直链淀粉缺乏如何影响碳分配的分子洞察-碳水化合物和油的分析和水稻蜡状突变体种子的基因表达谱

背景

了解谷物种子中的碳分配对于开发提高粮食安全淀粉产量的谷物作物，以及生产高直链淀粉、β-葡聚糖或果聚糖的特定终端产品，如用于生物燃料的功能性食品或食用油，具有至关重要的意义。谷物的蜡质突变体支链淀粉含量高，已被很好地鉴定。然而，在蜡质突变体中，碳向其他组分(如β-葡聚糖和油脂)的分配，以及碳向支链淀粉分配的改变的调控，目前尚不清楚。在这项研究中，我们使用了一种水稻突变体，GM077，具有低含量的直链淀粉，以获得分子洞察含淀粉的缺乏对其他最终产品和支链蛋白酶的碳分配。我们使用碳水化合物分析，减去CDNA文库和QPCR来识别潜在负责碳分配变化的候选基因GM077种子。

结果

碳水化合物分析表明，直链淀粉的含量GM077与野生型BP034相比，支链淀粉含量显著增加，籽粒含量显著减少。与野生型相比，突变体对葡萄糖、蔗糖、总淀粉、细胞壁多糖和油脂含量的影响较小。抑制消减杂交(Suppression subtractrachybridization, SSH)实验在野生型背景的突变体中产生了116个ungenes。在116个unigenes中，有3个，AGP，ISA1和苏比亚2 -被发现直接参与支链淀粉的合成，表明它们可能在将碳通量从直链淀粉转移到支链淀粉的过程中发挥作用。对上调基因启动子区域推定的susiba2样结合元素的生物信息学分析表明，susiba2样转录因子可能有助于促进碳从直链淀粉向支链淀粉的重新分配。

结论

水稻蜡质突变体碳水化合物和油脂组分分析及基因表达谱分析GM077揭示了几个与直链淀粉缺乏的碳重新分配反应有关的候选基因，包括编码AGPase和SUSIBA2-like的基因。我们相信,AGP和SUSIBA2是经典育种和/或转基因植物改良的两个有希望的目标，以控制谷物种子中淀粉和其他组分之间的碳通量。

谷物作物对农业至关重要。全球生产（2009）的三大谷物（2009）是玉米，小麦和稻米，分别为819,686和685米吨（http://faostat.fao.org.）.谷类作物是我们最大的主要食物来源，在食品和非食品工业应用中也被高度使用。谷物之所以重要，是因为它们可以被培育成高产的谷物，谷物可以长期储存，谷物可以积累不同类型的碳水化合物和脂类。谷物颖果中的主要碳水化合物是淀粉组分直链淀粉和支链淀粉、细胞壁组分，如不同类型的阿拉伯木聚糖、混合连接的β-葡聚糖和纤维素、低聚果糖、果聚糖和蔗糖[1，2]．有趣的是，大量的油也可以储存在胚乳中，特别是在燕麦中[3.]．谷物的成分决定了这种作物的最终用途。例如，谷物胚乳是全世界淀粉最重要的来源[4，5因此，对粮食安全有巨大的价值。持续寻找具有高含量的直链淀粉，β-葡聚糖和/或Fructan的基因型，用于功能性食品部门的不同应用[6- - - - - -8]．在另一端，谱是开发谷物的努力，将碳通量从碳水化合物中重定向到用于生产高密度生物燃料的油[9- - - - - -13]．透彻了解谷物中光合产物的分配机制对于我们提高淀粉产量、为功能性食品工业开发特殊作物(如提高ß-葡聚糖水平的大麦)以及为非食品工业量身定制谷物生产至关重要。

