面包小麦Aroona近等基因系低分子量谷蛋白等位基因的组成及功能分析

背景

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)对面包小麦的面包品质有重要影响。这些蛋白是由一个多基因家族编码的Glu-A3gydF4y2Ba，Glu-B3gydF4y2Ba和Glu-D3同源第1组染色体短臂上的位点，显示出高等位变异。利用SDS-PAGE、2D-PAGE和LMW-GS基因标记系统对16个Aroona近等基因系(NILs)进行了分析。此外，研究人员还对NILs中LMW-GS等位基因的功能进行了分析，并测定了谷蛋白大聚物的组成、面团特性和平底面包品质参数。

结果

利用LMW-GS基因标记系统，在个体NILs中鉴定出14 ~ 20个LMW-GS基因。在Glu-A3gydF4y2Ba在基因座上，鉴定出2个m型基因和2 ~ 4个i型基因，其等位基因变异在长度和核苷酸序列上表现出高度多态性。的Glu-A3d等位基因具有3个活性基因，数量最多Glu-A3gydF4y2Ba等位基因。在Glu-B3gydF4y2Ba基因座中，2 ~ 3个m型基因和1 ~ 3个s型基因从个体的NILs中鉴定出来。根据s型基因的不同组成，Glu-B3gydF4y2Ba等位基因分为两组，一组含有Glu-B3a，B3b，B3f和B3g，而另一部分则包括Glu-B3c，B3d，B3h和B3i。共鉴定出8个保守基因Glu-D3等位基因除外Glu-D3f。利用蛋白电泳技术检测各NIL中独特活性基因的蛋白产物。在Glu-3等位基因,Glu-A3e无i型LMW-GS基因型在几乎所有品质性状上表现最差。Glu-B3b, B3g和B3i表现出较好的质量参数Glu-B3gydF4y2Ba等位基因，而Glu-B3c含有低表达量s型基因的等位基因对面包品质的影响较差。由于基因的保守Glu-D3轨迹,Glu-D3等位基因对各品质参数的影响无显著差异。

结论

本研究为面包小麦18个LMW-GS等位基因的组成和功能提供了新的认识。i型基因的变异主要促成了植物的高多样性Glu-A3gydF4y2Ba等位基因，以及它们之间的差异Glu-B3gydF4y2Ba等位基因主要来源于s型基因的高多态性。在LMW-GS等位基因中，Glu-A3e和Glu-B3c代表制作面包品质较差的等位基因Glu-A3d，Glu-B3b，Glu-B3g和Glu-B3i与优异的面包品质相关。Glu-D3等位基因对面包小麦品质变异的影响较小。因此，LMW-GS等位基因不仅影响面团的延展性，而且对面团的抗性、谷蛋白大分子聚合物和面包品质也有很大的影响。

面包小麦中麸质蛋白所赋予的独特粘弹性是为世界上很大一部分人口生产各种食品的灵活加工品质的基础。面筋蛋白，也被称为脯蛋白，根据在酒精/水混合物中的溶解度不同，通常分为麦胶蛋白和谷蛋白[1]。麦胶蛋白通常是单体蛋白，根据其在低pH下的电泳迁移率分为α/β-、γ-和ω-麦胶蛋白三大类。2]。谷蛋白形成由链间二硫键稳定的聚合蛋白。根据分子量的不同，谷蛋白可分为高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)两类[2，3.]。根据其在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的迁移率，LMW-GS进一步分为B、C和d基亚基[4]。

在面包小麦中，HMW-GS是由同源基因编码的Glu-1染色体长臂上的位点1，1 b和1 d（Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1）.每个位点具有两个同源基因，分别编码一个x型亚基和一个y型亚基[5]。LMW-GS基因位于Glu-A3gydF4y2Ba，Glu-B3gydF4y2Ba和Glu-D31组染色体短臂上的位点。LMW-GS基因Glu-3和麦胶蛋白基因在Gli-1基因座紧密相连，形成基因簇，覆盖数个器官[6- - - - - -8]。此外，与HMW-GS的简单组成不同，LMW-GS是由一个复杂的多基因家族编码的，没有确切的基因数量信息[9，10]。基因数量多，等位基因变异丰富Glu-3由于LMW-GS基因与麦胶蛋白基因的紧密连锁关系，使得对LMW-GS基因在面包小麦中的组成和功能的研究变得困难。4]。

