应激诱导蛋白酶抑制剂的多样性甜椒

背景

伤口诱导的PIN-II蛋白酶抑制剂（PIS）是重要的植物丝氨酸PI之一，其已经广泛研究了它们的结构和功能多样性和植物防御害虫的相关性。探索数组的功能专业化甜椒蛋白酶抑制剂(L.)Canpis.)基因的表达、加工及在稳态和诱导条件下的组织特异性分布。诱导是通过受试者进行的c .建立叶片经不同处理，即蚜虫侵染或机械伤害后，再经口腔分泌物处理(OS)Helicoverpa armigera或水。

结果

诱导处理调节了积累Canpis.对应于4-，3-和2抑制重复域（IRD）。四十七不同canpi.共鉴定出28个独一无二的ird基因，与之前报道的ird基因一致。的canpi.3-IRD PIs和胰蛋白酶抑制结构域是3-IRD PIs和胰蛋白酶抑制结构域的主要组成部分。也是4-IRD的主要贡献canpi.具有胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂结构域的基因在OS处理的伤叶中有特异性表达。伤人次数最多Canpis.而OS处理导致特异性的高积累CanPI-4那－7和−10.．通过二维凝胶电泳对PI蛋白活性的表征揭示了组织和诱导的特异性模式。与转录丰度、伤口加OS或水处理一致c .建立叶片显着提高了较高的PI活性和异构型多样性，由3-和4 IRD贡献Canpis.．canpi.通过蚜虫侵染累积和活性累积且导致表达更高的表达canpi.-26年,-41和−43.．

结论

植物可以通过激活植物防御机制(包括在转录和翻译后水平上调控pi)来感知不同种类的昆虫攻击并作出适当的反应。基于差异引出canpi.累积模式，引导推测以多IRD PI的形式推测产生序列多样性是精心植物防御策略的一部分，以获得各种功能单位，以限制昆虫攻击。

为了应对食草动物的挑战，植物进化出了由结构反应和诱导反应组成的复杂防御策略。诱导防御只有在植物感知到来自草食动物的信号时才开始。大量的研究报告了植物对食草动物和其他生物胁迫的直接和间接防御的诱导[1-4.]．昆虫损伤、机械损伤和/或在昆虫口腔分泌物(OS)中的激发子，如脂肪酸氨基酸缀合物、volicitin、启始素、caeliferins和葡萄糖氧化酶，刺激系统素和/或茉莉酸等信号中间体的局部和全身释放;然后放大整个植物的防御级联[5.-7.]．虽然草食病的主要结果是受伤，但由于昆虫OS中存在的elictors，植物对昆虫喂养的反应更复杂[8.]．防御反应包括植物防御基因的调控激活和生长相关基因的抑制[8.那9.]．因此，防御代谢物和/或蛋白质不仅在植物被食草动物破坏的局部组织中积累，而且在未被破坏的组织中积累。

在番茄和马铃薯植物的整个空中组织中，胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶抑制剂（PIS）的积累被证明是昆虫介导的损伤或机械伤害的直接后果[10.]．因此，丝氨酸pi是茄科植物局部和系统诱导反应的最好例子之一[11.-16.]．在植物的贮藏器官和生殖组织中均有PIs的组成性表达，它具有抗杀虫等内源功能在Planta.[4.那13.那16.-18.]．

大多数茄科成员含有编码Pin-II型pi的多基因家族[4.那16.那19.]，由于串联序列重复、域重复和环状排列域组织的变化，具有相当大的序列多样性[20.]．这些pi的一个显著特征是一个被称为抑制重复域(IRD)的50个氨基酸多肽的串联重复，它可以从1到8个相互连接的连接肽。每个IRD包含8个保守半胱氨酸(Cys)以及一个针对丝氨酸蛋白酶的活性位点。基因复制事件导致多域Pin-II家族pi的进化，具有结构和功能上的分歧[21.]．Horn等人[22.]隔离由连接肽的差分蛋白水解产生的一组IRD，将7结构域前体的亚基从甲基 - 己酸酯引发中分离出来n attenuata则叶子。Pin-II PI蛋白多基因家族的序列变异性，它们的调控表达和翻译后处理共同负责产生有效防御和/或内源性功能的PI鸡尾酒[4.那16.那23.]．