高等植物的碳分配已在全植物水平上进行了研究[14，15]，用于某些种类的植物组织[16- - - - - -18，以及植物细胞[19]．但是，许多问题仍未得到答复。例如，我们需要识别和映射确定源和水槽组织之间的碳分配的关键元素的动作，并且沿着途径治理碳通量，用于合成不同的碳水化合物和油槽。我们还必须进入环境因素如何影响碳分区的洞察力[4，20.]．一些蛋白质被认为是植物碳分配的重要分子。它们包括参与糖运输和代谢的蛋白质，如蔗糖转运蛋白[21]，蔗糖倒置[22]和蔗糖合酶[23，24]，以及己糖代谢和转运，如己糖激酶[25和单糖转运体[26]．其他例子包括控制多糖生物合成通量的蛋白质，如adp -葡萄糖焦磷酸化酶[27和udp -葡萄糖焦磷酸化酶[28，29]和调节蛋白，如蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶[30.海藻糖-6-磷酸合酶[31和转录因子[12，32- - - - - -35]．

我们感兴趣的是确定谷物中的分子开关，它们将碳通量导向不同的组织和特定的最终产物。我们特别关注谷物种子中直链淀粉、支链淀粉、油、β-葡聚糖和果聚糖之间的碳分配。在本研究中，我们选择了一个水稻蜡质突变体，GM077，缺乏直链淀粉生物合成。我们检测了直链淀粉、支链淀粉、油、β-葡聚糖、果聚糖和其他膳食纤维之间的碳分配GM077背景，一个几乎等基因的蜡质系。我们在突变体和相应的野生型之间构建了一个抑制消减杂交(SSH) cDNA文库，以鉴定可能参与碳分配的候选基因。我们使用qPCR验证了SSH实验的结果，并研究了在没有直链淀粉生物合成的情况下，基因调控如何控制碳分配。

的GM077米是一种蜡质突变体

糯稻在中国传统食品和酿造中有着广泛的应用，在水稻育种中备受关注。这导致在中国水稻种质库中收集了大量糯稻，并在许多不同品质糯稻的育种项目中[36- - - - - -38]．我们选择了一个糯稻品种，GM077(没有代码。GM077；宝等人。未发表的），主要基于以下因素：i）它是一个稳定的突变体，具有几乎是近似的背景;ii）与其他蜡质突变体相比，它具有相对低的直链淀粉含量（另见下文）;III）除了其蜡质谷物特征，GM077与野生型BP034表型相似(代码:BP034)。BP034)是籼型水稻(在中国南方也以广芦爱4号栽培)的优良品种[38,Bao等未发表](图1-C;额外的文件1）.当GM077横切，碘溶液染色，胚乳中呈现典型的红色糯性淀粉[39，40]．我们进一步对谷物淀粉进行了表征GM077用扫描分光光度计记录淀粉-碘配合物在200 ~ 1100 nm之间的吸光度。我们纳入了已知直链淀粉含量的淀粉内部标准。如附加文件所示2，直链淀粉-碘配合物在595 nm附近的吸光度值随淀粉样品中直链淀粉含量的增加而降低，包括野生型(BP034)和突变型(GM077）.根据吸光度，估算出BP034和BP034的直链淀粉含量GM077分别介于标准4(26.5%)和标准3(16.2%)之间，标准2(10.4%)和标准1(1.5%)之间。这些估计经化学分析证实，显示出显著差异(P= 0.0001）分别在BP034和GMO077的核中的23.0％和6.9％的直链淀粉含量。两种类型的米粒中的淀粉含量约为67％（P>(图0.05)1 b）.

一般认为直链淀粉的合成是通过颗粒结合的淀粉合成酶(GBSS)进行的。谷物有两种形式的GBSS, GBSSI和GBSSII [41，42]．GBSSI在贮藏组织中负责直链淀粉的合成，如胚乳，而GBSSII存在于绿色组织中，包括种子的果皮。我们利用qPCR分析了两种基因在水稻种子中泛素基因的表达，UBQ5,作为内部标准。QPCR结果表明，在GM077种子，基因表达GBSSI被显着减少（图1 c）和表达UBQ5与控件BP034中的内容大致相同。的表达GBSSII显著增加GM077与BP034相比。

我们已经证明GM077水稻是一种蜡质突变体GBSSI．蜡质突变体的产量、粒重和淀粉含量与相应的野生型相似(图)1 b；额外的文件1）.为了深入了解碳在GM077种子，我们对突变体和野生型系进行碳水化合物和油分析。

