转录组反应分析拟南芥蒂利亚纳leafminer (南美斑潜蝇）

背景

植物已经进化了一种复杂的电阻系统，并响应不同的攻击者展示各种防御模式。以前的研究表明，植物对咀嚼昆虫和植物饲喂昆虫的反应显着不同。然而，较少是关于叶菊昆虫的分子反应。要调查植物转录组对叶子植物的反应，我们选择了Leafminer南美斑潜蝇作为一种模型昆虫，它具有一种比咀嚼昆虫更类似于病原体破坏的特殊捕食模式拟南芥蒂利亚纳作为响应植物。

结果

我们首先调查了本地和系统性的回应A. Thaliana.使用Affymetrix Ath1基因组阵列喂养叶子喂养。高度调节与代谢过程和刺激反应相关的基因。大多数全系统诱导的基因形成了局部反应基因的子集。然后，我们从在线数据库下载了基因表达数据，并使用了分层聚类来探索基因表达模式之间的关系A. Thaliana.被不同的攻击者损坏。

结论

我们的结果表明，植物反应模式强烈耦合到攻击者的伤害模式。

植物已经发展了一种复杂的电阻系统，以防止各种类型的攻击者的损害。基于许多致力于植物防御信号转导的研究，已经确定了三种主要植物防御激素。它们是水杨酸（SA），茉莉酸（JA）和乙烯（ET），它们分别是对抗病原体，昆虫和真菌的关键信号分子[1-3.］．然而，最近的研究表明，这些信号以一种非常复杂的方式相互关联;有时它们会冲突，有时它们会合作[4.那5.，表明植物在受到不同攻击者的破坏时，表现出不同的防御模式。然而，决定这些植物反应模式的因素仍然不清楚。

植物对咀嚼昆虫和韧皮部饲养昆虫是显著不同[6.那7.］．这两种类型的昆虫不仅产生不同的elicitors，而且还有不同的饲养指南。例如，伤口导致植物细胞液体泄漏，刺激了许多防御途径的动员[8.];昆虫饲养会导致植物造成类似的损伤，但昆虫唾液中的菌株可以诱导特殊的植物防御蛋白[9.]或相反地抑制植物防御信号[10］．饲喂植物的昆虫造成很小的伤害，但长期损伤持续时间，这些昆虫的植物防御是轻微的[11那12］．与咀嚼昆虫和韧皮部取食昆虫相比，对有特殊取食向导的叶蝉的分子反应知之甚少。

豌豆叶子（南美斑潜蝇)以22个植物科的100多种植物为食，包括模型植物拟南芥蒂利亚纳．在成人阶段，女性飞使用她的产卵器渗透宿主植物的表皮;然后她要么在叶片内部产卵或在伤口部位喂食，这可以大大减少光合作用，最终杀死幼苗[13］．虽然雄性苍蝇无法穿刺叶子，但它们偶尔会在伤口和女性提供的产卵穿孔[14］．产卵孔周围的植物细胞通常死亡并形成均匀的坏死点，类似于由病原体产生的坏死斑点[15］．因此，叶子是一种特殊的昆虫，植物中的损伤模式有点类似于病原体，是测试昆虫损伤模式和植物防御模式之间的关系的良好模型。除了作为植物防御研究中的模型昆虫的重要性，这种害虫可能导致经济损失对寄宿植物作物，因为采矿幼虫消耗叶子，同时居住在叶子内部[16］．Leafminer Larvae在普拉索德和海绵状组织中消耗嗜树木[13那17］．叶潜蝇对植物的危害非常严重，但在早期很难发现，因为它们隐藏在树叶中;因此，研究植物对这种昆虫的内在防御是很重要的。因此，我们对叶虫-植物互作的研究不仅对探索植物-昆虫互作机制具有重要意义，而且对叶虫病虫害的防治具有重要价值。

在本研究中，我们使用了Affymetrix ATH1A. Thaliana.微阵列，来自有良好理解的基因组背景的生物体，从而能够全面代表转录组的反应，以研究表达模式变化A. Thaliana.响应局部（Li）和全身（Si）豌豆叶片损伤。我们发现在局部受损的组织中诱发了超过3000个基因，并且这些基因可以分为两类：代谢过程和刺激反应。系统防御A. Thaliana.豌豆潜叶蛾是非常相似的地方防御，以及SI-诱导的基因几乎相同，LI-诱导的基因，但在数量和更低的倍数改变较少。我们的防守信号通路的分析，在斑潜蝇A. Thaliana.揭示了对昆虫，细菌和真菌的信号响应都大大诱导。然后，我们从在线数据库下载数据并使用分层群集来探索关系中的关系A. Thaliana.由不同类型的捕食者引起的表达模式。有趣的是，两种不同类型的数据提供了证据，证明对豌豆叶虫的反应A. Thaliana.这支持了我们的假设，即植物的反应模式与攻击者的伤害模式密切相关。

Leafminer损坏的微阵列表达式模式A. Thaliana.

