据结构时更可靠，并且它将提供一种更保守的相关性测量方法，特别是在分析较小的数据集时。实验根据两者的最大显著相关(Spearman相关≥0.7,p-value≤0.05)进行过滤gydF4y2BaCBP60G：SID2.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1：SID2.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Co-expression分析gydF4y2Ba

对于每个所选微阵列实验日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对每个探针集的表达式值进行归一化处理，使中值设置为0。数据集被合并，所有数组的每个探针集被归一化，这样标准偏差被设置为1。在之前描述的定制微阵列实验中，45个基因被鉴定为显著差异表达(GEO: GSE18865 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]） 在gydF4y2Bacbp60ggydF4y2Ba，gydF4y2Basard1gydF4y2Ba或gydF4y2BaCBP60G SARD1gydF4y2Ba植物相对于野生型接种毒性gydF4y2BaPmagydF4y2BaES4326或被解除武装gydF4y2BaPTO.gydF4y2BaDC3000gydF4y2BahrcCgydF4y2Ba^-gydF4y2Ba至少下调2倍，错误发现率小于或等于0.05。根据实验1的Spearman秩相关系数为0.8，实验2的Spearman秩相关系数为0.7，筛选出与这45个种子共同表达的基因。相关矩阵计算的实验和基因之间的连接设置在0.8和0.7阈值分别。采用DPClus对两个实验进行聚类，聚类参数如下:最小聚类密度为0.75;CP阈值为0.75;实验1的最小簇大小为3，实验2的最小簇大小为5;允许形成重叠的簇[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．使用CYTOSCAPE可视化集群[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

对于为其他文件构建的非生物应力共表达网络gydF4y2Ba7gydF4y2Ba图S3，选取27个实验，共501个阵列gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba响应非生物应激而没有强烈相关的gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba(≤0.5)(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S6)。基因与其中任何一个共同表达gydF4y2BaCBP60G.gydF4y2Ba或gydF4y2BaSARD1.gydF4y2Ba在网络中包括超过这些实验的0.7的阈值。gydF4y2Ba

对于阵列实验相关系数的分层聚类，群集程序用于将实验组织到自组织地图中，随后应用了使用未受监测相关度量的完整链接分层群集。使用TreeView可视化群集[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

启动子分析gydF4y2Ba

启动子序列从RSAT数据库(gydF4y2Bahttp://rsat.ulb.ac.be/gydF4y2Ba）除附加文件之外的所有分析中使用的转录开始网站上游的固定1500bp序列gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1 [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．选择1500 bp促进剂，尽管Gaatt主题在1000 bp启动子中更加明显，但为了包括原始的gydF4y2BaSID2gydF4y2Ba张鉴定的网站gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．在RSAT服务器上不可用五个基因启动子序列，因为它们被认为是伪原（gydF4y2BaAt4g13900, At1g21525, At4g14610, At3g48650, At2g24160gydF4y2Ba）.然而，包括这些基因，从TAIR数据库中检索的启动子序列（gydF4y2Bahttp://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．使用POBO应用程序评估已知启动子顺式元件和基序的过度代表性(gydF4y2Bahttp://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/poxo/pobo/pobogydF4y2Ba)[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．对于每一组启动子，1000个与所述集群大小相等的伪集群从所述基因内部和拟南芥基因组背景(干净)中生成。使用链接的Graphpad应用程序计算POBO生成的t值的统计显著性，进行双尾比较。对于选定的聚类，利用模因和RSAT工具套件使用motif寻找算法来发现额外的潜在顺式元素[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

BTH：gydF4y2Ba

苯并噻唑.gydF4y2Ba

CAM：gydF4y2Ba

钙调蛋白gydF4y2Ba

CP：gydF4y2Ba

交叉点gydF4y2Ba

DCA：gydF4y2Ba

3, 5-dichloroanthranilic酸gydF4y2Ba

eti：gydF4y2Ba

效应触发免疫力gydF4y2Ba

EMSA:gydF4y2Ba

电泳迁移率变速测定gydF4y2Ba

现病史:gydF4y2Ba

小时后接种gydF4y2Ba

在一个：gydF4y2Ba

2,6-二氯硅酸酸gydF4y2Ba

MAMP：gydF4y2Ba

微生物相关分子图案gydF4y2Ba

og：gydF4y2Ba

oligogalacturonide.gydF4y2Ba

PmagydF4y2Ba假单胞菌含油gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

光伏gydF4y2BamaculicolagydF4y2Ba

PTI：gydF4y2Ba

模式触发免疫力gydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

SAR：gydF4y2Ba

系统获得抗病性。gydF4y2Ba

这项工作由Grant iOS-0925375从美国国家科学基金会到JG资助。感谢Kenichi Tsuda为QPCR数据的统计分析和启动子分析提供统计分析。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 植物生物，Microbial和Plant Genomics Institute，Minnesota大学，1500 Gortner Avenue，Saint Paul，Mn，55108，USAgydF4y2Ba

   威廉·杜鲁门和简·格莱兹布鲁克gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba威廉·杜鲁门gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

WT进行了所有的分析并撰写了论文。JG提供了有益的建议并对手稿进行了编辑。两位作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

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重印和权限gydF4y2Ba