烟草花粉转录组的综合分析揭示了精子发生过程中极细胞扩增和潜在异慢性转移的共同途径

背景

许多开花植物产生双细胞花粉。花粉粒的两个细胞在雄性配子体中注定了不同的命运，这为研究花粉管生长过程中单细胞极性扩张以及生殖细胞分裂和精子细胞命运规范的协调控制的遗传相互作用提供了独特的机会。应用安捷伦44 K烟草基因芯片对烟草雄性配子体进行了首次转录组学分析。此外，我们对拟南芥根毛毛细胞转录组进行了比较研究，以评估参与极化细胞尖端扩增的遗传因素和共同途径。

结果

萌发4 h后，花粉粒从新鲜开裂的花药向花粉管的发育过程中，至少有5161个(14.9%)配子体特异性表达探针在其中一个发育阶段具有活性。相比之下，> 18821个(54.4%)探针优先在孢子体中表达。我们的比较方法确定了104个花粉管表达基因的子集，这些基因与根毛毛原细胞重叠。反向遗传分析表明，Cu/Zn超氧化物歧化酶1 (CSD1)、含有WD-40的蛋白(BP130384)和复制因子C1 (NtRFC1)是花粉管尖端生长的主要调控因子。将我们的分析扩展到第二单倍体有丝分裂之外，能够根据生殖细胞周期的进展确定细胞增殖的核心调节因子和细胞命运决定因子的对立动态积累。

结论

本研究为分离细胞尖端扩增的保守调控因子和雌配子体花粉管生长特有的调控因子提供了基础。转录组数据集提出了一个基准，为未来的功能研究使用花粉发育为模型。我们的研究结果证明了某些基因在花粉管尖端生长中的未知功能。此外，我们强调了雄性配子体中核心细胞周期调节因子的分子动力学，并提出了第一个解释被子植物精子发生时间差异及其与雌性配子体发生协调的遗传模型。

花粉管的极化延伸将双精子细胞传递给雌性配子体，是开花植物有性生殖成功和保持区系优势地位所必需的基本过程。了解有性生殖是植物研究的前沿，并从近几十年来基因组学、转录组学和蛋白质组学技术的发展中受益匪浅。微阵列技术的进步和拟南芥、水稻和其他物种基因芯片的开发，使得研究不同组织的大规模转录谱成为可能，这已成为鉴定功能基因组学新靶点的关键工具。

和其他被子植物一样，烟草(烟草)原孢子孢子细胞减数分裂产生单倍体小孢子后，在花药内形成雄配子体[1]。此后，只发生两次有丝分裂。第一次花粉有丝分裂(PMI)涉及单倍体小孢子分裂产生配子生殖细胞和营养细胞。这两种细胞类型不仅在表达转录物的数量和多样性上有所不同[2，3.]，但至关重要的是，也决定了他们的命运。在花粉管萌发后，生殖细胞经历第二次有丝分裂(PMII)产生两个雄性配子(精子细胞)，而营养细胞则采用不同的命运，并获得确保花粉管生长的关键任务。在柱头表面，花粉管萌发并穿透雌蕊花柱组织，将两个精细胞送到卵子和中心细胞附近进行双受精。在开花植物中，花粉萌发后精子细胞的产生代表了祖先的模式。然而，超过30%的被子植物，包括拟南芥，在花粉成熟前完成第二次分裂[4，5]。对于种子植物雄性配子体中精子细胞增殖时间差异的调节机制，目前还没有解释，也没有阐明早期配子产生的进化益处。对精子DNA含量的独立分析揭示了精子细胞发育的五种模式，这些模式在精子细胞形成和成熟与雌性配子融合之前的相对时间方面有所不同[5，6]。

花粉管萌发是一种独特的细胞现象。花粉管以两极分化的方式在雌性组织中生长，类似于真菌的根毛生长、毛状体发育、菌丝生长和动物神经系统中神经元树突的延伸[qh]7，8]。因此，共同的因素可能参与了原始分子级联反应，这些级联反应启动和控制单细胞尖端的扩张和形态发生，随后由细胞或组织特异性形态需求调节。以花粉管和根毛为模型系统的研究已经揭示了一些促进和维持尖端生长特征的信号分子和调控途径。最近，秦等人的一项研究[9]揭示了一个特定的基因子集，在花粉管中通过雌蕊生长时被诱导，但在体外生长时却没有。在这组基因中有潜在的受体蛋白，可能对雌性的提示作出反应，指导花粉管尖端的生长。总的来说，这些实验证明了细胞尖端的扩张直接依赖于细胞顶端生长区域囊泡的极化胞吐。尖端区域的水泡运输是尖端生长的结构要求，在尖端定位信号的反馈调节中起着重要作用，以维持顶端细胞的扩张[10]。

直到最近，除了大豆外，还没有大型研究分析过双细胞花粉转录组。大豆) ［11]。新和他的同事首次报道了烟草花粉转录组[12]，他从分离的烟草精子细胞中构建了EST文库。该项目旨在鉴定参与精卵识别和融合的蛋白质，并鉴定了分布在1050多个簇中的1864多个EST序列。这一分析发现了可能在受精和胚胎发生早期阶段发挥作用的父系候选基因。然而，精子细胞转录组仅占花粉表达转录本总数的一小部分，尽管EST测序很敏感，但它只提供了有限的表达基因列表，从而最大限度地减少了全面的功能性下游分析[3.，12- - - - - -14]。

在本研究中，我们利用安捷伦44 K烟草微阵列的最新发展，首次深入了解烟草花粉和花粉管转录组，这代表了从拟南芥的三细胞花粉到科学，医学和商业兴趣的双细胞模型的相反实验模型。除了广谱基因表达谱外，我们还对烟草花粉管和拟南芥根毛毛细胞的转录组进行了比较分析[15- - - - - -17以揭示与极性细胞扩张有关的共同途径。为了研究它们在烟草花粉管生长中的潜在作用，我们使用基因本体(GO)工具来分配它们的生物学作用，并采用反义转染方法来验证所选候选基因的功能。

我们进一步探索我们的数据集，从分子角度阐明男性生殖细胞增殖和精子细胞形成的控制。在被子植物中，细胞周期活动的异时性改变导致生殖细胞分裂时间的发育改变，并导致受精过程中精子发生和配子融合的多样化模式[4- - - - - -6]。为了阐明被子植物中这种转变的遗传网络，我们研究了花粉发育的五个阶段——即成熟花粉和体外萌发的花粉管，在生殖细胞有丝分裂完成后的4、13、24和48小时——核心细胞周期抑制因子和激活因子的表达。在这些结果的基础上，我们假设了一个遗传模型，其中男性生殖细胞周期的进展与“受精时间”相协调。