评估叶潜蝇损伤引起的表达模式变化A. Thaliana.，我们使用了一个yefymetrix Ath1A. Thaliana.基因芯片，其中载有22810个探针组覆盖大多数鉴定的cDNA和开放阅读框。三个生物重复实验，每个处理八个分厂进行。使用来自三个生物学重复提取的RNA，cDNA的合成和杂交到三个重复ATH1基因芯片。为了鉴定基因通过龄馈送显著调节，所述数据归一化并进行微阵列的显着性分析（SAM）。在三个实验中的数据的质量和再现性，通过比较确定为所有探针组检查“存在”。局部感染（LI）组织从控制（健康的）那些差异很大，而全身感染的（SI）组织与对照符合井（图1）.两个不同的对照实验的比较图（图1C)表明我们的实验在不同的样品中是一致的。另一项分析也证实，来自同一处理的不同植物的样品具有很大的一致性，因为相同处理的重复聚在一起(图)2一种）。李和Si表达模式彼此有很大差异（图2A).从LI组织中鉴定出约3096个基因，其中1695个上调，1401个抑制;SI数据集包含625个差异表达基因，其中496个表达上调，129个表达下调。采用实时定量PCR (qRT-PCR)验证微阵列杂交数据，结果证实了微阵列实验的可靠性(附加文件)1）.

进一步的分析表明Si和Li样品的差异表达基因之间的高相关性。虽然李和Si表达模式非常不同（图2A)， SI中调控的625个基因中有567个在LI中有差异调控(图)2B). SI的上调和下调基因，除了少数例外，组成了LI中差异调控基因的子集(图)2C, D).这些结果表明系统和局部的防御反应A. Thaliana.到斑潜蝇涉及类似的机制，但具有不同的基因表达的倍数变化范围。在SI专门调节的基因的GO分析表明，47个基因在SI专用上调掉进类集中于转录调控和刺激响应于诱导子如激素和几丁质（附加文件2）.

叶片植物调节基因的功能分类A. Thaliana.

Wego使用差异表达基因的生物过程分析[18]将LI-调控基因和si -调控基因划分为相似的类别，但在LI样本中每个生物过程类别中的基因数量更多(图)3.）.整个LI和si调控的基因集中在两大类:代谢和应激反应(图)3.氮，次生的，细胞的和初级的代谢过程都有显著的代表性。另一个值得一提的过程是细胞过程的调控，这一过程占整个调控基因的近六分之一。许多刺激反应基因都受到叶潜蝇损伤的调控，其中最重要的两类是对内源刺激的响应和对化学刺激的响应。这些类别代表了大多数在LI和SI中表达的刺激反应基因。上调基因的功能分类与所有调控基因的功能分类基本一致，尽管LI和SI在每个GO类别中的基因数量差异小于所有调控基因(图)3.b）。下调基因主要与代谢相关，少量与刺激反应有关的基因（图3.C）。

锂和Si中的差异表达基因与代谢和刺激反应有关，但可能会询问上调基因是否调节不同的细菌道，而不是下调的问题。为了确定这一点，我们解除了使用Easygo，基因属性的注释和功能性富集分析工具的叶霉素损伤调节的基因调节的途径[19］．几乎所有上调基因在叶螨损伤中均有局部和系统表达A. Thaliana.与防御显然有关（附加文件3.和4.）.虽然我们使用了一个非常严格的截止值（P.= 1×10^-5），我们发现，许多生物过程是在LI和SI的上调的基因丰富。直接关系到防御途径进行了大幅上调，包括其他生物如细菌和真菌，伤人，非生物刺激如渗透压，水，冷，刺激和化学刺激，包括JA，ET，和甲壳素的反应。即使是被富集均与刺激反应，例如，蜂窝式芳香族化合物代谢过程，典型地吲哚和衍生物的代谢过程的代谢过程。响应于脱落酸刺激和氨基酸衍生物的代谢过程均显着特别是在LI上调（附加文件3.）.下调的途径不像上调的途径那样受到显著的调控(附加文件)5.和6.）.使用更少严格的截止值（P.= 0.00001为li，P.= 0.001 SI)比用于分析基因表达的上调,我们发现李下调基因的途径集中在类别相关的细胞表面受体信号转导,色素生物合成的过程,对生长素的刺激做出反应,对一些非生物刺激和反应,如光和热(附加文件5.）;响应于温度刺激，二次代谢过程和氨基酸和衍生物代谢过程，富集Si下调基因，后者类似于局部下调的途径（附加文件6.）.