SDS-PAGE被广泛用于研究面包小麦中丰富的种子贮藏蛋白。根据SDS-PAGE凝胶中蛋白质的迁移率，将全种子蛋白分为四组:HMW-GS、D-group、B-group和C-group。d组蛋白主要由ω-麦胶蛋白组成，b组主要由lw - gs蛋白组成，c组由α、β、γ型麦胶蛋白和几种lw - gs蛋白组成[4]。基于不同的电泳模式，LMW-GS蛋白等位基因编码的Glu-3基因座按字母顺序指定(例如:Glu-A3a) [11]。然而，由于利用SDS-PAGE测定低分子量- gs等位基因需要大量的经验，因此在育种计划中鉴定低分子量- gs的组成仍然是一个重大的挑战。这就是为什么LMW-GS等位基因的功能没有很好地表征。基因特异性标记Glu-A3gydF4y2Ba和Glu-B3gydF4y2Ba对不同的LMW-GS等位基因进行鉴定。然而，分子标记Glu-D3由于等位基因之间的微小差异，等位基因仍然不可用[12- - - - - -17]。利用BAC文库筛选和蛋白质组学方法，研究了Norin 61 (Glu-A3d，Glu-B3i和Glu-D3c)、格伦利(Glu-A3g，Glu-B3g和Glu-D3c)及小燕54 (Glu-A3d，Glu-B3d和Glu-D3c)被识别和表征[10，18- - - - - -20.]。这些研究极大地提高了我们对面包小麦中不同LMW-GS等位基因编码的独特基因的认识。近年来，基于lw - gs基因的保守性和多态性结构，我们建立了lw - gs基因标记系统和全长基因克隆方法[21，22]。它们成功地用于在单个小麦品种中鉴定和表征超过16个LMW-GS基因[21]。这两种方法都有助于阐明的组成Glu-3面包小麦LMW-GS基因中的等位基因。

研究谷蛋白等位基因对面团性状和加工品质的影响主要集中在两类群体中:双亲本杂交获得的结构群体(如重组自交系和双单倍体系)和非结构群体(一般品种和选育系)。由于HMW-GS等位基因变体的组成简单且易于鉴定，HMW-GS对面团性能和最终使用质量的贡献得到了很好的研究并广泛应用于育种计划[qh]23]。然而，仅靠低分子量- gs不能解释小麦品种间的品质差异，因为低分子量- gs也对面团性质有影响[24- - - - - -31]。例如，LMW-GS等位基因对面团延展性的贡献略大于HMW-GS [32，33]。与HMW-GS相比，LMW-GS形成了高度多态性的蛋白复合物，并含有丰富的等位基因变异。利用SDS-PAGE和等位基因特异性引物，从小麦采集和结构群体中鉴定出LMW-GS等位基因，并对其对加工品质的影响进行了分析和探讨。然而，关于不同种类的种群或集合，争议是常见的。例如Cane等人。[34]和Eagles等人。[33报道说Glu-A3e与较差的面团抗性和延伸性相关，而Zheng等[35表明Glu-A3e是和面特性的有利等位基因。由于LMW-GS等位基因的复杂组成和SDS-PAGE凝胶中LMW-GS与麦胶蛋白的难以区分，LMW-GS等位基因功能差异背后的分子遗传机制尚未得到很好的研究。

在本研究中，一组近等基因系(NILs)包含五个Glu-A3gydF4y2Ba等位基因,八Glu-B3gydF4y2Ba等位基因和5个Glu-D3研究了LMW-GS对面食中谷蛋白大聚合物(GMP)组成、面团性能及面食质量的影响。利用SDS-PAGE、LMW-GS基因标记系统和二维凝胶电泳(2D-PAGE)对这些NILs进行了研究，确定了LMW-GS基因和每个等位基因的蛋白质组成，并分析了它们与面团性能和面包品质的关系。