本研究生成的烟草花粉和花粉管基因表达谱以及我们的分析为未来研究极化细胞扩增和精子发生控制等方面提供了理想的平台。此外，对表达基因进行编目将为配子体荧光标记的开发提供机会，从而可以研究细胞行为和细胞命运。目前的研究代表了全面了解雄性配子体发生的一步，这方面的知识将提供一个有效的框架，以改善当前的农业和育种计划，以维持食物需求，并调查烟草对健康的影响。

安捷伦44k烟草芯片的应用烟草雄性配子体转录组

为了了解烟草花粉成熟过程中基因表达的多样性以及程序期诱导下转录的变化，我们应用烟草微阵列技术(imaGenes, Berlin, Germany)，对雄性配子体发育的两个时间点:成熟花粉粒(MPG)和体外萌发花粉管(PT4)进行了比较微阵列分析。烟草成熟花粉脱落时为双细胞花粉(图2)1)，并且预计具有一组独特的转录本，这些转录本在系统发育上先进的三细胞花粉中被过度或不足地代表。利用离体培养4 ~ 48 h的花粉管，通过实时定量RT-PCR (qRT-PCR)验证微阵列表达，建立核心细胞周期调控因子的表达模式(图2)1 b, c)。另外两个组织样本——叶片(L)和根(R)——被用作孢子生参考。本研究收集了室外温室烟草植株的花粉粒，探讨了不同天气条件对花粉管萌发的可能影响。总体而言，在整个采收期间，花粉管发芽率和长度没有观察到显著变化(图2)1 d)。

规范化表达式值(参见资料和方法，附加文件)1和2:图S1a和表S1)进行跨组织比较，以鉴定优先表达的基因。为了测试阵列的质量，我们严格评估了我们的数据集，以证明它们在重复中的可重复性，从而在单个组织之间提供可行的比较。我们使用主成分分析(PCA)和独立应用层次聚类来可视化组织之间以及生物复制之间的关系。配子体和孢子体基因表达谱的独特性得到了验证，以及样品重复之间的可重复性(附加文件1:图S1b)。散点图用于可视化的分布p-单个探针相对于彼此的值以及相对于平均表达值的值。观察到重复之间和相似起源的组织之间的密切关系，而与不同组织相关的巨大变异性被证实(附加文件)1:图S1c)。阵列-阵列强度的强度依赖比(MvA)衍生值独立地支持了所观察到的内部和相互关系。总的来说，得到的归一化表达式数组被确认为下游比较的良好质量。

我们选择了9个候选基因，通过实时qRT-PCR验证了它们在用于微阵列分析的两个发育阶段(MPG和PT4)的微阵列表达谱，并将分析扩展到pmii后的三个发育阶段(离体花粉萌发后13、24和48 h)。除了RAB GTPase和WD40基元蛋白(BP130384)外，所有测试基因的qRT-PCR图谱与芯片的图谱一致(图2)2)。pmii后阶段的扩展分析提供了微阵列无法获得的额外信息，以了解花粉管延伸过程中基因表达和mRNA稳定性与基因功能的关系。

烟草雄性配子体与孢子体转录组的比较分析

体细胞来源的组织构成了一个不同于配子体的转录组，因此为分类在雄性配子体中优先表达的基因提供了一个很好的参考点。为了对四种组织样本进行系统比较，只考虑可靠表达的基因子集进行分析(见材料和方法)。在此标准下，MPG 13966个探针(40.3%)、PT4 14100个探针(40.7%)、L 27869个探针(80.5%)、R 27589个探针(79.7%)被确定为可靠表达。先前对烟草转录组的分析使用了40k定制设计的Affymetrix微阵列，报告了76%的探针组在19种不同烟草组织(包括叶和根)中的可靠表达[19]。我们检查了各个数组之间的重叠程度。正如预期的那样，与叶片或根相比，MPG与PT4共享的表达基因数量最多(图2)3)。在孢子体组织之间则相反，超过16566(56%)的转录本是孢子体所独有的，在叶和根之间共享(图2)3)。下面将详细讨论这些共表达基因的生物学意义。

当这8个序列的平均值被组合成孢子体和配子体表达基因的“主列表”时，配子体的复杂性明显降低，5161个探针(14.9%的表达转录物)被认为是雄性配子体特异性的，并且至少在一个发育阶段活跃。这明显低于孢子体独有基因的类似值(18,821个探针，表达转录物的54.4%)。MPG和PT4对雄性配子体特异性亚群的贡献相似，分别只有544个和630个探针专属于MPG和PT4(图2)3和附加文件3.表2)。花粉管转录组的这种微小但显著的变化表明，两种转录组的多样性存在微妙的差异，并且在程序期开始时诱导新转录基因的作用不太显著。我们的研究结果与在拟南芥花粉和花粉管转录组中观察到的基因表达变化相一致[9，13]，强调在双细胞和三细胞花粉的物种中，整体基因表达的调控是相似的。

基因富集分析为预测基因亚群的生物学功能和施加于感兴趣组织的显性途径提供了有价值的信息。我们应用了一个统计t-测试分位数归一化日志₂-转化的阵列数据，只选择满足以下条件的基因:对于一个基因发生了显著的表达变化，探针必须具有(1)ap-值≤0.05;(2)通过错误发现率(FDR)修正以最小化FDR [20.];(3)绝对表达信号(折叠变化)≥3(上调或下调);(4)表达水平> 100(任意截止)。中等数量的基因(830;5.3%的雄性配子体基因)在MPG和PT4之间的表达发生了显著变化(图2)3 b, c和附加文件4表S3)。有趣的是，与叶片和根相比，MPG转录组在基因表达变化方面的多样性分别比PT4转录组低11.2%和10.9%(图2)3 b, c)。有关其他成对分析，请参阅附加文件5表S4，其他文件6表S5，其他文件7表S6，其他文件8表S7，其他文件9表S8。

我们确定在配子体优先表达的基因中，与孢子体的基因相比，是否有氧化石墨烯项显着过度代表。配子体中被过度描述的氧化石墨烯术语包括那些与定位相关的术语(氧化石墨烯生物过程;p= 2.3e-11)，转运体和结构分子活性(GO分子功能，p= 1.02 -06和p= 4.4e-16)，以及膜封闭管腔(氧化石墨烯细胞成分，p= 9.4e-06)(图3 d)。与转运体活性相关的氧化石墨烯类别(氧化石墨烯分子功能，p= 0.0016)，钙调素结合(GO分子功能，p= 0.019)和大分子复合物(氧化石墨烯细胞组分，p= 5.4e-4)在成熟花粉中与花粉管相比代表性最大(图2)3 e)。这些类别在成熟花粉中的过度表现，特别是钙调蛋白结合[21，22]，可以促进花粉能力，为花粉管萌发的初始阶段做准备。