来自淀粉糖的主要碳在蜡质突变体中重新分布于支链淀粉

碳水化合物分析显示两者GM077亲本BP034的膳食纤维含量约为3%，组成成分相似(表2)1；额外的文件3.）.膳食纤维成分以阿拉伯木聚糖和纤维素为主(各约占干颖果的1%)，β-葡聚糖和果聚糖为辅成分。因此，在GMO77突变体中，没有额外的碳被分配到细胞壁或β-葡聚糖或果聚糖库中。蜡质突变体(干颖果67.5%)的淀粉含量略低于野生型(干颖果69.3%)(P < 0.05)。直链淀粉含量在野生型(24%的淀粉)中正常，但在蜡状突变体(3.9%的淀粉)中高度下降(P< 0.01)。因此，在蜡质突变体中，种子中直链淀粉含量从野生型颖果的17%降低到2.6% (P< 0.01)。直链淀粉含量的减少主要是由蜡质颖果中支链淀粉含量的增加来补偿的，蜡质突变体中支链淀粉含量为65%，而野生型为53%。两种水稻品种的蔗糖和原油含量相同(P> 0.05)。葡萄糖的含量GM077突变体（0.2％）略高于野生型（0.1％）（P< 0.05)，但两行均较低。

因此表明碳水化合物分析表明蜡质突变体中的主要碳GM077从直链淀粉合成转移到支链淀粉合成。这一结果促使我们尝试去识别这些基因GM077负责重新分配。为此，我们采用了SSH策略(见下面)。

抑制消减杂交在蜡质突变体中鉴定出116个ungenes

我们使用GM077从植物开花后12天(daf)总RNA中提取cDNA，经PCR扩增和SSH后构建cDNA文库。生成的SSH库GM077vs BP034”包含471个克隆，平均长度约500 bp。将所有阳性克隆进行测序，共鉴定出116个unigenes。这116个unigenes被用于同源组(COG)的功能注释分析[43]，通过BLASTX和TBLASTX对NCBI蛋白数据库进行检测。在116个unigenes中，90个具有高度相似性(E-Value <10^-5)和已知的蛋白质序列，其中26个与报道的序列没有相似之处。在90条蛋白序列中，有26条缺失功能注释。其余的序列被分为4个功能组:“信息存储和处理”、“细胞过程和信号转导”、“代谢”和“特征不明显”(图)2；额外的文件4）.这四个官能团有12、21、23和8个unigenes，分别占总unigenes的10.4%、18.1%、19.8%和6.9%(图)2）.unigenes的详细信息及其假定的功能如表所示2．有趣的是，两个unigenes（克隆ID编号A74和ID No.2B03），类似于ADP-葡萄糖酸化酶小亚基的基因（agp；加入基因库。印度集团的ACJ86329.1和GenBank的加入号。AK103906和异淀粉酶(isa.；加入基因库。BAC75533.1，分别在碳水化合物运输代谢组中发现。值得注意的是，一个克隆(ID号。无相关COGs组与WRKY转录因子34 (GenBank登录号:D25)相似性较高。NP_001060116.1的Japonica组)。进一步对异淀粉酶和WRKY转录因子34的序列分析表明，它们是水稻和大麦的同源基因ISA1和SUSIBA2，分别由Sun等人所描述[34，42]．

半定量PCR验证SHH结果

为了验证SHH实验的结论，我们选择了两个管家基因，真核细胞延伸因子-1 α亚基基因(EEF-1α),UBQ5，采用半定量PCR进行SSH实验。当我们使用与SHH实验相同的一批RNA，或从种子发育的其他阶段或其他组织中分离的RNA时，我们发现两个管家基因的表达水平或多或少是相同的GM077和BP034。此外，突变型和野生型水稻在种子发育过程中以及不同组织中的表达水平是恒定的(图)3B).重要的是，我们观察到EEF-1α可在测试仪(GM077）和司机（BP034）在SSH之前样品，但在减法杂交后不在样品中（图3 c)，从而支持SSH方法的有效性。我们还选择了一些与淀粉生物合成和碳分配相关的基因(Materials and Methods)，以进一步验证SHH实验的可靠性，并获得两个水稻系中基因表达的详细定量数据。这些分析的结果如下。

