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基于SSR基因的红枣(凤凰dactyliferal .)

BMC植物生物学体积12文章编号:237（2012）引用这篇文章

摘要

背景

枣椰树(凤凰dactyliferaL.)在中东和北非是一种重要的树，因为它的果实有营养价值。分子育种可以通过标记辅助选择加速果树的遗传改良。然而，分子标记的缺乏限制了分子育种的应用。

结果

在本研究中，我们分析了来自枣椰树基因组数据库中的28,889个EST序列，以识别简单序列重复序列(SSRs)，并开发基于基因的标记，即表达序列标记-SSRs (EST-SSRs)。我们鉴定了4609个含有SSRs的ESTs，其中三核苷酸基序(69.7%)最常见，其次是四核苷酸(10.4%)和二核苷酸基序(9.6%)。基序AG(85.7%)在二核苷酸中最为丰富，基序AGG(26.8%)、AAG(19.3%)和AGC(16.1%)在三核苷酸中最为常见。根据计算数据，共设计了4967对EST-SSR标记引物。在后续的实验室研究中，我们对20个随机选择的引物对样本进行了扩增和多态性检测，使用的是枣棕榈树品种的基因组DNA。近三分之一的引物对检测到DNA多态性，以区分所使用的12个枣椰树品种。对含有SSRs的EST序列进行功能分类，发现3108个(67.4%)的EST序列与已知蛋白同源。

结论

红枣EST序列为开发基于基因的标记提供了良好的资源。本研究发现的这些基因标记可为进一步的遗传研究和枣枣品种开发提供有价值的遗传和基因组工具，如多样性研究、QTL定位和分子育种等。

背景

枣椰树(凤凰dactyliferaL.)是一种雌雄异株的多年生单子叶果树，属于槟榔科，起源于美索不达米亚[1］．枣椰树是世界上最早栽培的果树之一，代表了包括橄榄和无花果在内的一组古老果树。2］．它被种植在南亚和非洲的热带和亚热带地区。与许多其他植物一样，由于森林砍伐、人口压力和农业发展的砍伐，产地中心的枣椰树的遗传多样性受到栖息地丧失的威胁[3.］．此外，利用基因库中少量遗传物质培育优良品种，并在育种中密集使用分蘖繁殖，会进一步造成遗传多样性的丧失，导致植株易受遗传侵蚀。因此，遗传多样性的保存和评价是枣椰树种质资源保护中重要而及时的问题[3.］．

传统上用形态描述符对枣椰树种质的遗传变异进行了表征。然而，由于环境因素和植物发育阶段的混杂效应的影响，这些形态标记往往是不可靠和不明确的[4］．此外，利用形态性状检测遗传变异是费时费力的。对树木育种最具挑战性的限制是较长的世代周期和在生产力性状表达之前需要多年的时间。因此，任何为育种提供捷径的工具在改善椰枣等乔木作物方面都是无价的。例如，如果在克隆的早期发育阶段就可以使用相关分子标记来确定性状，如抗病和虫害能力，以及克隆的雄性或雌性(性别)，而无需繁琐的表型分析，这将使育种者能够快速选择具有理想性状的精英树，从而节省时间和资源。分子生物学技术的发展为植物种质遗传多态性的检测提供了DNA标记新创由于突变和体细胞无性系变异。许多研究报告使用分子标记来研究枣椰树的遗传多样性和遗传关系，包括随机扩增多态dna (rapd) [5- - - - - -10，扩增片段长度多态性(AFLP) [11- - - - - -13和简单序列重复(SSR) [14- - - - - -17］．

枣椰树基因组有36条染色体(2n=2x=36)，基因组大小估计在550 Mb [18]及长约658 Mb [19］．与许多其他作物品种相比，在红枣分子遗传学研究方面的投资相对较少，导致遗传和基因组工具基础设施不发达的严重限制。虽然开发和使用了包括SSR标记在内的分子标记，但在有效评估多样性、构建遗传连锁图谱以及利用标记辅助育种等方面仍存在不足，但枣椰树的分子工具箱总体上是有限的。