表达式模式的比较A. Thaliana.叶螨和其他典型的植物损害生物

在差异表达基因的功能分析，潜叶蛾，损坏A. Thaliana.除了调节伤害和非生物刺激反应基因外，还揭示了许多病原体防御基因，表明叶子与其他昆虫不同。已知叶子员是不寻常的，因为它们的损伤模式类似于病原体。然后出现问题：是叶子损坏的表达模式A. Thaliana.更类似于A. Thaliana.受病原体损坏或被其他昆虫损坏？

要回答这个问题，我们在差异表达的基因进行分层聚类A. Thaliana.受叶螨和其他八种因素的刺激，包括伤害、病原体特异性激发子和植物激素，如茉莉酸甲酯和SA。从TAIR数据库下载数据(ftp://ftp.arabidopesis.org/home/tair/microarrays/datasets/）使用SAM与我们的实验数据一起提取差异表达的基因。聚类分析显示，叶菊诱导的表达模式与由III型段系统（TTSS）细菌Elicitor HRPZ产生的叶子诱导的表达模式，以及诸如伤害和MEJA的刺激产生的图案非常不同。观察到的聚类结果支持叶子损坏的假设A. Thaliana.表达模式受叶米损伤模式的强烈影响（图4.）.

为了证实上述发现，我们分析了另一项研究发表的数据[20.]研究人员监测了表达模式A. Thaliana.响应于一系列微生物病原体和食草昆虫的攻击，具有非常不同的作用方式，包括两PV。番茄那链格孢属brassicicola和食草昆虫Pieris Rapae，Myzus persicae，和Frankliniella occidentallis.．使用上述相同的方法，我们在来自该研究的差异表达的基因数据上执行了分层聚类。结果清楚地证明了Leafminer损坏的表达模式A. Thaliana.与由两光伏．番茄，一种表征良好的微生物病原体（图5.）.

为了进一步研究植物防御与不同类型攻击者之间的相关性，我们比较了3个重要基因类别的表达情况:1)SA、JA和ET途径的关键标记基因(图1)6.一个，附加文件7.）;2)影响硫代葡萄糖苷代谢的基因，硫代葡萄糖苷是植物与病原体和草食动物相互作用的重要次级代谢物6.b，附加文件8.）;和3.）与生物攻击者的植物反应有关的一些重要基因，包括氧化应激，细胞壁生物合成和修饰，光合作用，信号转导和氮气和碳水化合物代谢（图6.C，附加文件9.）.在A. Thaliana.、JA、SA和ET信号通路对叶虫的响应与叶虫的响应最为相似Pieris Rapae.：JA信号途径对两种生物进行深度调节，但SA和ET信号仅略微影响（附加文件7.）.另一方面，A. Thaliana.葡萄糖苷代谢（图6.b）和重要的植物生理反应（图6.c）在Lea Leafminer攻击后非常类似于那些侵扰的人两PV。番茄．

当我们分析Leafminer损坏的本地和系统性表达式模式时A. Thaliana.，我们发现在表达的不同信号通路之间存在一种权衡。许多防御基因上调，而一些刺激反应基因下调。通过仔细分析这些途径，我们发现上调的基因主要参与生物胁迫反应，下调的防御基因则与非生物胁迫反应有关。由此可见，植物的防御系统能够在应对特定刺激的同时，下调其他防御途径以节约能量。