一些不同的PI蛋白和基因与1-到4- ird已被鉴定和特征c .建立(CanPIs)组织16.那24.-29.]．在诱导表达中有很大的差异Canpis.受蚜虫侵害、病毒感染、昆虫咬伤及机械伤害。转录本的丰富并不总是导致更高的CanPI蛋白，尽管它们在鳞翅虫寄生中有很好的相关性c .建立叶子。此外，这些研究表明，许多Canpis.同时表达，但这种PI表达式的重要性c .建立仍不清楚。

为了研究CanPI的各种亚型的潜在功能特异性c .建立，我们解决了以下问题:(i)诱导是否增加了PI亚型的多样性?(ii)对特定治疗的诱导反应有多专门化?根据实验归纳c .建立我们研究了CanPI转录本和蛋白谱的多样性。测序发现24种新型canpi.转录物，增加了47的总证明。使用1D和2D电泳的蛋白质粒中PI活性选择性分析，然后质谱显示PI活性的局部和全身反应。

微分调节Canpis.归纳时

未诱导叶和诱导叶的cDNA扩增canpi.基因特异性寡核苷酸的转录产物分别为789、614、445和267 bp，分别代表4-、3-、2-和1-IRDCanpis，分别。半定量分析显示差异canpi.在未诱导和诱导叶片中的表达(图1A) In comparison to与…相比Canpis.2-IRDs, 4- irds和3-IRDs在水或OS处理的伤叶中含量更高(图)1A).在蚜虫寄生的叶片中，而整体表达Canpis.低，3-IRD转录明显。克隆扩增的转录本，并对每个处理的60个代表性克隆(未诱导的25个)进行测序，以确定其身份canpis。该分析根据氨基酸组合物的变化检测了新型的4-，3-和2-IRD亚型。根据这种分析，除了23Canpis.之前报道(16.那26.那27.), 24小说Canpis.被确定在内，包括七个2-IRD，14个3-IRD和三个IRDCanpis.(表1）.1-IRDCanpis.在任何诱导处理下未检测到未在未造成的叶片中鉴定。关于特定于治疗的细节Canpis.他们的IRD组合物总结在表格中1．个体的发生频率Canpis.对每个处理的60个无性系进行分析，并表示在特定处理下叶片的丰度(见表)1）.

丰富的变化Canpis.很明显(图13-IRD B)Canpis.在未诱导或诱导的叶片中最高的(从40%到60%)。丰富的4-IRDCanpis.与被蚜虫侵染(12%)或被水侵染(17%)相比，被OS侵染(38%)的叶片中抗蚜能力增加。2-IRD的比例Canpis.经OS处理的伤叶中，蚜虫侵染率最低(10%)，而水处理的伤叶中，蚜虫侵染率最高(20%)。不同亚型的差异表达Canpis.（关于他们的IRD组成;见表1)导致了一个特定于归纳的结果canpi.概要文件。CANPI-4，-7，-10，-24，-41和−43.在所有诱导处理中，叶片表现出最高的代表性1）.在用OS治疗的受伤叶子中，CanPI-4和−7显示出最高的频率，然而CanPI-41和−43在蚜虫寄生的叶片中表现最为明显。水处理的伤叶表达量最高Canpis.（25）以及几个独特的广泛代表Canpis.(10人)在低频(表1,图1C）。对OS伤害的反应看起来更专业化，如高频率中少数CANPIS（16）的表达（表1,图1C).两种治疗方法分享更多Canpis.(3- ird和4-IRD类型)可能是由于这两种治疗之间的伤害数量的标准化。蚜虫寄生的叶片也积累了7个独特的转录本Canpis.代表不同的PIS阵列。只有成绩单特定于CanPI-3那－５那－7那8和−10.可以从这些组织分析。CanPI-7(4-IRD)在未诱导和诱导的叶片中均有结构性表达CanPI-3和−5.(3-IRD pi)在OS处理后的伤叶中积累水平较低(图3-IRD pi)1d）。CanPI-8和−10.(4-IRD pi)在被水或OS处理的损伤叶片中有差异表达，而在被蚜虫侵染的叶片组织中完全不表达(图)1d）。