最近植物研究的趋势是使用基因靶向而不是随机的DNA标记，因为基因组序列的廉价和快速估计最近为这种基于基因的标记的发展提供了巨大的潜力[20.］．基于基因的标记在数量性状位点定位、分子育种和基因克隆等方面具有重要的应用价值。表达序列标签(EST)-SSRs也被称为基因SSRs。est衍生SSRs形成了一种有价值的遗传标记类型，在定位候选基因时，作为假定功能的一类功能标记。基因SSRs在遗传图谱上的分布可以反映基因在基因组中的分布情况。因此，近年来，EST-SSRs被广泛用于构建高密度连锁映射[21- - - - - -23和一些与表型相关的EST-SSRs在标记辅助育种项目中是有用的[24，25］．基因SSR标记的另一个重要特征是，与基因组SSR标记不同，它们在相关种和属之间是可转移的[26］．

到目前为止，还没有在枣椰树中发现基于基因的标记。目前的挑战不仅在于识别出与农艺性状相关的基因，而且还在于识别出可用于育种计划的基因相关标记。因此，迫切需要扩大DNA标记的密度和可用性，特别是基于基因标记的红枣分子育种的可能性，并调查红枣种质中感兴趣性状的分子表征现状。

枣椰树中大量的EST序列被[19)使用新创下一代测序为开发基于基因的标记提供了有用的资源。本研究的目的是对枣椰树的EST-SSRs基因进行表征，评估和比较不同类型EST-SSRs在基因序列中的频率和分布，并开发EST-SSR标记作为枣椰树的遗传和基因组工具。

结果

枣椰树EST-SSRs的频率和分布

通过筛选28,889个组装好的红枣EST序列，我们鉴定出4,609个(16%)含有SSRs。由于一些EST序列包含多个基序，从这些SSRs中共发现5981个不同的基序(表1)．假设EST序列的平均长度为500 bp，本研究分析了约14.4 Mb(占红枣基因组的2.2%)，结果表明红枣EST序列中每2.4 kb至少有一个SSR。在鉴定的基序中，三核苷酸基序(69.7%)最多，其次是四核苷酸基序(10.4%)和二核苷酸基序(9.6%)1)．二核苷酸基序中AG(85.7%)的丰度较高，三核苷酸基序中AGG(26.8%)的丰度较高，其次是AAG(19.3%)和AGC(16.1%)(表4)2)．

表1从红枣EST序列中提取的SSR基序数
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表2二核苷酸和三核苷酸ssr中不同类型基序的频率
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为了研究不同基序中重复数的变化趋势，研究了不同基序下EST-SSRs在不同重复数下的分布。我们的结果表明，所有二、三、四、五和六核苷酸EST-SSRs的分布普遍向重复数量较少的EST-SSRs倾斜(图1)．在二核苷酸和三核苷酸SSRs中观察到一些较高的重复数，但在四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSRs中，没有发现重复数超过6。红枣EST-SSR标记的平均重复数为3.94个，从五核苷酸基序的低平均重复数(3.03)到二核苷酸基序的高平均重复数(5.26)不等。

图1
图1

不同基序EST-SSRs在不同重复数上的分布

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EST-SSR标记开发及多态性检测

从选定的5981个SSR片段中，设计了4967对PCR引物;这种微小的减少是由于一些EST序列没有足够的SSR侧翼序列长度来设计引物。这些EST-SSR引物被命名为DPGxxxx，其中DPG指的是基于红枣基因的标记，并与从红枣基因组序列中开发的SSR标记(如[27- - - - - -29］．新设计的EST-SSR引物列在附加文件中1，以及他们的Tm, GC%，产品大小和相应的EST序列的信息。

为了验证4,967个EST-SSR标记，我们从该集合中随机选择了20个引物样本，使用从12个椰枣品种分离的基因组dna模板来评估它们的功能和检测多态性的能力。在使用的20对引物中，1对引物没有产生可见扩增子，而其他19对引物产生了预期产物大小的扩增子。19个标记中的6个(30%)在12个枣椰树品种中识别了遗传变异(图2)．

图2
图2

用3个EST-SSR标记检测12个红枣品种的多态性

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含有SSRs的EST序列的功能注释

所有含有SSRs的EST序列都用Blast方法在NCBI数据库中搜索蛋白质的同源性。我们检测到与已知蛋白同源的序列有3108条(67.4%)，与表达的、假设的或未知的蛋白同源的序列有787条(17.1%)。其余714个(15.5%)序列与任何已知蛋白均无同源性。