花粉管转录组与根和根毛共享一组独特的基因

花粉管尖端生长的特征与动物的根毛、毛状体和神经轴突等其他极生组织具有共同的生理特征[23]。我们研究了与拟南芥基因列表重叠的程度，这些基因要么在功能上被证实对根毛发育至关重要，要么被认为是根毛特异性的独联体-元件(RHE)在其启动子内[11，15，16]，以及其中的参考文献]。这些图案是通过组合来定义的在网上(Patmatch分析工具，http://www.arabidopsis.org/cgi-bin/patmatch/nph-patmatch.pl)和实验筛选产生了904个具有一致RHE元素的基因的初步列表[15]。虽然这个列表来自根毛特异性转录组，但所鉴定的基因的作用并不一定局限于根毛形态发生。我们通过编译cvr kov等人来扩展我们的分析。[16]，他收集了一份基因清单，这些基因要么具有根毛缺陷表型，要么具有根毛特异性表达，要么已知在花粉管尖端生长中起作用。总共有73个基因[16]。

首先，我们确定了PT4和本研究的根转录组之间重叠的基因，并编制了一组9812个基因(记为PT4R，附加文件)10表S9)。为了对参与尖端生长的常见途径进行有意义和直接的评估，我们进一步筛选了PT4R列表，只留下与拟南芥同源基因最接近的基因(e = < 10)^-10年［19])(3264个基因)。我们将这个子集命名为PT4R_ATH(附加文件)11:表S10)。

PT4R_ATH子集用于筛选与根毛转录组和蛋白质组的重叠[15，16]。我们从904个与烟草PT4R_ATH转录组重叠的rhee补丁基因中检测到78个基因(8.6%)，从cvr kov等人的列表中检测到另外26个基因(35.6%)。总的来说，这代表104个基因(附加文件12(表S11)。在根尖生长中具有已知功能的其他基因被人工选择，或者没有显著的拟南芥同源性，或者它们的表达仅限于4 h花粉管(在根和根毛转录组中不可靠)12(表S11)。我们的方法鉴定了在花粉管和/或根毛细胞扩增中具有已知功能的基因，以及可能在极化细胞生长中发挥重要作用的新靶点。出现了几个特定的靶点，包括:WD-40重复家族蛋白;RAC GTPase激活蛋白;微管马达蛋白;含有CBS结构域的蛋白质;翻译起始因子5A (eIF-5A);复制因子C1 (AtRFC1);VILLIN和FIBRIN蛋白家族的成员;铜锌超氧化物歧化酶1 (CSD1)。

为了强调促进极性细胞扩增的分子网络，我们研究了104个花粉管/根毛重叠基因子集中氧化石墨烯类别的代表性或代表性不足。我们确定了18个被过度描述的氧化石墨烯术语，包括与运输、细胞成分组织、对刺激的反应和营养库活性相关的术语，而氧化石墨烯术语“结合”(离子结合)被低估13:表S12)。高代表性的亚类别包括与染色质修饰有关的亚类别(p= 0.01, n = 4)，翻译(p= 0.03, n = 4)，蛋白质转运和周转(p= 0.013, n = 3);独联体- - -反式高尔基网络、逆行囊泡介导的转运以及与GTPase活性相关的基因(p= 0.003, n = 3)，信号传导(p= 0.004, n = 9)，微管和细胞骨架组织(p= 0.014, n = 3)，细胞命运和细胞形态发生(p= 4.15e-05, n = 5)。鉴定出的氧化石墨烯中有几个与花粉管和根毛极化生长有关[9，13]。特别是，参与染色质重塑和转录、信号转导和运输的基因在通过雌蕊半在体内生长的花粉管中被大量报道，因此可以介导花粉管的生长和通过花柱的引导[9]。

花粉管和根毛重叠候选基因的反向遗传功能验证

根据其表达谱、GO类别、相关性和新颖性，选择5个候选蛋白进行功能分析。在花粉管和根毛转录组重叠的氧化石墨烯类别中，确定了三个候选类别:Cu/Zn超氧化物歧化酶1 (CSD1);氧化石墨烯活性氧代谢过程);复制因子C1 (NtRFC1;去绑定);和含有PD40蛋白的WD-40(细胞内氧化石墨烯过程，亚类CUL4-RING泛素连接酶复合物)。第四个候选物，NTP303 (SKU5-like)推定铜氧化酶;氧化石墨烯氧化还原酶活性[24])，被选为最丰富的烟草花粉管壁糖蛋白[25在整个花粉管生长过程中大量转化[26]并具有预测的重要功能。最后，选择真核翻译起始因子eIF5A(氧化石墨烯初级代谢过程)作为花粉管生长过程中组成表达蛋白和翻译机制的一个组成部分。

我们使用转染试剂Cytofectin [27，28为生长中的花粉管注入针对目标基因设计的反义寡核苷酸。转染技术和微量注射引入反义寡核苷酸以及sirna模拟转染C．线虫和带有RNA干扰(RNAi)序列的哺乳动物细胞系[29，30.]。该技术已用于证明烟草和百合花粉管的基因功能[31，32]。

转染抗eif5a和抗ntp303不影响花粉管的生长

真核翻译起始因子和延伸因子在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞分裂、细胞生长和细胞死亡[33]，以及植物对缺铁的反应[34];eIF5A作为一般非特异性对照。在花粉管培养4小时后，野生型正、反义转染的花粉管在花粉管长度和形态上均无显著差异(n = 254，双尾Wilcoxon Mann-Whitney)U测试(U测试以后),p> 0.05, U = 2932，图4 b)。参考花粉萌发对平移的依赖性[35]，我们提出了与其他翻译起始因子可能存在冗余的问题。

生长中的花粉管的快速伸长是由花粉管壁物质的生物合成和传递所决定的。NTP303编码一个69 kda的糖蛋白[37]推测其功能为铜离子氧化还原酶(UniProtKB/TrEMBL, accession B6U720)，预测定位于液泡和叶绿体中(WoLFPSORT评分= 5和4)，并有可能定位于细胞外(SubLoc RI = 1，准确度= 56%)。我们试图用反义寡核苷酸转染来减少NTP303基因的表达，结果没有发现花粉管生长受到明显干扰，也没有发现任何多效性形态缺陷(n = 151;U测试中,p> 0.05, U = 309)4 b)。