蜡质突变体的基因表达谱分析

为了进一步验证SHH实验的结果并量化含有淀粉生物合成和/或碳分配的基因的表达，我们选择通过QPCR的基因表达分析的代表，包括两个参考基因，EEF-1α和UBQ5(附加文件5）.根据QPCR获得的结果，我们将基因分成五组（图4；表格3.）.分类是基于qPCR对差异基因表达的定量分析GM077；“显着下降”（P< 0.01)，“未更改”(P> 0.05)，“增加”(P< 0.05)，“显著增加”(P< 0.01)和“未检测到”。有趣的是，在四个显著增加的基因中，agp，SBEI, ISA1和苏比亚2 -除了SBEI是在SHH图书馆发现的我们注意到在GM077与SUSIBA2的表达水平相关-如转录因子基因(图4）.

基因表达相关性SUSIBA2-like和ISA1在突变型和野生型中

Sun等人[33，34证明了ISA1和SBEIIb在大麦中被上调了SUSIBA2转录因子的活性，并且在基因表达水平上有良好的相关性SUSIBA2它的目标基因，例如ISA1和SBEIIb［33，34，44]．为了了解这种相关性是否也适用于水稻，并努力在水稻中发现susiba2 -like控制基因，我们选择了水稻ISA1以此为代表，研究二者在表达上的相关性SUSIBA2-like及其稻米的靶基因。对于这项研究，我们在突变体中选择了不同的组织和不同的时间点GM077和野生类型BP034。如图所示5和B，在分析样本中，这两个基因的表达量之间存在极好的相关性。统计分析(图5度)，表明两个基因在空间和时间上的相对表达水平具有一个皮尔逊相关系数(r)为0.90 (P< 0.01)。

虽然高等植物和负责任的基因的蜡质突变体（GBSSI)进行了大量的研究，已知突变体支链淀粉含量高[39，45- - - - - -53，关于蜡质突变体中碳分配到其他碳水化合物和油组分的信息很少。此外，碳重新分配到支链淀粉的基因调控在突变体中尚不清楚。我们对谷物种子中光合产物在淀粉和其他贮藏化合物之间的分配感兴趣。在本研究中，我们选择了一个水稻蜡质突变体，当直链淀粉生物合成受阻时，跟踪淀粉和其他碳水化合物之间的碳分配。我们的碳水化合物分析表明，当直链淀粉含量减少时，绝大多数同化碳重新分配到支链淀粉，而不是其他碳水化合物或脂类。有趣的是，这种重新分配并没有改变种子的重量，而是在淀粉生物合成机制中将碳从一种化合物(直链淀粉)转移到另一种化合物(支链淀粉)。

为了了解控制支链淀粉生物合成增加的分子机制，我们开始鉴定蜡质突变体中上调的基因。从SHH实验中，我们发现了三个候选基因，它们之前已经被证明直接参与淀粉合成和/或其调控，AGP［54]，ISA1［55),而SUSIBA2-like［34]．AGPase和异淀粉酶的功能和调节已经被回顾并在之前有很好的文献记载[27，45，56- - - - - -59]．在谷类胚乳细胞中，有两种形式的AGPase，一种是胞质的，一种是塑质的。谷物胚乳中adp -葡萄糖的主要部分被认为是在细胞质中产生，然后运输到淀粉体中进行后续的淀粉生物合成。异淀粉酶在支链淀粉生物合成和淀粉颗粒形成中发挥重要作用[45，56- - - - - -58]．AGPase (cytosolic form)和ISA1已经被证明在水稻支链淀粉合成和淀粉粒形成中起重要作用[55]．我们的qPCR结果表明AGPase S(胞质型)[60]和ISA1有助于直链淀粉还原突变体中额外支链淀粉的积累GM077．在SHH实验中，我们无法确认已确定的agp与胞质酶对应的单基因序列不覆盖过境肽序列区域。然而，我们的qPCR分析两者的胞质(图4)和塑型(未显示)根据Ohdan等人[60]表示克隆ID No.74应该是胞质形式。