基因本体的研究主要集中在生物过程、分子功能和细胞成分三个方面，它们代表了基因产物的特性。本研究使用Blast2GO对含有SSRs的枣椰树EST序列进行了基因本体分类，发现其中52%属于生物过程，为“细胞过程”和“代谢过程”。其中49%和38%的序列与具有分子功能“结合”和“催化活性”的蛋白同源。最后，分别有51%和40%的蛋白与细胞组分“细胞”和“细胞器”相关的蛋白同源(图3.)．

图3
图3

基于基因本体分类的红枣EST-SSRs的研究

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讨论

随着下一代DNA测序变得越来越快、越来越便宜，大量的序列数据正在呈指数级生成并公开，包括来自不同植物物种的大量ESTs。这些序列为SSR标记的挖掘提供了潜在的有用资源。在本研究中，我们从28,889个序列中鉴定出4,609个含有SSRs的红枣EST序列。与其他植物相比，红枣基因序列中SSRs的频率(16%)较低。例如，在柑橘中检测到的SSRs频率为33.3% [30.，蓖麻籽28.4% [31), 24%虹膜［32］．然而，数据棕榈的这一频率(16%)高于油棕榈的6.1% [33］．红枣的SSR密度为1 / 2.4 kb，也低于其他植物(柑橘1 / 1.97 kb，蓖麻1 / 1.77 kb)。然而，SSRs的频率取决于EST序列数据库中用于识别SSRs的标准。

在红枣EST序列中，最常见的二核苷酸SSR基序为AG，占85.7%。基序AG在一年生和多年生植物包括苹果和柑橘中都是最丰富和高度多态性的[30.，34］．孟等人。[35]比较了基因基序AG在ESTs和基因组序列中的出现频率，发现基因基序AG在EST中的出现频率高于基因组序列中的出现频率m . truncatular、大豆、l .对虾，拟南芥,和米饭。在红枣三核苷酸SSR基型中，AGG和AAG的数量最多，而在四核苷酸SSR基型中，AAAG(19.2%)、AAGG(14.3%)和AGGG(13.3%)的数量最多。虽然SSR基序在植物基因功能中的作用尚不清楚，但有证据表明，SSR基序AG在植物基因的5 ' UTR上蜡状基因与水稻淀粉酶含量和调控玉米受精的核糖体蛋白基因5 ' UTR中的基序CCG有关[26］．在红枣中，AG含量丰富的基因SSRs存在，这些基序在含SSRs基因功能中的作用有待进一步研究。

本研究对含有SSRs的EST序列进行了功能注释和分类，揭示了这些序列与红枣发育的各个方面有关。大多数转录本在细胞成分类中被归为“细胞”和“细胞器”，在分子功能类中被归为“结合”和“催化活性”，在红枣生物过程中被归为“细胞活性”和“代谢活性”。柑橘类也有类似的结果。30.］．

在红枣EST序列中，三核苷酸SSRs最为常见，其次是四核苷酸和二核苷酸SSRs，这与其他植物物种的情况一致。EST序列中三核苷酸SSRs的丰度归因于编码区对移码突变的耐受性[26］．有证据表明，与位于utr的EST-SSRs相比，位于编码区的EST-SSRs似乎揭示了相同水平的多态性[36］．因此，EST序列确实是挖掘枣椰树SSRs的一个极好的资源。

虽然从红枣基因组序列中提取SSR标记的报道较少，但目前仅鉴定出56个SSR标记[27- - - - - -29］．增加这些标记的可用性将有助于枣椰树的遗传和基因组研究，因为它们是比RAPD标记更好的工具，因为它们具有共显性遗传、多等位基因性质和高重复性[5，37- - - - - -41］．在本研究中，我们报道了大量(4967)的EST-SSR标记在枣椰树中的鉴定。使用随机选择的20个标记，我们检测到6个(30%)作为鉴定多态性的一打红枣品种面板。该方法有望在枣椰树中开发大量高密度EST-SSR标记，数量大到足以在育种中具有价值。这些新标记不仅能丰富DNA标记库，丰富遗传和基因组工具，而且由于它们来源于转录本，可促进枣基因组的进一步研究，如比较作图、分子育种和基因克隆等。这种表达谱也可用于根据植物基因组间的同位关系识别农学相关基因[20.］．