抗pd40诱导的敲低表现出严重的花粉管生长停滞

我们研究了BP130384(拟南芥同源物AT5G67320)的推测作用，这里标注为PD40 (Pollen管D有效性WD -40)，含有预测核定位的WD-40蛋白(WoLFPSORT评分= 8;SubLoc RI = 1，准确率= 56%)。已知含有WD-40结构域的蛋白质参与促进关键发育过程的蛋白质相互作用[38]。用pd40反义寡核苷酸转染萌发中的花粉粒会严重干扰花粉管的生长(图4)4摄氏度)。平均而言，36%经PD40反义处理的花粉管显著变短(n = 252;U检验，p < 0.001, U = 4694.5)比野生型和感官处理的花粉管平均长度长(图2)4 c, d)。除生长发育迟缓外，未观察到其他形态学异常。最近，WD-40蛋白作为CUL4-RING E3泛素连接酶的底物受体的作用已在拟南芥和水稻中得到证实[39]。迄今为止，涉及WD-40蛋白的独立模型是由WD-40蛋白透明TESTA GLABRA1 (TTG1)、bHLH转录因子GLABRA3 (GL3)和两种MYB蛋白WEREWOLF (WER)和CAPRICE (CPC)组成的根毛和毛状规范模型，它们共同施加了根毛规范的位置依赖模式[40- - - - - -42]。我们的观察强调了极化细胞生长过程中蛋白质周转和循环的重要性。

CSD1缺失表现为花粉管延伸完全阻滞，花粉管尖端形态不完整

为了确定我们预测的在活性氧(ROS)调节中的重叠候选基因是否也在尖端生长中发挥作用，我们研究了CSD1，一种已知在ROS解毒中起作用的Cu-Zn超氧化物歧化酶载子蛋白[43]。最近，CSD1被证明在转录和翻译水平上受miR398调控，以响应铜的可用性[44]。我们确定CSD1是胞质定位的(WoLFPSORT评分= 14;SubLoc RI = 3，准确率= 84%)。CSD1反义敲除导致花粉管发育迟缓，平均长度为168 μM，显著短于对照(n = 251;U测试中,p< 0.001, U = 4511)4 e)。大约33%的种群表现出异常花粉管表型(图2)4 f)。一小部分花粉管(3.4%，n = 91)顶端出现异常肿胀，这在csd1感转染的花粉管和野生型花粉管中都没有观察到(图2)4 e插图)。活性氧动态对花粉管尖端形态的影响已被多次证实，并最终强调了活性氧在萌发花粉管顶穹中的作用[10，17]。我们发现CSD1的缺失会影响花粉管的生长，这进一步扩展了我们对极细胞扩增的认识，它可能在根毛形成和形态发生过程中起着类似的作用。

NtRFC1基因敲低导致花粉管萌发部分受阻

DNA复制因子C1, NtRFC1 (烟草NCBI加入DW003643，拟南芥同源物AT5G22010)介导拟南芥基因组稳定性和转录基因沉默[j]。45]。预测NtRFC1定位于细胞核(WoLFPSORT评分= 12;SubLoc RI = 5，准确率= 94%)。ntrfc1反义寡核苷酸的存在使花粉萌发4 h后出现花粉管伸长缺陷，其中51.7%的花粉平均长度为415 μM，矮秆性状显著(n = 191;U测试中,p< 0.001, U = 1485)4 g h)。在最严重的情况下，6.2% (n = 188)的花粉管几乎完全停止萌发。有趣的是，ntrfc1反义寡核苷酸浓度越高，缺陷花粉管的比例越高(数据未显示)。

对于进一步的功能分析，了解花粉管尖端生长、花粉管-雌蕊相互作用、信号传导和指导的分子基础，剩余的候选基因具有相当大的兴趣。

在成熟花粉和4 h花粉管中，已证实或可能参与细胞周期抑制的基因占主导地位

我们使用MAPMAN软件http://mapman.gabipd.org/web/guest/mapman［46提取一组被归类为细胞分裂和细胞周期进程调节因子的基因。我们的分析仅限于在两个重复中可靠检测到且表达水平远高于背景的基因。37个基因被归类为在细胞周期进程中起作用，而25个基因被注释为参与细胞分裂的某些方面14(表S13)。我们使用半定量RT-PCR来验证所选目标基因的表达，并在花粉管生长13、24和48 h后扩展pmii后的分析(图2)1 c,图5)。样品选择使我们能够在具有双细胞花粉的被子植物中建立这些关键细胞周期调节因子在pmii前后的表达动态。

细胞周期抑制因子积累的减少意味着抑制和生殖细胞有丝分裂的进入

双细胞花粉中DNA含量的定量分析表明，在小孢子第一次单倍体分裂后，生殖细胞的发育需要细胞周期阻滞或缓慢进展，直到花粉萌发后8-12 h进入PMII [5，6]。我们的分析显示，已知的细胞周期抑制剂在成熟花粉阶段占主导地位，持续到4小时的花粉管(图2)5、附加文件14(表S13)。这些抑制剂包括视网膜母细胞瘤蛋白1 (RBR1)，两种细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制激酶-即kip相关蛋白1和3 (KRP1, KRP3)-以及DEL3和PAS2。我们之前证明了RBR1在阻断营养细胞核进入s期中的重要作用，并将其与早期在拟南芥雄性配子体中指定营养细胞和生殖细胞命运的功能联系起来[49]。我们目前的研究结果表明，RBR1转录本在花粉成熟阶段非常丰富。其表达在花粉管生长4 h后减少，在花粉管生长48 h后仍保持稳定水平(图2)5)。同样，KRP6/7是已知的拟南芥生殖细胞周期进程的抑制剂，其抑制活性被F-box蛋白FBL17抑制[50]。在本研究中，我们检测到KRP家族的两个成员，KRP1和KRP3，具有相反的表达谱。而KRP1在成熟花粉中丰度较高，此后在花粉管生长的48 h时间点急剧下降(图2)5)， KRP3在整个发育过程中表达极低，直到24 h花粉管中显著达到峰值(图2)5)。

过渡到细胞周期进程是通过阻断细胞周期抑制因子的活动来实现的。F-box蛋白家族是SKP1-CUL1-F-box蛋白复合物(SCF)的组成部分，已知可抵消KRP蛋白诱导的CDKA抑制。我们检测到5个f -box样基因的表达(附加文件)14(表S13)。半定量RT-PCR分析显示，FBL12和FBL21的表达在“分裂窗口”达到峰值，随后在pmii后迅速下降(图2)5)。我们还检测到APC10的表达，APC10是后期促进复合体(APC/C)的一个组成部分，通过泛素介导的细胞周期蛋白的蛋白水解参与细胞周期蛋白亚基的周转，以防止细胞周期蛋白过早进入并促进细胞周期退出。另一APC/C组分的最新遗传特征APC8通过激活DUO花粉1的抑制因子miR159，将APC活性与CycB1的转录抑制联系起来[51]。我们的分析显示，APC10的表达水平在PT4之前一直处于下降状态，然后在13 h时间点显著升高至最高水平(图2)5)。这一观察结果指出了APC/C在生殖细胞周期中的双重作用，其中CyclinB1转录抑制与雄性配子体中泛素介导的降解相结合。