Protein Prowler预测器[30.揭示了所有内质网信号肽Canpis.．25 aa的ER信号肽(SP)序列在n端Canpis，其中显示了10个变体，被命名为SP-1到SP-10(附加文件2：图S1）。

调查内部的相互关系和分组Canpis.并对外群进行系统发育分析。Canpis.从全长PIN-II PI（4-IRD）形成一个不同的集群烟草benthamiana用作外群体。树状图揭示了基于相同组件IRDs的聚类Canpis.（数字2）.明显的4-和3-IRD pi簇，如CanPI-31， -33， -1和−4。Canpis.例如CanPI-8， -10和−11,CanPI-37， -40和−41,CanPI-13， -16和−34。

推导的氨基酸序列Canpis.(总共47个)由28个独立的IRDs组成;其中7个有胰凝乳蛋白酶抑制(CI)活性位点，21个有胰蛋白酶抑制(TI)活性位点。IRDs的多序列比对显示，变异主要发生在活性位点环内或c端(附加文件)3.:图S2)。5个TI IRDs具有Lys位点，16个IRDs在P1位点具有Arg位点。IRD在P1的评分为Leu，而IRD在22的评分为Pro。IRD 48 (TI)的活性位点发生变化，‘Asn’被‘Asp’取代(图3.一种）。另一个至关重要的差异是每次IRD的半胱氨酸残基的数量和定位的变化。四种这样的半胱氨酸变体，即IRD 9,11和24是TIS，IRD 33是CI（图3.一种）。

分析了由不同类型的诱因导致的IRDs的相对丰度(图)3.B). IRDs 1、4、5、10、12、14、17、18、25和37在诱导组织中表现较高，并表现出治疗特异性。IRDs 1和17在所有处理下都有较高的代表性，而IRDs 12、18和37 (TIs)在水处理的蚜虫寄生叶片和受伤叶片中出现频率较高(图)3.B).在OS处理的伤叶中，IRDs 4和5 (CIs)和IRDs 10、14和25 (TIs)的丰度明显不同(图2)3.B).大多数剩余的IRDs的多样性是由水或OS处理的受伤叶片贡献的(图3.C）。

伤害和昆虫损伤导致CanPI蛋白的数量和质量的变化

c .建立发现叶片在诱导时增加了PI活性（图4.一种）。在用水诱导治疗的伤口和患者诱导的损伤治疗的系统叶中明显较高，与OS诱导的局部和系统叶片相比，与来自无缝的对照植物的类似叶片（图4.一种）。蚜虫侵染叶中的PI活性高于未经判断的叶子;然而，它分别比用水或与OS处理的受伤叶片小于1.5-和3.5倍。诱导的PI活性水平范围从叶片的2倍的叶片损伤并用水处理到4倍的叶片伤害并用OS处理。

观察到PI同种型感应的差异模式c .建立叶片对各种处理的响应(图4.B).在被OS或水伤害的叶片中检测到3个显著的CanPI活性谱带，而在被蚜虫侵染和未诱导的叶片中仅检测到2个PI亚型。这一差异表明这两种处理导致的canpi的质量差异。水或硫酸处理伤叶提取物早期达到饱和h .来肠道蛋白酶(HGP)抑制率(70%)，与蚜虫寄生和未诱导的组织不同，与pi活性的数量差异一致(图)4.四龄幼虫的HGP显示出至少7种蛋白酶亚型(HGP-1到−7)，其中只有HGP-6和−7能够在来自非诱导或诱导组织的canpi存在的情况下保持边缘活性(图)4.d）。

诱导叶样品的2-D活性分布显示在4至7的等电点（PI）范围内诱导几种新型PI同种型，并在少数同种型的PI和/或分子量中移位（图5.）.在未诱导的叶片中鉴定出5个主要的TI亚型(TI-1到TI-5)，分别对应于1-、2-、3-和4-IRD (pI范围为5到7)5.）.与TI-1相比，TI-6 (1-IRD)亚型在pI中有主要的基本位移，在所有三种诱导组织中都存在。TI-3、-4和- 5在被蚜虫侵染的叶片中均能检测到，而在被水或OS处理的受损叶片中则检测不到。TI-8 ~−13仅在水处理的伤叶中存在，而TI-14、-15和−16 (4-IRD canpi)仅在OS处理的伤叶中存在。水处理损伤叶片中诱导的PI活性表现为几种TI亚型的低强度分布，而OS处理损伤叶片中只有少数TI亚型的表达明显上调。TI-2在所有的诱导组织中都不存在，这与未诱导叶片中某些PI亚型的特异性一致。在1-、2-、3-或4-IRD canpi对应的TI亚型中，3-和4-IRD canpi的变异更多。