利用SDS-PAGE分离Aroona NILs中的LMW-GS蛋白

用SDS-PAGE对16个arooona NILs的面粉中的谷蛋白等位基因进行了分离(图2)1a). Aroona具有5个HMW-GS蛋白，分别为1、7 + 9和2 + 12，由at基因编码Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1位点,分别。所有NILs与Aroona具有相同的HMW-GS，其独特的LMW-GS和醇溶蛋白带如图所示1四。Glu-A3gydF4y2Ba来自Aroona()的NILs在b族区域具有独特的LMW-GS波段。Glu-A3c）.Aroona -Glu-A3d和Aroona -Glu-A3e也含有特定的麦胶蛋白带(图2)1a)Glu-B3gydF4y2Ba尼尔斯，阿鲁纳(Glu-B3b), Aroona -Glu-B3a，B3f和B3g有相似的b组蛋白，而Aroona-Glu-B3c，B3d，B3h和B3i显示了另一组电泳模式(图2)1a).在后四个NILs中，Aroona-Glu-B3cb组LMW-GS蛋白含量最低(附加文件)1:图S1)，尤其是分子量最大的蛋白。四个Glu-D3NILs和Aroona具有相同的b组LMW-GS蛋白(图1)1a)。Aroona -Glu-D3b和D3d具有相同的蛋白带，并含有一个独特的来自Aroona的LMW-GS。除一种麦胶蛋白外，Aroona- 1的电泳图谱为Glu-D3a和阿鲁娜的一样吗Glu-D3b和D3d。Aroona -Glu-D3f在c群区产生的蛋白质模式与其他的完全不同Glu-D3尼尔斯。一般来说,Glu-3基因座与Gli-1位点(6- - - - - -8]，而且很难通过传统杂交中的基因重组来打破这种联系。因此,每个Glu-3NIL不仅具有独特的LMW-GS，而且含有1或2种特异性的醇溶蛋白。

为了分析Aroona NILs中编码lw - gs等位基因的基因，我们使用先前开发的lw - gs基因标记系统对16个Aroona NILs进行了研究，该系统可有效分离面包小麦中的lw - gs基因(图2)2;表1) [21，22]。在Aroona中鉴定出18个LMW-GS基因，其中4个Glu-A3gydF4y2Ba基因(a3 - 391，a3 - 400，a3 - 502 - 2和a3 - 620),四个Glu-B3gydF4y2Ba基因(b3 - 530 - 2，b3 - 578，b3 - 607和b3 - 621 - 1)和8Glu-D3基因(d3 - 385，d3 - 393，d3 - 394，d3 - 432，d3 - 528，d3 - 575，d3 - 578 - 1和d3 - 591)(表1）.另外两个与DNA片段388和410对应的新基因出现在所有16个品系中(表2)1)是在CDS区域具有过早终止密码子的假基因。在16个Aroona NILs中，Aroona-Glu-D3f具有14个独特基因，其中LMW-GS基因数量最少Glu-A3dLMW-GS基因最多(20个)。NILs中lw - gs基因的比较表明，每个NIL与Aroona只有一个差异Glu-3轨迹。借助Aroona NILs和其他一些小麦品种的完整基因序列[10，13，14，17- - - - - -19，21]，对每个Aroona NIL中LMW-GS基因的组成进行了很好的表征。

为Glu-A3gydF4y2Ba等位基因4 ~ 6个。Glu-A3c)和四Glu-A3gydF4y2Ba尼尔斯(表1;图2）.除了阿鲁娜Glu-A3d，这些NILs具有LMW-GS基因a3 - 391和a3 - 400(表1;图2)，是带有过早终止密码子的m型假基因。其他基因为i型基因。的a3 - 502基因包含4个具有独特snp和indel的等位变异，即a3 - 502 - 1，a3 - 502 - 2，a3 - 502 - 3和a3 - 502 - 4。所有a3 - 502等位基因变异和a3 - 640基因为假基因，在编码序列中含有过早终止密码子。i型基因，a3 - 643，a3 - 620，a3 - 646和a3 - 573，是Aroona-中仅有的活性基因Glu-A3b，A3c，A3e和A3f,分别。序列比对表明a3 - 620和a3 - 643具有较高的同一性(> 99%)，仅在一个InDel和一个SNP上存在差异a3 - 573和a3 - 646与其他i型基因差异很大(附加文件1:图S2)。A3-573比其他i型蛋白短得多，这是由于在重复区域缺失了3个重复单元和几个谷氨酰胺残基，并且在c端结构域缺乏GTFLQPH1:图S2)。Aroona -Glu-A3d含有6个独特的LMW-GS基因(表2)1;图2）.对于两个m型基因，a3 - 370是假基因，然而a3 - 402包含一个完整的编码序列，可以在发育中的颗粒中表达[18]。另外四个基因，a3 - 484，a3 - 565，a3 - 568和a3 - 662是i型基因吗a3 - 568和a3 - 662是活跃的。与其他i型基因相比，这两个基因在c端结构域中都含有独特的snp，并且重复区域的长度不同(附加文件)1:图S2)。因此，与只有一个LMW-GS基因在另一个中表达相比Glu-A3gydF4y2Ba等位基因,Glu-A3d含有3个活性基因，1个m型(a3 - 402)及两个i型(a3 - 568和a3 - 662) LMW-GS基因。除了a3 - 402的活性基因Glu-A3gydF4y2Ba位点为i型基因。这些i型基因编码b组LMW-GS，在b组区域产生不同的电泳模式Glu-A3gydF4y2Ba尼尔斯(图1）.