G2/M因子的显著峰值标志着向激活和生殖细胞有丝分裂的过渡

已知的细胞周期激活因子的不足进一步强调了4 h花粉管中有丝分裂细胞周期的休眠状态。G2/M主调控因子CycB1;1仅在成熟花粉和4 h花粉管中不可靠地检测到14(表S13)。相反，在生殖细胞向第二次有丝分裂过渡时(离体花粉萌发后~10-13 h)， CycB1;1的表达在“分裂窗口”(离体花粉萌发后~10-13 h)特异性显著增强，并保持其表达状态，之后逐渐降低(图10-13 h)5)。我们还检测到CycB1;1表达的两个MYB转录激活因子:NtMybA1，以及假定的拟南芥DUO花粉1 (DUO1)的烟草同源物，这里注释为ntduo1样(NCBI胚加入AB032537 (Q8H0H3)) [52]， e值为1e-78)。烟草NtmybA1是一种R1R2R3 MYB转录因子，类似于动物c-Myb蛋白，可诱导CycB1;1在细胞周期的G2/M期特异性表达[53，54]。NtmybA1在CycB1激活中的作用在G2/M时被TCP20特异性增强，TCP20是一种teosinter -branched cycloidea PCNA因子，通过结合CycB1;1启动子序列中的增强子元件(GCCCR) [55]。另一方面，DUO1是一种R2R3 MYB转录因子，我们之前证明了它是生殖细胞分裂和精子细胞命运分化的双重调节剂[47，56]。NtMYBA1、NtDUO1-like和TCP20这三个因子逐渐增强，并同时在“分裂窗口”达到峰值，这反映了它们的靶点(CycB1;1)和生殖细胞的细胞周期状态(图1)5)。值得注意的是，这些有丝分裂入口守门人的表达在13h时间点达到最高水平，此时> 80%的生殖细胞正处于有丝分裂的过渡阶段或已完成有丝分裂产生两个精子细胞(图2)1 c插图)。

其他关键阳性调节因子的稳定存在，如CDKA;1, CDKB1;1(其抵消KRPs对CDKs的活性)[57])，而CDKB2;2 (CycD3的合作伙伴，促进s期进入和进展)似乎提供了一个积极的平衡和一个预先进入并通过细胞分裂周期进行的分子开关(图2)5、附加文件14(表S13)。我们观察到成熟花粉到PT4的CDKA;1和CDKB1;1的表达在CYCB1;1强表达之前略有增加(图2)5)。此后在整个程序期的进展中，它们的表达是稳定的。

精子命运特征标记在生殖细胞分裂前后不断积累

生殖细胞有丝分裂与精子命运规范的耦合是通过生殖细胞内已知的细胞命运分化标记的重叠表达来确定的，这些标记进展到新形成的精子细胞。我们之前表明，DUO1整合了这两个事件，从而使生殖细胞分裂和调节一系列精子细胞分化标记的转录[47，56]。在本研究中，我们检测到29个拟南芥duo1诱导靶标的烟草同源物，其中包括两个已验证的靶标(附加文件)15:表S14 [56])。这些同源物包括染色质重塑蛋白(CHR34)、WD-40 CUL4-RING泛素连接酶(DAW1)、锌指家族蛋白(c3hc4型环指)、DUO1激活未知蛋白(DAU1)、含NAC结构域蛋白74 (anac074)、糖转运蛋白(AT5G26250)和含重金属相关结构域蛋白(AT1G51090)。鉴于DUO1的作用，这些基因也可能是烟草精细胞命运规范的调节者。我们验证了4个候选基因的表达，并确定C3HC4、CHR34和GRF11具有相似的丰度和表达谱，而DAW1在PT4达到峰值，此后下降到相似的水平(图4)5、附加文件15(表S14)。其他靶基因几乎肯定在烟草雄性配子体中表达，并可能发挥比拟南芥更为保守的作用，包括决定精子细胞的命运和功能。

总之，我们对雄性配子体发育的分析发现，随着生殖细胞周期的进展，保守的细胞增殖调节因子和细胞命运决定因子交替积累。它们的活动可能是导致被子植物中精子发生和配子融合多样化模式的异时性转变的原因。

随着基因注释技术的不断完善和功能分析工具的出现，烟草已成为研究基因功能，特别是参与花粉管生长和受精的基因的“实用”实验模型。因此，我们的数据集为跨物种功能研究提供了新的机会-例如百合GCS1的扩展研究[58，59在具有先进基因组信息的生物体中，如拟南芥和水稻。茄科植物基因组的不完全注释虽然有了明显的改善，但仍然是茄科植物研究的一个缺陷。

花粉管和根毛转录组的比较分析有助于深入了解细胞尖端扩增和形态发生的遗传网络

我们从花粉管和根毛转录组的全球比较分析中鉴定出一套基因，这意味着揭示了参与控制尖端生长形态发生的遗传网络。在鉴定的基因(~104)中，18个氧化石墨烯类别被归类为高代表性(p< 0.05)，其中包括与染色质修饰、转录和翻译、蛋白质转运和周转相关的基因;独联体- - -反式高尔基网络，逆行囊泡介导的运输，信号转导，微管和细胞骨架组织，细胞命运和细胞形态发生，以及细胞和细胞壁代谢过程。从鉴定的氧化石墨烯类别中出现的几个基因先前已被功能表征。其中包括两种转录因子——npr1样蛋白3 (TRAF家族)和RAP2.12 (AP2-EREBP家族)，它们与防御反应和增强ADH1转录和酶活性有关[60),分别。以花粉管为模型进行功能测试，我们验证了三个候选基因的功能，并说明了它们在花粉管尖端生长中的作用(附加文件)13:表S12)。我们的研究结果表明，铜代谢(CSD1)、染色质重塑(AtRFC1)和调控的泛素介导的蛋白质水解(PD40)是花粉管延伸过程中必不可少的过程。类似地，最近发表的关于F-box蛋白SKIP2(拟南芥scf型F-box和富含亮氨酸重复序列的E3泛素连接酶，VFB-4)和LSK1-LSK3(拟南芥ASK1最接近的同系物)的分析也证明了26S蛋白酶体介导的蛋白水解在花粉管延伸过程中的重要性[61]。此外，“晚期基因”的表达已知在花粉萌发过程中以一定的速率持续存在[13，62，63]。NtRFC1已用于维持基因组稳定性和转录基因沉默[45]，因此可以抑制营养细胞内生殖细胞基因的表达，同时调节烟草生殖细胞染色质状态。两种细胞类型通过细胞质桥接共享资源和调控分子，从而可能在成熟过程中实现同步控制的概念越来越明显，尽管它尚未在分子水平上得到证实[64，65]。在本研究中，我们证明了NtRFC1作为与花粉管尖端扩展相关的基因表达网络的一个组成部分的重要作用。