部分纯化的PIS含有约5.5至6.3kDa的小肽，其等于单一的IRD，如在Maldi-Tof-MS上分析（图6.）.高分子质量的蛋白质在质谱中表现出非常低的强度，可能是由于离子的抑制作用，因此没有被考虑。未诱导叶提取物的主峰为5583 Da，而蚜虫侵染叶的主峰为5583 Da和5616 Da，低强度峰较少。水处理伤叶最大峰为5583达，强度较高的有5616、5760和5832达。OS伤叶提取物的主峰为6138和5961 Da，弱峰为5616、5832、6036和6301 Da, 5583 Da缺失。多肽分子质量的这种变化可能是前体PI蛋白的蛋白水解过程产生多种功能PI物种的结果(相当于多IRD canpi中的单个IRD) [22.那31.那32.]．

来自未诱导和诱导的叶片的部分纯化的PI蛋白，在MALDI-TOF-MS上显示不同的质谱分布，在三晶凝胶上分离，并且单独切除蛋白质并加工用于凝胶消化，然后通过MALDI鉴定肽-tof-ms / ms（附加文件1：表S2）。所有提取物中的6kDA蛋白显示出与PIN-II蛋白酶抑制剂的匹配c .建立．但是，由于IRD序列中的高同源性，数据库生成了识别到几个CANPI / IRDS（附加文件1：表S2）。

PI积累的组织特异性

与叶片、根和果实不同发育阶段的组织相比，花、茎和早期果实的PI活性显著升高4.:图S3)。花组织的PI活性最高，而转果组织的PI活性最低，差异为7倍。2-DE分辨率不同的PI在凝胶内显示c .建立植物部分显示了这些组织中PI活性的质的变化(图)7.）.与1-、2-、3-和4-IRD canpi对应的簇在茎、早果和花中表现突出。由于根中TIUs很低，我们只能检测到一种对应于2-IRD CanPI的TI亚型。1-IRD簇包含几个合并的TI亚型，表明由于氨基酸序列差异而产生的多个电荷变异。特别是茎组织在3-IRD簇中表现出较少的多样性，而在1-IRD簇中表现出最多的电荷变异。在茎、果早期和花组织中发现pi的高分子质量亚型(图)7.比4-IRD canpi更大。

c .建立在诱导条件下产生表现出调节表达的PI基因阵列。由于与蚜虫侵扰相比，由于高细胞损伤和植物特异性诱变者而受到伤害和鳞翅目昆虫攻击，难以受到胰岛素抗癌的强烈引起的。基于观察到的canpi.有趣的是，推测以多ird pi形式产生序列多样性是植物防御策略的一部分，以获得不同功能单位池，以限制昆虫的攻击。

在茄科植物中，不同的种烟草显示含有2和4至8个IRDs的PI基因[19.]．此外，2-IRD pi来自番茄(Solanum lycopersicum）和美国初步已被很好地描述[4.那33.]．报告了具有不同IRD组合物的同时表达PISN. alata.柱头(4-和6-IRDs;[34.]）， 在N. glutinosa.感染TMV（6-和8税; [35.),在n attenuata则回应草食病（7-IRD; [22.]）。除了先前报告的23个PI基因c .建立果皮，发展水果和茎[16.那26.那27.]，24个新Canpis.被分离并用本研究中的诱导叶子表征。其中47canpi.基因，9含有4次IRD，其中20个含有3次IRD，其中15个含有2-IRD，3含有单一IRD，从而有助于多样性。与以前的研究一致，3次IRD PIS在高度丰富c .建立叶子（表1,图2）.我们观察了3-和4税的强大上调canpi.与未出现的叶子相比，诱导叶片的转录物（图1一、表1）.在PI活性水平获得的往复模式证实了CanPis的诱导特异性调节。其他报告c .建立也显示了canpi.在蚜虫，病毒，昆虫喂养和机械伤害中引发局部和全身叶组织的表达[16.那25.那26.]．在同样的处理下，远端叶片的PI活性比本地叶片更强，这表明远端信号传导较强。