为Glu-B3gydF4y2Ba等位基因中，3-5个LMW-GS基因被鉴定出来。Glu-B3b)和七Glu-B3gydF4y2Ba尼尔斯。基因b3 - 530存在于所有的Aroona NILs和4个等位基因变体(b3 - 530 - 1，2，3和b3 - 510)进行了鉴定(表1)1）.序列比对表明，推导出的3种蛋白序列b3 - 530等位基因变异仅在4个氨基酸上不同，而B3-510包含重复结构域的缺失，与B3-530蛋白不同7个氨基酸(附加文件)1:图S3)。b3 - 544，b3 - 593，b3 - 601和b3 - 607是等位基因变体，具有99%以上的同一性，其推断的蛋白质序列仅在重复区域不同，删除了谷氨酰胺残基或一个重复单元(附加文件1:图S4)。b3 - 621 - 1，b3 - 621 - 2和b3 - 624基因高度保守，它们的蛋白质仅在重复区域的谷氨酰胺残基的一个InDel和C端区域的一个氨基酸上存在差异(附加文件)1:图5)。的b3 - 688吉恩很与众不同，不同于b3 - 621和b3 - 624在几个snp和InDels(附加文件)中1:图5)。此外,b3 - 688在阿鲁纳各有不同-Glu-B3c，B3d，B3h和B3i，蛋白质产品在7个氨基酸和2个InDels上存在差异(附加文件)1:图5)。在Glu-B3gydF4y2Ba的基因,b3 - 548，b3 - 578和b3 - 813为假基因，含有过早终止密码子，而其他基因含有完整的orf(开放阅读框)。序列分析表明b3 - 530，b3 - 510，b3 - 548和b3 - 570是m型基因，其余为s型基因。基于s型基因的差异，Glu-B3gydF4y2BaNILs分为两组。Aroona -Glu-B3a，B3b，B3f和B3g包含b3 - 578，b3 - 544/593/601/607,b3 - 621/624其他人的基因序列更长，b3 - 688和b3 - 691/813/零(表1）.这种分类与两组不同的电泳模式相一致(图2)1一个)。

Aroona -Glu-B3a，B3b，B3f和B3g具有相似的LMW-GS组成，但它们各自具有独特的等位基因变体(表1;图2）.Aroona -Glu-B3f和B3g包含B3-530-3，但它们的不同之处在于b3 - 544，b3 - 601，b3 - 621 - 1和b3 - 621-2基因(表1;额外的文件1:图S4和S5)。Aroona -Glu-B3f和阿鲁纳(Glu-B3b)分享相同的b3 - 621 - 1，但拥有不同的基因b3 - 601/b3 - 530 - 3和b3 - 607/b3 - 530 - 2，分别(表1;额外的文件1:图S3及S4)。另一方面，阿鲁纳Glu-B3c，B3d，B3h,B3i活性基因及其等位基因变异也存在差异。Aroona -Glu-B3c和B3d含有B3-530-1，但它们的B3-688蛋白在5个氨基酸上存在差异(表2)1;额外的文件1:图5)。Aroona -Glu-B3i是独一无二的，含有4个活性LMW-GS基因b3 - 510，b3 - 570，b3 - 688 - 4和b3 - 691(表1;图2）.b3 - 570只出现在Glu-B3i编码n端结构域METSQIPGLEKPS的m型LMW-GS。虽然b3 - 688 - 4和b3 - 691不同的基因，他们有99%的相同之处b3 - 691这是第一次正式报道。