我们承认，我们的方法可能在选择标准上过于严格，导致潜在的候选人损失。例如，三个基因——JACKDAW (JKD)、CTR1和AXR2——是调控根毛细胞分化和扩展的遗传网络的重要组成部分[41，66，48]，但它们在我们的数据集中的表达被归类为不可靠，很可能是因为它们的低表达水平。另一方面，对gnm -like 1 (NtGNL1)等基因的鉴定，NtGNL1是花粉管尖端定义生长的关键成分[67]在烟草花粉管转录组中进一步支持了我们的选择标准。我们同时检测了已知在体外与GNOM相互作用的亲环蛋白5 (CYP5)， DV999409 [48]。此外，我们的鉴定不仅限于细胞命运规范基因，还包括大多数细胞类型适当扩增所需的基因，例如根毛缺陷3 gtp结合(RHD3)蛋白家族的成员(附加文件)12:表S11) [67，68]。我们的数据进一步扩展了研究尖端规范、起始和扩增的控制，并提供了一个平台，通过微阵列定向的反向遗传分析可以用来增强我们对极化细胞扩增的理解。

关键的问题仍然是这些基因如何在水合作用下对花粉粒极性进行重编程，从而通过雌性传粉组织中的多个阶段介导程序相起始点和花粉管生长。这种比较方法支持这样一种观点，即通过研究极化花粉管和根/根毛之间的遗传重叠，更有可能揭示促进花尖扩张的普遍机制，以实现预期的形态结构和细胞功能。

缺乏表型缺陷NTP303敲低表明花粉管生长的关键调控因子存在强大的备份

NTP303糖蛋白是4 h花粉管中含量最多的蛋白[37]，是花粉管壁的主要组成部分[25]。之前的击倒尝试NTP303表达式在足底使用RNAi载体不会改变花粉发育或花粉管生长。然而，针对NTP303家族成员(ntp101，201，302和ntp805)同时产生雄性不育植株，这些植株在体内但在体外没有花粉管生长缺陷[69]。根据这一观察结果，我们假设NTP303可以(1)通过花柱促进花粉管的生长，因此这种作用只能在体内观察到，尽管在传递组织中没有检测到NTP303蛋白;和/或(2)参与花粉管壁的形成，因此其敲除只能导致弱细胞壁的形成，这在体外并不明显。在足底在体外研究中，利用氨基酸微测序和免疫定位方法报道了在花粉和花粉管的营养细胞、生殖细胞和精子细胞周围的营养质膜上检测到NTP303蛋白(1);(2)花粉管细胞壁和胼胝质塞;(3)花粉管生长1 h后的花粉管颗粒组分和花粉管生长8 h后的细胞质[69]。这些结果强烈提示NTP303可能通过囊泡运输转运到花粉管细胞壁/膜上[69]。然而，在生长的花粉管顶端未检测到NTP303，因此不太可能参与直接信号转导。另一方面，它可能是细胞内信号系统的一部分，因为除了转运肽外，还预测了gtp结合位点和几个可能的磷酸化位点[70]。NTP303与拟南芥SKU5 (SKS12, AT1G55570)同源，后者是SKS小家族(SKS11、12、13和14)的成员，具有抗坏血酸氧化酶基序并编码细胞外糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白[71]。该基序是烟草BY2细胞扩增所必需的sku5突变体在定向根生长中表现出生长缺陷[71]。我们对ntp303反义寡核苷酸转染后花粉管缺陷缺失的观察重复并独立验证了之前的观察[69]。考虑到NTP303是花粉管中最丰富的成分，NTP303 mRNA在贮藏室中的分布[62] (Hafidh， Čapková and Honys，未发表的数据)及其在转录和翻译水平上的调控[72，73]，以及它与其他家族成员的表达和功能重叠，可能提供一个强大的“备份”，以绕过“缺陷成员”的影响，确保花粉萌发和成功受精。我们目前在蛋白质水平上操纵NTP303的尝试似乎更有效，因此可能对阐明NTP303的精确功能更有帮助(Čapková， personal communication)。

被子植物生殖细胞分裂和精细胞分化保守通路的确定从细胞周期角度的遗传模型

对发育花粉和花粉管从开始到进入胚囊的精子细胞DNA含量的有限研究经常被用作预测细胞周期相关基因表达的基础，特别是CDKs和细胞周期蛋白[5，52，74]。与酵母和哺乳动物一样，植物细胞周期阶段的过渡主要由CDKs与调节周期蛋白亚基的相互作用控制。CDKA基因在整个细胞周期中组成性表达，它们与几个细胞周期蛋白相互作用，调节细胞周期各阶段的过渡，包括拟南芥的生殖细胞周期[75]。植物携带cdka; 1突变有时在生殖细胞分裂中有缺陷，因此不能产生双重受精所必需的两个精细胞[74，76- - - - - -78]。我们最近证明了cdka; 1单个精子在表达精子命运标记方面不受损害，这表明所产生的精子具有能力[47]。有趣的是，产生的单个精子细胞能够使任何一个雌性配子受精，并产生具有单个胚乳或单个胚胎的相同比例的种子[74]。尽管在双受精的存在下发生cdka; 1精细胞，中心细胞不发生核细胞增生，导致胚乳发育受损，最终导致种子流产[74]。这种核聚变的缺乏可能是由于中心细胞和细胞核之间缺乏细胞周期同步性cdka; 1细胞核增生时的精细胞。细胞周期检查点(以及细胞周期进展速率)由一系列抑制蛋白维持，包括视网膜母细胞瘤相关蛋白(RBR)、kip相关蛋白(KRPs)和CDKs活性抑制剂(ICKs)。RBR1在营养细胞和生殖细胞的特化以及细胞增殖和分化的控制中起着至关重要的作用[49]，并且在雄性和雌性配子体中调控多梳抑制复合体2 (PRC2)和甲基转移酶1 (MET1)中具有扩展功能[70]。这些蛋白的活性在翻译后通过磷酸化或蛋白周转、泛素介导的蛋白水解复合物SCF和APC进行调节。有趣的是,apc8突变抑制生殖细胞分裂，而apc8/apc10在莲座叶中表现出内复制拟南芥多效性的形态缺陷，包括小的硅片，卷曲的叶子和异常的系统发育[79]。我们的细胞周期基因GO注释(附加文件)14表S13)和半定量RT-PCR分析(图2)5)，并结合以往有关生殖细胞周期控制的知识[80使我们能够从烟草雄性生殖细胞周期的角度提出一个假设的遗传模型。所提出的模型让人联想到一个生物“时钟”，通过它，雄性和雌性配子同步细胞周期进程，协调配子发生事件，成功受精(图2)6)。它不仅为了解花粉三细胞进化的分子基础提供了基础，而且还为实验模型产生无形三细胞花粉提供了信息丰富的“遗传图谱”，并为目前的体外受精方案产生杂交植物物种提供了启发。因此，了解这一规律可以为植物育种者和保护主义者提供有用的工具，以避免杂交或促进因杂交不育而分离的远亲植物物种的杂交。