尽管在本研究中进行的其他治疗方法直接比较了蚜虫侵扰治疗，但累积的有趣模式Canpis.在转录物和PI活动水平中是明显的。canpi.蚜虫侵染叶中的转录物丰度远低于用水或OS处理的受伤叶中观察到的叶片（图1A).蚜虫已经被发现会引起包括pi在内的防御相关基因，但与咀嚼昆虫攻击引起的反应相比，这种反应是低的[36.那37.]．然而，研究也发现蚜虫诱导水杨酸信号的转录标记，而PI转录本没有增加[38.]．在本研究中，转录物CANPI-41.和−43.在蚜虫侵扰下高度积累CanPI-8和−11.留下蚜虫损伤仍然引起或抑制;后者通过伤害或W + OS治疗来上调。抑制所选择的伤口诱导的反应，而不是缺乏细胞损伤，也可能对蚜虫攻击的低响应负责[36.]．蚜虫侵扰诱导CANPI活动，但与用水或OS处理的受伤叶子相比较少（图4.A).一个独特的蚜虫诱导的CanPI信号在二维活性谱中很明显(图)5.）.

特别是，在OS处理的损伤叶片中，4-IRD pi被强烈诱导(图)1b）突出昆虫elictors对CANPI监管的强大和具体影响。众所周知，植物对伤害/昆虫饲养的反应是由植物对食草食草特异性elictors的看法进行明确改变[8.那39.-42.]．据报道，与仅机械损伤相比，昆虫损伤或昆虫OS反应中含有大量茉莉酸和快速积累的伤诱导转录本[5.那40那43.]．水处理的伤叶表达量最高(10)Canpis.（数字1c）虽然较低的频率较低，但与少量溃疡（4,5,10,14,25）相比，用OS处理的受伤叶片的较高频率。特别高的代表Canpis.与多个ird定向富集PI混合与CI和TI活性似乎是一种植物适应鳞翅目昆虫攻击的方法，有助于解决广泛的昆虫蛋白酶[31.]．显着高pi活动（图4.a）与有未经胁迫和蚜虫侵染叶片的两种活性带相比，用水或OS处理的受伤叶片中的三种PI活性带的检测（图4.B)表明累积的PI活性在数量和质量上的变化。通过2D电泳进一步表征，发现水处理损伤叶片中存在多种电荷和/或分子质量变异(图)5.；Ti-7至-13）和OS（图5.；TI-14到TI-16)，表明诱导的亚型多样性。检测到的差异亚型主要对应于3-和4-IRD pi，因此与高相关canpi.这两种处理下的转录产物积累。与单独伤害相比，OS处理的叶片中缺乏某些TI亚型，表明抑制了一些诱导反应，导致了处理的特定模式。在HGP抑制电位方面，所有叶片组织的PI活性均达到了70%的HGP抑制(图)4.c）并且可以抑制几乎所有HGP同种型（图4.d）。然而，与未经抑制的叶片相比，通过伤害和/或用OS诱导的叶片诱导的叶片的HGP抑制的早期饱和度是暗示在这种叶片组织中PI单元的高定量积累以及对昆虫肠蛋白酶的更高的特异性活性．已知多个IRDS从前体生成N. alata.在ME-JA引发的叶子中PI蛋白[22.那44.]通过在接头区域的内源蛋白酶的作用来从Canpi前体蛋白[16.]．在水和OS蛋白组分伤害中，不同质量峰的数量和强度的增加相当于单个IRDs(图)6.)，提示上调CanPI前体蛋白的蛋白水解过程增强[22.那31.那32.]．同种型Ti-6的具体存在，没有Ti-1（图5.)在所有诱导下也表明，CanPI前体加工产生的差异1-IRD亚型的积累。因此，我们的结果证实了假设[22.的诱导导致CanPI前体的过度生产，并增强了前体与蛋白酶对ird的差异加工，从而产生结构和功能上不同的加工产物。人们还注意到，即使在前体蛋白被加工的水平上，诱导处理的特异性也得到了维持。在5.9 ~ 6.3 kDa的峰值范围内，OS处理的伤害强度较高，而在未诱导和其他处理、蚜虫寄生和水处理中，5.5 ~ 5.8 kDa的峰值显著。这些结果证实了植物能够在转录和翻译后水平上对不同的生物胁迫有不同的感知，并通过pi的调控做出适当的反应。