在Glu-D3位点上，除Aroona-外，从个体NILs中鉴定出8个基因Glu-D3f(表1）.d3 - 393和d3 - 583/586/591有过早终止密码子。所有其他基因都被广泛报道并在发育中的谷物中表达[10，17，18，20.]。d3 - 385，d3 - 394和d3 - 575在阿鲁纳的NILs中很受欢迎。d3 - 432和d3 - 441同源性超过99%的等位变异，仅在两个snp和两个indel上存在差异。等位基因变异d3 - 525和d3 - 528都是一样的，除了一个InDel。两个等位基因变体，d3 - 578 - 1和d3 - 578 - 2差异8个snp(表1)1）.与主动的Glu-D3阿鲁纳基因(Glu-D3c)，d3 - 441和d3 - 578 - 2出现在阿鲁纳Glu-D3b和D3d，具有相同的活性LMW-GS基因(表2)1;图2）.除了d3 - 441和d3 - 578 - 2Aroona -Glu-D3a含有独特基因d3 - 525与阿鲁纳形成鲜明对比。Aroona -Glu-D3f，仅鉴定出4个LMW-GS基因;其他四个基因可能由于缺失、替代或其他突变而缺失(表2)1;图2）.

每个Aroona NIL具有独特的LMW-GS等位基因。对这些LMW-GS等位基因的基因组成进行了解剖，对所有LMW-GS基因序列进行了表征，并推导出蛋白序列(表1)1;图2）.基于推导出的LMW-GS的大小以及小燕54、京411和诺林61的LMW-GS 2D-PAGE斑点的大小[18，19]， LMW-GS基因在SDS-PAGE凝胶中被分配到蛋白带上(图2)1b)Glu-A3gydF4y2Ba位点，所有活跃的基因Glu-B3gydF4y2Ba基因d3 - 525/528，d3 - 575和d3 - 578在Glu-D3编码b组LMW-GS，而其他活性基因的蛋白产物属于c组。此外,B3-621/624，B3-593/601/607，d3 - 575和d3 - 578编码分子量相近的蛋白(38-40 kDa)，并在SDS-PAGE上同步运行，形成Aroona-中最厚的蛋白带Glu-B3a，B3b和B3f。b3 - 688编码最长蛋白质的基因赋予了arooona -独特的蛋白质模式GluB3d，B3h和B3i。(图1）.

SDS-PAGE和LMW-GS标记系统的数据显示Glu-3等位基因含有几个独特的LMW-GS和麦胶蛋白基因。为了分析单个NILs中LMW-GS和麦胶蛋白的组成，我们对整个面粉蛋白进行了2D-PAGE分析(图2)3.，4和5）.在之前的研究中，利用2D-PAGE结合MS或n端测序技术，成功鉴定了Xiaoyan 54、Jing 411、Norin 61和Butte 86中的LMW-GS蛋白[18，19，36]。这些数据极大地促进了Aroona NILs中面粉蛋白的鉴定。

在五Glu-A3gydF4y2Ba尼尔斯,Aroona -Glu-A3b和阿鲁纳(Glu-A3c)具有相同的蛋白质模式，除了一个麦胶蛋白点，这与LMW-GS基因的相似组成和LMW-GS基因的高同源性是一致的a3 - 620和a3 - 643(图3.a).与Aroona相比，Aroona-Glu-A3d含有3个独特的LMW-GS, A3-402, A3-568和A3-662，缺少两个醇溶蛋白点(图2)3.a).对于Aroona-Glu-A3e是独特的i型基因的蛋白质产物a3 - 646太少而无法检测到，但在2D-PAGE中存在三个独特的麦胶蛋白点(图3 b）.Aroona -Glu-A3f也含有一个独特的i型蛋白(A3-573)和一个不同于Aroona的麦胶蛋白点(图1)3.b).因此，伴随个体独特的LMW-GSsGlu-A3gydF4y2BaNILs，一般为1-2个醇溶蛋白点。唯一的例外是阿鲁纳Glu-A3e其中i型LMW-GS的数量最多，而i型LMW-GS的数量最少(没有)Glu-A3gydF4y2Ba尼尔斯(图3.b)。