在这项研究中，我们生成并验证了转录组谱烟草成熟花粉和生长中的花粉管。我们从功能上证明了三个花粉管表达基因在程序期的完美进展中的作用。我们进一步定义了一个基因子集，其表达在两个以极化尖端生长为特征的组织(即花粉管和根毛)之间重叠。我们提供了额外的证据，表明烟草花粉特异性蛋白NTP303的敲低不会引起明显的表型缺陷，其功能得到相关家族成员的充分支持。此外，我们展示了已知的细胞周期调控因子在烟草雄性配子体中的表达谱，并提出了一个遗传模型，强调单倍体花粉有丝分裂II期间细胞周期进程的调控是花粉双细胞化的基础烟草．

通过公开烟草花粉转录组数据，我们为未来基于转录组的功能研究提供了坚实的参考基准。生成的转录组数据集具有潜力，与其他现有的基因表达谱资源一起，为花粉三细胞进化的未来研究提供基础，花粉三细胞进化在几个被子植物谱系中独立发生。这些数据集还激发了目前体外受精方案的发展和改进，这不仅对植物研究人员而且对育种者和保护主义者都有很大的兴趣。成功的协议将为交叉和产生杂交线路提供机会，否则将面临交叉兼容性障碍。

植物材料和生长条件

野生型烟草(烟草简历。Samsun)用于收集所有下游研究的组织样本。种子在22-25°C的短日照条件下在温室中播种。将根系发育完全的成体植株移栽到地面堆肥的室外温室中，在春夏两季的自然昼夜光周期下生长。整个季节采集花粉粒并监测其发芽率(图2)1）

花粉采集及离体花粉管培养

成熟花粉是无菌分离的，如前所述[81]。花前1天采花。从花中取出雄蕊，放入培养皿中，在室温下在通风柜中过夜。干燥的花粉粒通过尼龙网(Miracloth，孔径50 μm)过滤，称重，在20°C下保存。无论采集时间如何，超过80%的花粉粒都能成功发芽并形成花粉管(图2)1)。

对于离体花粉管萌发，在花粉萌发培养基(SMM: 0.3 M蔗糖，1.6 mM H)中重悬约10 mg/10 mL花粉_3.薄_3.， 3mm Ca(NO_3.）₂4 h₂O, 0.8 mM MgSO₄.7H₂哦，我知道_3.)，然后放入锥形烧瓶中。用添加酪蛋白(1 mg/mL)的SMM培养基培养24 h和48 h的花粉管。培养物在水浴摇床中以140 rpm孵育2 h，然后减速至90 rpm，在26°C黑暗中进行剩余培养时间。其他花粉管培养(13小时、24小时和48小时培养)采用了类似的程序，但在无菌条件下进行。等分样品进行苯胺蓝染色和4′，6-二氨基-2苯基吲哚(DAPI)染色，光镜下分析(图2)1)。在提取RNA之前，将花粉管真空过滤，在液氮中快速冷冻，并在-80°C保存。孢子体组织(叶盘和根)从幼株和出土的成株中均有收集。收集的样品立即在液氮中冷冻。

RNA提取，探针制备和微阵列杂交

按照制造商的说明书(Qiagen, Valencia, CA)使用Qiagen RNeasy Plant Kit分离总RNA，并用DNaseI (Promega)处理。麦迪逊,WI)。RNA的定量使用NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, USA)。装运前，对每个样品的5个重复进行半定量RT-PCR测试，使用两个标记基因(Nt-eIF5A和组成型18S rRNA)进行重复性测试。RNA浓度、纯度和完整性(RIN)使用ImaGenes (Berlin, Germany)的Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Boblingen, Germany)进行评估。用50 ng逆转录总RNA制备生物素化靶RNA (One-Cycle target labelling and control试剂;安捷伦科技)。标记的cRNA片段化，15 μg用于Agilent 44k烟草微阵列杂交。杂交芯片在安捷伦高分辨率微阵列扫描仪上扫描。

Agilent 44k烟草基因组阵列数据的生物信息学和统计分析

所有转录组学数据集使用免费的dChip 1.3软件进行归一化http://www.dchip.org．通过在每个实验中使用重复项，将所有阵列归一化到中位数探针强度水平，以及使用所有阵列的归一化强度计算基于完全匹配模型的基于模型的基因表达值，确保了分析的可靠性和可重复性[82]。对于每个样本，只探测检测调用为“present”和表达式值检测水平为“远高于背景”(布尔标志，双面)的情况t-test)被认为是表达的。

为了确定分位数归一化数据集的质量和阵列之间的相关性，使用CLC Genomics Workbench版本4.5.1 (CLC bio, Aarhus, Denmark)计算平均表达值和相应的表达值p-日志的值₂转换数据。该分析的输出用于使用PCA评估样本之间的相关性，以及独立使用分层聚类。为了观察平均表达水平分布的方差，采用散点图进行样本间两两比较。

使用以下标准统计确定阵列之间差异表达的基因:对于所有过滤的分位数归一化数据集，(1)探针必须具有p-值< 0.05;(2)p-值必须通过FDR校正，以尽量减少错误发现率;(3)绝对表达值(折数变化)±> 3;(4)它们的表达水平必须大于100，远高于背景。所有通过两两比较的基因在附加文件中报告4表S3，附加文件5表S4，附加文件6表S5，附加文件7表S6，附加文件8表S7，附加文件9表S8，以及统计分析结果。

PT4R重叠基因及配子体特异性亚群的基因本体分析

使用g:Profiler进行基因本体术语富集分析http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/和GoToolBoxhttp://gin.univ-mrs.fr/GOToolBox，基因本体数据库，基本上如[83，84]，并应用超几何分布检验，Benjamini和Honchberg进行了修正p-value cut off < 0.05 [20.]。氧化石墨烯术语的分类从“生物过程”、“分子功能”和“细胞活动”三个方面进行了调整p-值< 0.05被认为在分析的基因子集中被过度代表。配子体和孢子体优先表达基因富集的氧化石墨烯项如图所示3 d和3 e．PT4R过度表示的GO类别在附加文件中提供12表S11。

实时定量RT-PCR和半定量RT-PCR分析

用qRT-PCR和半rt - pcr使用相同的RNA池对芯片预测的表达谱进行独立验证。对于每个重复，用DNAseI (Promega)处理总RNA 500 ng，用ImProm-II逆转录酶(Promega)逆转录50 ng。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)在480 LightCycler系统(Roche Diagnostics)中进行实时RT-PCR。使用编码18S rRNA的基因对所有检测基因的表达进行归一化。对于细胞周期和细胞命运基因的半rt -PCR，将生成的cDNA稀释1/10作为模板，进行30个周期的PCR反应。热循环程序如下:95℃下2 min;在95℃下，30秒45次循环;55℃下30 s;72℃下30 s;在72°C下5分钟。 eIF5a was used as a standard control for RNA input. All primers used in these experiments were designed using primer 3 softwarehttp://frodo.wi.mit.edu/primer3/，序列可作为附加文件下载16表S15。