序列分析显示高度同源Canpis.平均方差为4％。清除不存在部分N-和C末端的重复canpi.前体将它们区分开来n benthamianaPin-IIπ(图2）.的显式聚类c .建立来自所有其他茄科Pin-II pi的pi表明了最近的进化起源[21.]．CanPI中的多样性可归因于单独的IRD，其显示在反应位点环和C末端区域附近的2至20％范围内的序列变化。二十八个独特的IRDS，构成7个CIS和21 TIS，遵循H-L型拓扑，其中序列重复与结构重复相同[21.]．诱导特异性IRD分布主要偏向TIs而不是CIs。我们知道，在鳞翅目昆虫中，胰蛋白酶样蛋白酶占主导地位，这可能与植物中相对丰富的胰蛋白酶特异性pi有关。

28个ird中均存在TIs ' CPRNC '、' CPKNC '、' CPRYC '和' CPRDC '活性位点变异，以及CTLNC '和' CTPNC '两种类型的CI位点。有趣的是，在本研究中发现了四种半胱氨酸变体，包括缺失一个或多个保守的半胱氨酸残基、半胱氨酸位置改变或有额外的半胱氨酸(图)3.A).最近，在马铃薯中发现了6种具有半胱氨酸残基选择性损失的IRD天然变异[45.]．半胱氨酸残基的丢失通常与功能分化有关，提示积极的进化基因选择。然而，突变的性质和导致选择性半胱氨酸损失的相关因素仍不清楚。对这些突变影响蛋白酶结合亲和力和ird结构稳定性/完整性的重要性的研究，引发了一场关于Pin-II家族二硫键进化的积极辩论([45.那46.]，即我们未发表的研究结果)。特别是在c .建立研究表明，植物通过表达修饰过的ird来提高其对靶蛋白酶的整体活性，从而形成精细的防御机制。在各种组织中c .建立，鲜花揭示了PI活动的最高积累（附加文件4.：图S3），符合在保护植物的生殖部位的作用，以番茄中报道的害虫[15.那44.]．

本研究表明，CanPI序列多样性、组织特异性和对不同诱导的显性反应是有效的植物防御系统的组成部分。特别观察到的pi的巨大复杂性的意义c .建立需要被理解。最近关于PI的内源性和/或防御作用来自各种溶于溶于溶于溶于溶于多种Canpis.构成突出了它们在许多工厂的复杂过程中的潜在参与[16.那19.那23.那47.-49.]．而且，监管上了，但又专业化了canpi.在伤害和虫害发生时的表达为基于PI的植物防御机制的进化提供了深刻的见解，并对其调控产生了许多未解之谜。从本质上说，需要对具体的进行更多的功能研究canpi.基因，以确定它们在特定处理下的作用，以及这种变异如何解释植物在特定生物胁迫条件下的适应性效益。

植物材料和诱导处理

c .建立种子（CV phulejyoti）（二倍体）在含有土渣（园艺级膨胀的珍珠岩混合物，爱尔兰泥炭苔和exfolated蛭石的盆中成长为平等的比例; Naik Krushi，Pune，Ms，印度）并用Hoagland解决方案补充。将30天龄幼苗转移到单个盆中，并在23℃（±2℃）的生长室中生长，用14小时光照周周期。叶，茎，果实的各个阶段（早期，中，转弯和晚期），根部和从成熟植物（3个月）的鲜花被收获，用于筛选组织特异性的Canpis。