适当的损伤模式识别对植物表达合适的防御基因非常重要。例如，辩护A. Thaliana.伤害比伤害更强大Pieris Rapae.损害 [10]， 因为p . rapae可以减少组织压碎和最小化切叶边缘，同时去除最大的组织质量。事实上，有两组变量在宿主反应中扮演着重要的角色:物理损伤的确切性质和诱导子暴露在宿主中的程度[21］．许多昆虫和病原体试图通过最小化这两个参数来逃避植物防御[10那11］．从这个意义上说，采叶虫并不是昆虫成功进化的良好模型，因为采叶习惯并不能有效地减少这两个参数[16那22］．最后，应该指出的是，叶矿昆虫的疾病发病率显着低于外部喂养昆虫[16];说明叶螨损伤与病原菌损伤的基因表达模式具有相似性A. Thaliana.不是由叶虫引起的疾病引起的。

植物转录组对不同攻击者的反应可能不仅受到攻击者物种的影响，也可以受到植物生理条件的影响。例如，近交茄属植物carolinense幼苗表现出对食草动物的严重较弱，而不是脱次幼苗[23］．从TAIR数据库和其他公布的来源下载数据时，我们谨慎选择来自同一遗传背景的植物和类似的生理条件和年龄。因为回答A. Thaliana.向叶子和病原体具有类似的模式，就像他们类似的伤害模式一样，我们得出结论，攻击者的损伤模式在引出植物反应中发挥着重要作用。进一步调查表明次生代谢物代谢和一些植物生理反应，但不是植物激素，产生不同攻击者之间的防御模式相关性。在以前的一项研究中，A. Thaliana.对Silverleaf粉虱的反应（Bemisia Tabaci.B型[SLWF])涉及几种生物营养病原体防御途径的调控[7.];然而，在我们的研究中，银叶粉虱主要上调了SA信号通路，而叶蝉主要上调了JA信号通路。因此，植物对不同攻击者的防御模式不仅取决于不同激素信号通路之间的相互作用，还取决于防御信号通路、次生代谢产物代谢和重要生理反应的不同组合。

我们研究了转录组响应特征A. Thaliana.leafminer (L. Huidobrensis.）伤害，然后与对其他攻击者的响应分析其关系。我们发现叶子培养者诱导了许多辩护和新陈代谢相关的基因，其中一些与病原体防御相关。进一步的分析表明，响应模式A. Thaliana.对叶蝉的反应模式与A. Thaliana.到细菌病原体，这与斑潜蝇和细菌病原体的类似损坏模式是一致的。类型损伤图案的因而似乎是植物响应模式的重要决定因素。

植物和昆虫

种子A. Thaliana.(Col-0生态型)的自交后代拟南芥植物在10%漂白剂中表面消毒15分钟，用无菌水洗4次，然后在半强度Murashige和Skoog上镀[24] 中等的。植物在暗度下在4℃下分层2天，然后在16-H光/ 8-H深色光周期下转移到22℃下的植物四（光强度120μmolm）^-2S.^-1）.两至三个星期后，幼苗移植到混合泥炭 - 蛭石（1：2）灌封培养基中并在22℃的16小时光照/ 8小时黑暗循环（光强度120微摩尔米下放置在一个生长室中^-2S.^-1）.四周A. Thaliana.幼苗在随后的实验中使用。

种子phoudolusulus vulgaris.l .(简历。Naibai;(中国，北京，海中蔬菜市场)在一个环境箱中，单独播种在直径12厘米的塑料罐中，罐内装有泥炭-蛭石(3:1)混合盆栽介质。以两个完全发育的真叶的豆科植物作为叶潜蝇的生殖寄主。

豌豆叶子（L. Huidobrensis.）在实验中使用的是在我们的实验室中的连续培养。在实验过程中，新出现的叶子饲养在10％蜂蜜中饲养2天，以释放到释放前A. Thaliana.植物。

植物治疗和cDNA样品制备

大约50个交配L. Huidobrensis.成虫被释放到四周大的叶子上产卵A. Thaliana.八个盆中的植物（每壶4个幼苗）。这A. Thaliana.幼苗尚未成熟，还没有开始开花。成虫在4小时内被清除，此时大约有一半的叶子受到了伤害。当潜蝇幼虫达到二龄时，在产卵96 h后，对褐飞虱的叶片造成损害A. Thaliana.采集叶螨幼虫进行局部危害分析(LI);采集同一植株受损叶片相邻的完整叶片进行系统损伤分析(SI)。样品分别在液氮中冷冻。为LI和SI准备了三个重复样本，每个样本包含至少8株植物的组织。从相同年龄的健康植株的叶片中制备了3个对照样品(H)。使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)从每个重复和对照样品中分离总rna。根据制造商的说明，从分离的RNA中合成cDNA (http://www.affymetrix.com/support/technical/manuals.affx）.使用GeneChip®阵列站的HT阵列板的表达分析技术手册。