反义介导的选定靶基因敲低

利用ncbi衍生的烟草靶基因序列设计相应的反义和义寡脱氧核苷酸进行功能分析。反义寡核苷酸可通过RNase h介导的mRNA降解、翻译抑制或剪接改变等途径干扰基因功能。85]。每个目标基因的cDNA序列提交到集成DNA技术(IDT)，http://eu.idtdna.com/home/home.aspx)和Soligo S-fold软件http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl计算最优反义寡核苷酸，并分别基于Matveeva规则集和Soligo算法预测最易接近的目标位点。每个基因都设计了两对。用5'-3'硫代修饰(每端各3个碱基，Generi-Biotech, Hradec Králové，捷克共和国)合成反义和正(对照)对应的21聚寡核苷酸。所有寡核苷酸均经opc纯化(寡核苷酸纯化盒)。所使用的反义寡核苷酸序列如下:PD40 (NCBI;BP130384)，义:5'-ACTCCACACACACAGAGCCT-3'，反义:5'-AGGCTCTGTGTGTGTGGAGT-3'， NTP303 (NCBI;X69440)，义:5'-CACCCAATGAAATTAGTCGA-3'，反义:5'-TCGACTAATTTCATTGGGTG-3'， ATRFC1 (NCBI;DW003643)，义:5'-ACGAGTTACGATCAGTCGAC-3'，反义:5'-GTCGACTGATCGTAACTCGT-3'， eIF5a (NCBI;c021663)，义:5'-ACTACATTCGAAGCTCTAGC-3'，反义:5'-GCTAGAGCTTCGAATGTAGT-3'， Cu/Zn超氧化物歧化酶1,CSD1 (NCBI;EB439640)，义:5'-AACGGGACCACATTATAATC-3'，反义:5'-GATTATAATGTGGTCCCGTT-3'。

花粉管脱氧寡核苷酸转染

根据Moutinho等人的研究，将每对正寡核苷酸和反义寡核苷酸分别与Cytofectin (Genlantis, San Diego, CA)混合15、30和50 μM。[27]，至终体积为100 μL。除ATRFC1外，30 μM的浓度对大多数基因都是足够的。花粉管转染后在微滴板上，在27°C黑暗条件下持续摇动(140 rpm)发芽。在微滴板上进行表型的初步筛选;之后，从每个样品中提取等分物进行进一步的显微分析。对于每个测试的基因，包括对照，花粉管在体外有或没有细胞效应素/脱氧寡核苷酸混合物培养4小时，然后在测量长度之前用4%甲醛固定。每个实验进行2次生物重复和3次技术重复，并给出平均值。

显微镜

对于核可视化，DAPI染色溶液(0.1 M磷酸钠，pH 7;用1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.8 mg/ml DAPI染色干燥成熟花粉粒和萌发花粉管[86]。敲除实验时，先用4%多聚甲醛、50 mM PIPES和10%蔗糖固定花粉管，真空浸润5 min，孵育1 h，然后用50 mM PIPES (pH 6.9)洗涤花粉管3次。光学和荧光显微镜采用尼康TE2000-E荧光显微镜(Nikon, Japan)，使用DAPI和GFP滤光片组。采用NIS-Elements AR3.0软件(Nikon instruments, Melville, USA)和Adobe Photoshop进行图像采集和处理，测量花粉管长度http://www.adobe.com．

本文的在线版本提供了以下附加数据。附加数据文件1是本研究生成的完整数据集的表格，其平均归一化表达来自两个生物重复，表达水平“远高于背景”。额外的文件2表S1为配子体特异性表达基因表。附加文件3.表S2，附加文件4表S3，其他文件5表S4，其他文件6表S5，其他文件7表S6，其他文件8:表S7为[1[qh]2] leaves vs MPG [3.] roots/根毛vs MPG [4] leaves vs PT4 [5]根/根毛vs PT4和[6叶与根/根毛分别。额外的文件9表S8为pt4 -根/根毛重叠基因亚群(PT4R)列表。额外的文件10表S9是一个与附加文件类似的列表9表S8与鉴定的拟南芥最接近同源物(PT4R_ATH)。额外的文件11是一个PT4R_ATH基因列表，这些基因被鉴定与拟南芥根毛毛细胞和虚拟蛋白质组重叠。额外的文件12表S11列出了PT4R_ATH和拟南芥根毛毛细胞之间重叠表达的基因的GO术语。额外的文件13表S12是MPG和PT4花粉期表达的细胞周期基因列表。额外的文件14表S13是我们的花粉和花粉管转录组中检测到的DUO1靶基因表。额外的文件15表S14是本研究中使用的所有引物列表。

英里/加仑:

成熟花粉粒开裂

PT:

花粉管

益生元:

soligonucleotides

罗斯福:

错误发现率

走:

术语基因本体。

作者感谢CLC基因组工作人员提供的用于微阵列数据分析的CLC基因组工作台软件的技术支持，感谢Alice Cheung教授(美国马萨诸塞州阿默斯特大学生物化学与分子生物学系)捐赠的pSF3-Lim2aGFP表达系，感谢Martin博士Potocký(捷克布拉格实验植物研究所细胞生物学实验室)提供的转染试剂(Cytofectin)，感谢他们的支持。Karel m ller博士(植物繁殖实验室，实验植物学ASCR研究所，布拉格，捷克共和国)协助进行实时定量RT-PCR, Sheila McCormick教授(植物和微生物生物系，植物基因表达中心，加州大学伯克利分校，奥尔巴尼，美国)进行了建设性的讨论，Amanda Woods博士对手稿进行了批判性阅读和语言修改。这项工作得到了捷克科学基金会(P501/11/P321;P501/11/1462)和捷克共和国教育、青年和体育部(OC10054)。

从属关系

1. 捷克共和国科学院实验植物学研究所花粉生物学实验室，rozvojov263，布拉格6,16502，捷克共和国

   Hafidh, Katarína breznenov， peter Růžička, Jana fecikov， v ra Čapková和David Honys说

2. 捷克布拉格查尔斯大学理学院植物实验生物学系，vini n5，布拉格212844

   大卫弘毅投资

相应的作者

对应到大卫弘毅投资．

作者的贡献

SH和DH设计了这项研究。SH, KB, PR, JF和VC进行了实验。SH和DH分析了数据。SH撰写稿件，由SH、VC、KB和DH进一步编辑。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。

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