所有诱导试验均在3月龄植株上进行，每个生物重复每个处理3株。沿着叶片的长度滚动织物图案轮(根据叶片的大小，可滚动4至6卷)，机械地损伤叶片，随后立即用水或OS处理穿孔伤口。这些被认为是局部组织，而未受伤的叶子在上面或下面一个淋巴结被采集来测量全身反应。治疗30 h后收集局部和全身组织。所使用的OS从h .来用MQ水稀释1:50 (v/v)倍。植物被保存在开放的花园里，以防止被动的蚜虫侵害。自然感染Myzus persicae被观察到c .建立在一周内离开。蚜虫的密度高于叶片朝向叶柄。作为局部组织收集每叶片生长至少20个叶片的叶子，而非侵染叶被收获作为全身组织。由于植物在开放条件下通过蚜虫自然感染，因此以高度特异和受控的方式进行这种处理的可能比较和另外两个是有限的。从未诱导的植物收获来自不引人注目的对照植物的未引发控制植物。所有组织收集在同一时间内完成，并在液氮中闪蒸，并在-80℃下储存直至进一步使用。两项生物重复用于整个研究。

Pin-II基因的表达分析、克隆及序列分析

总RNA从c .建立使用TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)分离叶片组织(未诱导和所有三种诱导)，然后在37°C下进行DNAse处理。用分光光度法对纯化的RNA进行定量，用逆转录酶试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)合成第一链cDNA 1.5 μg。利用校对的Accuprime Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)，在独立PCR反应中从单个处理和未诱导的叶片系统组织中扩增cdnacanpi.基因特异性引物对(CanPin-1F和CanPin-1R;额外的文件1表S1A)。扩增子克隆到pgem -easy载体(Promega)中。用标准T7正向引物和SP6反向引物对每个处理的60个克隆片段进行测序。使用BioEdit、Clustal-X和Lasergene软件进行序列编辑和分析。进行半定量分析Canpis.在组织内，通过减少循环（25），促进PFX DNA聚合酶和canpi.基因特异性引物对。针对个体设计了特异性引物对canpi.以检查基因表达的特异性canpis。然而，由于内部高度的相似性/同源性c .建立π，可以设计专用基因的底漆对CanPI-3,5.那－7那8和−10.只要。用于个体内部分化的特定寡核苷酸对Canpis.在附加文件中说明1：表S1A和B.所有PCR均在技术复制品中进行。

蛋白质提取和蛋白酶抑制剂活性测定

从1g从未诱导和诱导的1g新鲜叶组织中提取总可溶性蛋白（局部和全身治疗）c .建立，使用水和5％聚乙烯醇吡咯烷酮的混合物（Sigma，St.Louis，Mo，USA）．使用Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，Hercules，Ca，USA），胰蛋白酶抑制活性和蛋白质估算h .来利用合成底物苯甲酰- dl -精基-测定了叶提取物中肠蛋白酶(HGP)的抑制活性P.-Nitroanilide（Sigma，St.Louis，Mo，USA）如前所述[28.]．蛋白酶抑制剂活性表示为每毫克组织（TiUS / Mg）的胰蛋白酶抑制单位。滴定各种量的叶片蛋白质提取物针对HGP滴定以确定最大抑制活性。所有测定均以技术三份含量进行，具有2个生物重复，并使用单因素Anova进行数据进行统计分析，然后进行Tukey的Hoc分析。

蛋白酶抑制活性的凝胶鉴定的1D和2D电泳

等量的叶蛋白提取物在12%的天然page上溶解，并进一步处理，以使用前面描述的凝胶x射线胶片接触打印(GXCT)方法可视化胰蛋白酶抑制剂亚型[50.]．为了可视化蛋白酶活性，将与HGP孵育的蛋白质提取物在8％天然 - 页凝胶上解析并由GXCT加工[51.]．在2D电泳中，丙酮沉淀蛋白在复水化缓冲液中重新悬浮，使用11厘米IPG条(pH 3-10 NL;Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)，根据制造商的协议。使用Hoefer电泳装置(GE Healthcare Bio-sciences AB, Buckinghamshire, UK)在12% SDS-PAGE凝胶上进行二维分离，保持在24°C和200 V。胰蛋白酶抑制剂活性通过修饰的GXCT显示[52.]．电泳实验均为技术3个重复，生物2个重复。