在八Glu-B3gydF4y2Ba尼尔斯,Aroona -Glu-B3c，B3d，B3h和B3i在2D-PAGE上具有相似的蛋白质斑点模式，与它们在SDS-PAGE上相似的电泳模式一致(图2)1一个和4）.与黄颡鱼蛋白斑点模式比较Glu-B3b), Aroona -Glu-B3c，B3d，B3h和B3i含有独特的B3-688蛋白(图2)4）.b_3 -688蛋白斑点Glu-B3c比其他三个NILs弱得多(附加文件1:图S6)。除了LMW-GS蛋白外，在4个NILs中只发现了1 - 2个小的麦胶蛋白位点差异(图2)4）.其他三个Aroona NILs(即，Aroona-Glu-B3a，B3f和B3g)的蛋白质斑点模式与阿鲁纳(Glu-B3b;图4）.在这四个NILs中，在Aroona-中检测到一个独特的LMW-GS蛋白B3-544Glu-B3g，而其他三个等位基因共享相同的LMW-GS蛋白斑点模式(图2)4）.因此，Aroona和seven的2D-PAGE模式Glu-B3gydF4y2BaNILs提示它们的不同蛋白主要是LMW-GS特有的蛋白，而不是麦胶蛋白。

为Glu-D3NILs是由d3 - 441阿鲁纳基因Glu-D3a，D3b和D3d比其在Aroona的等位变异D3-432的分子量和pi更大(图5）.其中未检测到其他不同的LMW-GS点Glu-D3尼尔斯和阿鲁纳Glu-D3a和D3d，每个只包含一个独特的麦胶蛋白点(图2)5）.Aroona -Glu-D3f等位基因是唯一的，缺少两个lw - gs蛋白(即D3-385和D3-441)和至少三个中等醇溶蛋白点(图3)5）.利用LMW-GS基因标记系统也观察到4个LMW-GS基因的缺失(表2)1）.因此，除了Aroona-Glu-D3f，其中只检测到一个或两个不同的蛋白点Glu-D3NILs，以及由基因编码的蛋白质Glu-D3基因座高度保守。

在Aroona NILs上测量了面团的zeleni -沉降值(ZSV)、Farinograph和Extensograph参数、GMP参数和pan bread质量参数(表1)2）.16个基因型差异显著(P< 0.05或P< 0.01)，表明基因型对小麦品质性状变异有重要影响2:表1)。在一些参数(如核蛋白，ZSV, Farinograph吸水率，谷蛋白和麦胶蛋白含量，以及外部面包的颜色和结构)也观察到显著差异在两个位置之间(附加文件)2:表1)。然而，除了面包的外观颜色和Farinograph显影时间外，大多数品质参数在基因型和位置之间没有检测到显著的交互作用2:表1)。在每个NILs中对所有质量参数进行方差分析(ANOVA)和多重比较Glu-3组(表2、附加文件2(表S2、S3和S4)。

方差分析显示Glu-A3gydF4y2BaNILs在大多数质量参数上存在显著差异(表2)2）.这表明Glu-A3gydF4y2Ba等位基因影响面包小麦的制面包品质。随后的多次比较表明，Aroona-Glu-A3eZSV、Farinograph stability time (ST)、Extensograph maximum resistance (Rmax)、Extensograph extensibility (Ext)、sds -不可提取部分占总聚合蛋白的百分比(%UPP)、pan bread总分(PBTS)等质量参数均为最差Glu-A3gydF4y2BaNILs对Rmax、ST、%UPP和Ext具有相似的值(图2)6）.尽管Aroona -Glu-A3d有最大的ZSV，它只显示中度的PBTS(图6）.

Glu-B3gydF4y2BaNILs在最重要的质量参数上存在较大差异(表2)2)，表明Glu-B3gydF4y2Ba等位基因也与面包制作质量显著相关。在八Glu-B3gydF4y2Ba尼尔斯,Aroona -Glu-B3g产生最高的PBTS, ZSV, ST, Rmax， %UPP和其他一些参数(图2)6、附加文件2(表S2、S3和S4)。类似地，阿鲁纳(Glu-B3b)和阿鲁纳Glu-B3i是否有更高的质量参数Glu-B3gydF4y2BaNILs，不包括AroonaGlu-B3g。相比之下，Aroona-Glu-B3c在ZSV, ST, Rmax， %UPP, PBTS和其他一些参数中表现最低(图2)6;额外的文件2:表S2、S3和S4)，表明Glu-B3c是影响面包质量的不良等位基因。另一个Glu-B3gydF4y2Ba尼尔斯(Aroona -Glu-B3a，B3d，B3f和B3h)具有相似的中等质量参数，无显著差异。