的高表达背后的机制AGP和ISA1在水稻突变体中的作用尚不清楚。一种增强的可能性AGP活性可能是当更多的可塑性AGPase被招募到多酶复合物中调节碳分配时，需要增加AGPase的总量以提供充足的adp -葡萄糖供应[61]．另一种可能性是需要额外的AGP酶GM077将Glc1-P转化为adp -葡萄糖(见下文)。由于ISA1被普遍认为是支链淀粉合成和颗粒形成的重要分子[45，56- - - - - -58]，这并不奇怪ISA1表达式GM077当在胚乳中产生额外的淀粉素时显着增加。

我们还观察到蔗糖合成酶4和UDPase1的基因被上调GM077．由于从UDP-葡萄糖前体（例如纤维素和β-葡聚糖）的其他碳水化合物的积累不受影响，因此我们表明蔗糖合成酶4和UDPase1基因的表达增加也可以与淀粉素合成相关．提出蔗糖合成酶4是细胞糖分子的[23]，并可能产生udp -葡萄糖，该葡萄糖被UDPase 1转化为用于合成支链淀粉的己糖磷酸[16]．事实上，拟南芥中的蔗糖合酶2和3与水稻蔗糖合酶4属于同一组[23，最近有报道将碳直接合成淀粉[62]．在我们的实验中，细胞质表达升高AGP支持那个概念。可能需要增强的AGP酶水平，以将通过蔗糖合成酶4和UDPase1产生的GLC 1-P转化为ADP-葡萄糖以进行另外的淀粉蛋白合成。对于其他形式的蔗糖合成酶和UDPase 2，我们没有发现基因表达中的任何显着变化GM077和BP034。

本研究主要研究糯稻突变体种子的碳分配和基因调控。我们的结果没有提供关于碳分配是如何在酶活性水平上调控的信息。Lü等[46的反义抑制转基因水稻GBSSI考察主要淀粉合成酶的活性。Lü等人在转基因水稻中观察到的一些表型性状与我们在转基因水稻中发现的相似GM077突变体，如种子重量没有变化，总淀粉含量变化很小。根据我们的基因表达分析，他们也注意到异淀粉酶活性的增加。然而，他们没有观察到AGPase或SBEs的活性发生任何变化，这似乎与我们在基因活性水平上的结果不一致。我们还不知道原因差异基因表达和酶活性,但应该注意的是,转录和蛋白质在细胞的水平取决于几个因素,如转录起始,信使rna稳定、翻译、效率和蛋白质稳定性和修改。

我们对基因调控和转录因子参与碳分配的知识很贫乏。Sun等人[34，35报道称，大麦SUSIBA2转录因子参与大麦中的糖信号，并通过与启动子区域内的SURE-element(具有A/T富区和假定的AAAA核心)结合上调靶基因[34，63]．他们认为糖诱导基因启动子区域的SURE-element(s)可能在susiba2控制的基因表达中发挥重要作用。有趣的是，当我们搜索9个上调基因的启动子区域时GM077，包括大米SUSIBA2-like，我们在所有基因中发现了许多推定的SURE元素(附加文件6）.发现了对基因表达水平的非常好的相关性SUSIBA2-like和ISA1．我们认为ISA1和其他基因在GM077突变体是由Susiba2样转录因子介导的。该概念是通过近期水稻转基因研究进一步证实（Hu等人未发表的）。有趣的是，当我们对三种选定基因的基因表达模式进行生物信息分析时（SUSIBA2-like，ISA1和agp)在本研究的SSH实验中，利用公开的水稻和拟南芥微阵列数据，我们发现了一些相关性SUSIBA2-like和其他基因（附加文件7）.然而,ISA1在拟南芥叶片中表达，而在水稻叶片中不表达SUSIBA2-like由于我们不知道的原因，在这两个物种中都很低。由于SUSIBA2-like是一种转录因子，其基因表达水平应该较低。是什么引起了差异的表情ISA1这两个物种的情况尚不清楚。在体外和在活的有机体内目前正在进行蛋白质- dna相互作用研究，以进一步确定SUSIBA2-like和SURE元素在调控水稻胚乳中淀粉生物合成中的作用。