EST-SSR标记在植物遗传多样性评估中的应用和潜力[33，42]，对基因标记的鉴定也很有价值[43，44］．在红枣中，基因相关标记的缺乏限制了该作物分子育种的应用。鉴定与性别相关的标记在枣椰树种植中特别重要，因为这些标记有助于更容易地消灭雄性植物。al - dous等人[19]已经确定了大量的SNPs和一个与性别相关的红枣基因组区域。我们在本研究中报道的EST-SSRs可能是除snp之外的一种有用的基因组工具，因为它们为性别相关基因和其他感兴趣的性状的关联映射提供了潜在的资源。大量基于基因的标记由于具有较高的转移性，可用于比较作图，研究近缘枣椰树种间的基因共线顺序和共线性。它们还可用于了解不同绿洲和枣椰树种群的遗传多样性，为枣椰树的保护和可持续利用提供依据。一旦确定了与理想性状相关的分子标记，育种中的标记辅助选择将促进这一宝贵作物品种的遗传改良。

结论

本研究旨在确定红枣EST序列中SSRs的频率和分布，并开发基于基因的EST-SSRs标记，用于后续的遗传和基因组学研究。本研究鉴定的EST-SSR标记为研究枣椰树的遗传多样性、基因定位和标记辅助选择提供了有用的工具。对含有SSR的红枣EST序列进行功能分类，发现这些EST代表了许多具有生物学、细胞和分子功能的转录基因。因此，在研究遗传变异的同时，从EST序列中提取的SSR标记也提供了与红枣品种之间可能的表型差异相关的基因功能信息。

方法

公开的椰枣EST序列从数据库中获得:http://qatar-weill.cornell.edu/research/datepalmGenome/download.html．共使用28889条EST序列挖掘SSRs，重复数截止值为二核苷酸SSRs≥5，三核苷酸SSRs≥4，四、五、六核苷酸SSRs≥3。引物使用BatchPrimer3设计[45]，最佳引物长度为20个核苷酸，最佳熔化温度为50℃，最佳产物尺寸为150 bp，最佳G/C含量为50%。设计的引物列在附加文件中1．

使用Blast2GO对含有SSR的序列进行功能表征[46识别这些序列的生物过程、分子功能和细胞成分本体。实验室研究中用于多态检测的12个枣椰树品种的DNA样本是由美国农业部/农业研究所(Riverside, CA)的R. R. Krueger博士和M. Keremane博士提供的。DNA提取使用植物DNA提取试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)进行(表3.)．

表3用于EST-SSR标记验证的枣椰树品种
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所有新设计的EST-SSR标记的PCR反应条件如下:基因组DNA 25 ng，混合正向和反向引物1.5 μM, 1X Buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM NH4）2所以4， 10 mM KCl, 2 mM MgSO4， 0.1% Triton X-100)， 0.2 mM dNTPs和1uTaq聚合酶总体积为20 μl。PCR扩增在以下条件下进行:95°C 5分钟进行初始变性，然后95°C 30秒，48°C 30秒，72°C 1.5分钟，35个循环，最后使用Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)在72°C延伸5分钟。PCR产物在2%琼脂糖超筛凝胶(Shelton Scientific IBI, Peosta, Iowa)中分解。用EB进行凝胶染色，用Gel Dec (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)进行可视化。

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下载参考

确认

我们非常感谢Manjunath Keremane博士、Robert Krueger和Richard Lee博士提供的枣椰树品种的DNA样本。

作者信息

从属关系

  1. 塔斯基吉大学农业与环境科学系，美国阿拉巴马州塔斯基吉36088

    赵永丽，罗克珊·威廉姆斯，C S普拉卡什，何国豪

作者
  1. 永丽赵
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  2. 洛葛仙妮威廉姆斯
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  3. C S普拉卡什
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  4. Guohao他
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相应的作者

对应到Guohao他．

额外的信息

作者的贡献

YZ和RW进行了数据挖掘分析和底漆设计。YZ还筛选和开发了EST-SSR标记。CSP参与了研究的构思和手稿的起草。GH设计并协调了这项研究，协助进行了统计遗传分析，并起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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关于这篇文章

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赵，杨，威廉姆斯，R.，普拉卡什，C.S.et al。基于SSR基因的红枣(凤凰dactyliferal .)。BMC植物杂志12，237(2012)。https://doi.org/10.1186/1471-2229-12-237

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关键字

  • 基因的标记
  • EST序列
  • 基因本体论
  • 多态性
  • 枣椰树

BMC植物生物学

ISSN: 1471 - 2229

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