叶片蛋白质提取物的部分纯化和蛋白质组学分析

鉴定蛋白酶抑制剂c .建立首先以下列方式部分纯化叶组织，蛋白质提取物。将硫酸铵沉淀的蛋白质（90％饱和）从叶子提取物中重悬于50mM Tris缓冲液（pH8.0）中，然后在使用Pd Spintrap脱盐之前在65℃下处理10分钟^TM值G-25列(GE医疗保健)。然后在50 mM Tris缓冲液(pH 8.0)平衡的DEAE-Sephacel (GE Healthcare)上分离蛋白，并从结合蛋白中分别收集流动蛋白，结合蛋白在50 mM Tris缓冲液(pH 8.0)中用0.25 M到0.4 M的NaCl梯度洗脱。用PD Spintrap柱浓缩和脱盐胰蛋白酶抑制剂活性组分。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和Voyager-De-STR (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)对部分纯化的蛋白质组分进行聚合和定性分析。质谱采集是通过前面描述的标准仪器协议进行的[31.]．简而言之，将2μg蛋白质样品与20μl新鲜制备的锡丁酸（Sigma-Aldrich）（在30％乙腈[ACN]中，0.1％三氟乙酸[TFA]），并在不锈钢马尔达板上发现，在1至25kDa的范围内获得光谱分布。使用Data Explorer™分析光谱，以获得感兴趣的区域，并处理高级基线校正和噪声拆除。

为了获得蛋白质序列数据，将部分纯化的蛋白质分离在16％三曲线SDS-PAGE凝胶上[53.，然后用MALDI-Q-TOF- MS (SYNAPT High Definition mass spectrometer, Waters Corporation, Milford, MA, USA)对蛋白谱带进行酶切分析。质谱采集采用MALDI测量法。使用Protein Lynx Global server 2.4版软件(Waters)进行数据处理和数据库查询。利用20 ppm的肽耐受性、0.05D的片段耐受性、一次缺失的裂解、半胱氨酸氨基甲基化和蛋氨酸可能的氧化作用对分别构建的Pin-II蛋白数据库进行MS/MS数据检索。

Aa:

氨基酸

置信区间:

胰凝乳蛋白酶抑制

HGPI：

h .来肠蛋白酶抑制

MALDI-TOF-MS:

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

ird:

抑制重复域

os：

口腔分泌物

PI:

蛋白酶抑制剂

TI：

胰蛋白酶抑制。

印度政府新德里的科学和工业研究理事会(CSIR)在浦那国家化学实验室(NWP0003)的网络项目赠款下支持了这个项目。MM, NSM和VAT感谢CSIR的研究资助。作者感谢浦那NCL的S. S. Deo在质谱分析方面的帮助，Dr. Klaus Gase, MPI-CE, Jena;n.y. Kadoo博士和Rasika Bhagwat博士，NCL，浦那大学DNA测序。Dhanasekaran Shanmugam博士对手稿的评论非常有帮助，我们感谢Emily Wheeler的编辑协助。作者声明没有利益冲突。

作者指出

1. Vaijayanti一Tamhane

   您的地址：浦那，浦那大学，浦那大学生物信息学与生物技术研究所，浦那，411 007，印度

从属关系

1. 植物分子生物学单位，生物化学科学分工，CSIR-National Chemical实验室，Homi Bhabha Road博士，浦那，MS，411 008，印度

   Manasi Mishra, Neha Mahajan, Vaijayanti A Tamhane, Mahesh J Kulkarni, Vidya S Gupta和Ashok P Giri

2. Max Planck化学生态研究所分子生态学系，Jena，07745，德国

   伊恩·T鲍德温

相应的作者

对应到Ashok P Giri．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

MM进行诱导实验，序列分析，表征PI蛋白活性并起草稿件。NSM参与蛋白质提取和2D凝胶电泳。增值税参加了研究的设计，测序数据分析并帮助起草了手稿。MJK有助于进行MALDI-TOF-MS分析和蛋白质标识。ITB和VSG有助于解释结果并起草稿件的最终版本。APG构思了这项研究，并帮助起草了稿件。所有作者均在撰写阶段的阶段和所有作者均批准最终手稿。

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