除了作为淀粉作物的高价值外，人们对利用谷物生产非淀粉化合物越来越感兴趣，例如用于功能性食品的β-葡聚糖和果聚糖，以及用于生物燃料的石油[9，10，17]．我们的实验数据表明，水稻胚乳中支链淀粉的合成有三个重要基因，AGP，ISA1， 和SUSIBA2-like．自agp和SUSIBA2-like我们认为，它们可能控制了谷物中淀粉合成的整个代谢途径，是将碳通量从淀粉生物合成转向替代产品的良好目标。事实上，是降低监管的方法agp在拟南芥中以牺牲淀粉生物合成为代价来提高石油产量的方法获得了成功[18]．探索调制潜力将会有趣SUSIBA2谷物种子中光合产物从淀粉生物合成到其他合成代谢途径的策略。

对谷物种子的碳分配理解在植物生物学中具有重要意义。在这项研究中，我们使用了水稻蜡状突变体来获得分子见解，以获得淀粉糖缺乏如何影响谷物种子中的碳分配。蜡质突变体中的碳水化合物和油级分的分析表明，当淀粉糖缺乏时，碳主要分配给支链淀粉，而不是其他碳烯产物，例如β-葡聚糖或油。基因表达分析确定了几种含有碳重定位响应的候选基因。这些基因包括在内AGP和SUSIBA2-like．我们认为，这两个基因在试图将谷物种子中的碳通量从淀粉生物合成转向替代碳终端产品方面是有希望的目标。据我们所知，这项研究是全球范围内蜡质突变体碳组分和基因表达谱的首次比较分析。

植物材料与生长

BP034和GM077品种来自中国浙江大学核农业科学研究所糯稻育种计划。的GM077突变体最初由蜡质水稻繁殖计划中的γ-辐射产生[36-38，Bao等人。未发表的]。它已经通过多年的繁殖来发展到几乎是近代的背景。米植物在浙江大学校园农场上种植。单个分蘖在开花时被标记。分别在开花后第3,6,12,18和24天收获种子样品。来自BP034的不同个体的至少6个圆锥形或GM077在每个时间点取样。同一时间点(开花后第3、6、12、18、24天)对相应水稻植株的叶、茎、根进行采收。收获的组织立即在液氮中冷冻，并保存在-80°C直到使用。

碳水化合物分析

如前所述制备成熟和干燥的种子[44，64，65]．如Sun等人所述进行碘染色和分光光度计扫描。［35]．总淀粉和直链淀粉含量按照Sun等人的描述进行了预分析[35]．膳食纤维成分采用Uppsala法分析[66]和果聚糖(包括低聚果糖)，如Rakha等[67]．膳食总纤维以乌普萨拉法分析的膳食纤维组分与果聚糖的总和计算。混合连锁β-葡聚糖含量分析由McCleary和Codd [64[Santacruz等人所述的淀粉含量。［68]和Chrastil所描述的直链淀粉含量[69]．计算阿拉伯辛甲烷含量作为由乌普萨拉法测定的阿拉伯糖和木糖残基的总和，纤维素含量作为乌普萨拉法测定的葡萄糖残基与混合键β-葡聚糖含量的差异，以及淀粉络含量为差异在淀粉和直链淀粉含量之间。根据Bergmeyer等人分析免费GLC和SUC。［70]和Bernt和Bergmeyer [71]， 分别。原油含量根据欧洲标准方法测定[72]．

寡核苷酸

qPCR、半定量PCR和SHH实验中使用的寡核苷酸列在附加文件中5．筛选出19个有代表性的基因，其中包括2个内参基因eEF-1α和UBQ5．寡核苷酸购自Invitrogen（Carlsbad，Ca，USA）。

RNA隔离

按照前面描述的方法分离总RNA [34，35]．

定量PCR (qPCR)和半定量PCR

如前所述进行QPCR和半定量PCR [34，73]．SYBR Green Master Mix和cDNA合成试剂盒分别购自Toyobo(日本大阪)和Promega(美国麦迪逊，WI)。qPCR使用Bio-Rad (Hercules, CA, USA)的iQ5实时PCR仪，半定量PCR使用MJ Research PTC-200 (GMI, Ramsey, MN, USA)的PCR热循环仪。水稻的基因eEF-1α和UBQ5作为数据规范化的内生参考[74在qPCR]。用2法计算相对转录水平^——ΔCt［74]．

cDNA减法文库的构建GM077vs bp034.