微阵列杂交和数据分析

Affymetrix微阵列（A. Thaliana.含22,810探针组ATH1基因组芯片）在我们的实验中使用。标记和所述ATH1微阵列的杂交（每码片一个样本）根据制造商的说明进行（http://www.affymetrix.com/support/technical/manuals.affx）.使用GeneChip®阵列站的HT阵列板的表达分析技术手册。根据Affymetrix微阵列标准进行质量控制，表明所有样本都满足了对控制信号，房屋保持基因信号，“呈现”百分比数和低背景和噪声值的所需标准。使用Genespring软件（5.0版;硅遗传学）扫描探针阵列并进一步分析。每种基因和每种芯片的归一化进行标准化，以允许对每组实验进行三个独立的复制进行比较。此外，使用由阵列的无论如何为阵列的Affymetrix治疗分配的标志，单独进行归一化的每个实验和植物组织。但是，仅考虑了三个芯片中至少有两种筹码中宣布“目前”或“边缘”的那些成绩单。为了鉴定每种治疗中的差异表达的基因，SAM分析（微阵列软件包的意义分析）进行了A. Thaliana.使用Q值≤0.05的治疗和控制之间的一式三份样品≤0.05并折叠变化≥2作为截止标准。我们使用EasyGo软件搜索了不同表达探测器集的GO信息（http://bioinformatics.cau.edu.cn/easygo/category_treebrowse.html.）.在生物过程查找方面，应用χ2用虚假发现速率（FDR） - 调整截止的测试P.<0.0001。群集3.0 / treeView软件[25]用于对表达谱相似的基因进行分组和显示(http://rana.stanford.edu/software/）.使用默认选项和未受所监位的相关性度量的分层群集在归一化数据上执行。符合MIAME标准格式的微阵列数据已存放在GEO数据库中（GEO记录号GSE38281）。

从公共数据库下载微阵列数据

用于不同损伤模式表达聚类分析的转录组数据集从拟南芥信息资源(TAIR)公共基因芯片数据库(ftp://ftp.arabidopesis.org/home/tair/microarrays/datasets/）.使用用于我们自己数据的相同方法识别来自每个实验的差异基因。有关TAIR MicroArray数据库的下载数据集的详细信息列于其他文件中10．其他数据来自发布研究的结果[20.］．

定量实时聚合酶链反应

在20微升的反应体积，其中包括10微升2X SYBR预混EX Taq酶™主混合物（宝酒，京都，日本）进行PCR反应，每一个基因特异性引物（0.25μM表1)和1 μl cDNA模板。在Mx 3000P检测系统(Stratagene, La Jolla, CA, USA)上进行扩增，反应条件如下:10 s在95°C,紧随其后的是40周期的5 s在95°C, 20年代在58°C,和20年代在72°C,和最后一个周期的30年代在95°C, 30年代在58°C,和30年代在95°C,产生融化曲线用于判断特异性PCR产品。β-肌动蛋白被用作管家基因。通过连续稀释得到标准曲线以量化靶mrna的拷贝数，并将基因数量归一化至β-肌动蛋白水平。然后将应激样本中每个基因的归一化值除以未处理对照组的值，折线作为每个基因的相对水平。为了纠正板块的变化液态氧健康人的mRNA水平A. Thaliana.在每个板上量化22°C时生长。

我们感谢CapitalBio Corporation与Affymetrix MicroArray技术的帮助。本研究得到了中国国家基础研究计划（973计划）（2012CB114105）和中国国家自然科学基金（30921063），研究所基础研究所，森林生态学研究所，环境和保护研究所，中国林业学院（Cafrifeep201102-5）。

隶属关系

1. 农业虫害鼠害综合治理，中国科学院动物研究所，中国科学院，北京，中国国家重点实验室

   张素芳，康乐

2. 中国林业科学研究院，国家林业局，森林生态研究所，森林保护重点实验室，北京

   张素芳，张震

通讯作者

对应到乐康．

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

SZ设计并进行了实验，分析数据，并写文章;ZZ帮助修改书稿;LK设计实验和修改的手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

开放获取本文在“生物资源”中央有限公司的许可下公布了这是一个开放式访问条款，分配根据创意公约归因许可证的条款（https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

再版和权限