的cDNA减法文库GM077使用SSH技术构建VS BP034 [75]．总RNAGM077从12个DAF的种子用作测试仪和作为驱动器的BP034的相应样品。Dai等人的协议。［76]随后进行以下修改：i）成绩单富集在体外转录;ii)双特异性核酸酶(DSN)介导的归一化和减法。附加文件中概述了该过程8，所有连接器、适配器和PCR引物均列于附加文件中5．对SHH产生的PCR产物进行酶切萨尔并在pUC19载体中克隆。利用重组质粒进行转化大肠杆菌DH5α。将转化的细菌施加到含有50μgmL的LB平板上^-1选用氨苄青霉素，40 μg ml^-1检测α-互补的X-gal [77]．选择白色和阳性菌落进行菌落PCR筛选，检查插入物。带有插入物的阳性菌落进行繁殖。利用M13正向和反向引物在北京华大基因研究所分离并测序。的eEF-1α用半定量PCR方法检测抑制消减杂交的效率。

生物信息学和统计分析

获得的序列由DNAstar®软件(Madison, WI, USA)编辑。使用Unigene序列在蛋白质数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）.检索的蛋白质具有高序列相似度（E-Value <10^-5)采用NCBI KOGnitor COG分类(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)，基于Tatusov等人的方法[43]．的独联体使用BioEdit软件(Carlsbad, CA, US)对基因启动子进行元素分析。所得数据的差异显著性通过具有阈值的方差分析进行检验P-值0.05 (http://www.ats.ucla.edu/stat/）.米的公开可用的微阵列数据（http://ricexpro.dna.affrc.go.jp）和拟南芥（http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress)用于基因表达模式的生物信息学分析SUSIBA2-like，ISA1和agp．

这项工作由以下组织和基金会提供资金：

·Vinnova支持的SLU Lärosätesansökan项目(TC4F)。

·SLU项目BarleyFunFood。

·浙江省自然科学基金项目(Y3090617, Y304463)

·瑞典环境、农业科学和空间规划研究委员会(Formas)，隶属于TCBB项目的战略研究领域。

·联合Formas/ sida资助的发展中国家可持续发展项目。

·瑞典国际发展合作署(Sida/SAREC)。

·Carl Trygger Foundation。

·瑞典农民基金会。

·部分由美国能源部与劳伦斯伯克利国家实验室签订DEAC02-05CH11231合同。

作者笔记

从属关系

1. 中国计量大学生命科学学院，杭州310018

   明周张，杰洪芳刘俊

2. 瑞典农业科学大学乌普萨拉生物中心植物生物学和森林遗传学系和林奈植物生物学中心，乌普萨拉，SE, 75007，瑞典

   闫霞，孙传新

3. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所黑河生态水文与流域综合科学重点实验室，甘肃兰州东港西路260号

   夏严

4. 2 .浙江大学核农业科学研究所，浙江杭州310029

   Jin-Song保

5. 瑞典农业科学大学乌普萨拉生物中心食品科学系，乌普萨拉，SE, 75007，瑞典

   Gunnel Fransson, Roger Andersson & Per Åman

6. 劳伦斯伯克利国家实验室地球科学部，加州伯克利回旋路1号，94720，美国

   詹桑克斯

通讯作者

对应到Chuanxin太阳．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

M-ZZ和J-HF进行了SSH、半定量和qPCR、淀粉预分析和生物信息学分析实验。XY进行了统计和启动子分析，部分生物信息学分析。JL做了部分qPCR实验。J-SB进行了多年的育种工作，产生了几乎同基因的蜡质突变体，GM077．GF进行碳水化合物和油脂分析。RA、CJ和PÅ参与了碳水化合物和油脂分析，并参与了手稿的修改。CS参与了实验设计、协调研究、起草手稿和解释结果。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

张明洲、方捷红对这部作品贡献很大。

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