五个Glu-D3NILs产生了类似的质量参数，没有显著差异，除了Farinograph吸水率和麦胶蛋白与谷蛋白的比例(表2)2）.这与LMW-GS基因和蛋白的相似组成是一致的Glu-D3尼尔斯。

本研究采用SDS-PAGE、2D-PAGE和lw - gs基因分子标记系统对16个arooona NILs中的lw - gs基因和蛋白进行了鉴定。每个NIL包含一个独特的LMW-GS等位基因。分析LMW-GS各等位基因的遗传和蛋白质组成。此外，我们还利用这些NILs分析了LMW-GS等位基因在面包品质方面的功能差异。在分析LMW-GS基因和蛋白的基础上，探讨了这些功能差异的分子机制。

SDS-PAGE是一种准确鉴定面包小麦中HMW-GS的有效方法，但对于分离LMW-GS等位基因效率不高，因为存在大量的LMW-GS蛋白，它们彼此之间以及与麦胶蛋白的迁移率相似(图2)1b).在本研究中，LMW-GS基因标记系统成功地从每个NIL中分离出14-20个LMW-GS，并区分出16个Glu-3尼尔斯，除了阿鲁纳Glu-B3c和B3d没有长度多态性b3 - 688 - 1和b3 - 688 - 2(表1;图2）.这些结果表明，lw - gs基因标记系统不仅在分离lw - gs基因家族成员方面是有效和准确的[21]，但也在区分个体LMW-GS基因的等位变异。近年来，等位基因特异性标记被广泛用于鉴别Glu-A3gydF4y2Ba和Glu-B3gydF4y2Ba等位基因(12- - - - - -14]。然而，其中的高守恒Glu-D3等位基因变异使得开发等位基因特异性标记来区分不同的等位基因变异变得困难。由于这些等位基因变异在长度上表现出DNA序列多态性，LMW-GS基因标记系统可以很好地解剖复杂基因和等位基因变异Glu-D3轨迹(表1）.另一方面，与用基因特异性引物鉴定的单个等位基因中只有一个基因相比[13，14，几乎所有的基因都在Glu-3使用LMW-GS基因标记系统显示等位基因(表2)1）.鉴定每个等位基因中的所有基因将极大地有助于理解决定功能差异的分子机制Glu-3面包小麦中的等位基因。

在本研究中，Aroona及其NILs含有大部分的Glu-3合作项目中全球小麦种质的等位基因变异鉴定[j]12]。每个LMW-GS等位基因由几个连锁基因或单倍型编码[13，14，16，17，21，22]。Aroona NILs中LMW-GS基因的分离将为普通小麦LMW-GS基因的单倍型分析提供便利。在Glu-A3gydF4y2Ba位点上，除2个m型基因外，还鉴定出2-4个i型基因Glu-A3gydF4y2Ba等位基因。与保守的m型基因不同，i型基因在5个等位基因中完全不同。这些i型基因可能紧密相连，在每个基因中形成独特的单倍型Glu-A3gydF4y2Ba等位基因。a3 - 484/a3 - 565/a3 - 568/a3 - 662在Glu-A3d(表1) [13，18，19，21]。在Glu-B3gydF4y2Ba位点上，1-2个m型基因和1-3个s型基因在单个等位基因上有明显的特征。一般来说，这些s型基因可以分为两类，一类含有b3 - 578/b3 - 544/593/601/607/b3 - 621/624，另一个b3 - 688/b3 - 691/813/N(表1,图2）.这些s型基因可能在面包小麦中共分离并形成独特的单倍型[14]。在m型基因的四个等位变异中b3 - 530，b3 - 530 - 2都出现在阿鲁纳(Glu-B3b)和阿鲁纳Glu-B3h，包含不同的s型单倍型b3 - 578/b3 - 607/b3 - 621 - 1和b3 - 688/b3 - 813,分别。因此，在Glu-B3gydF4y2Ba位点，m型和s型基因似乎没有紧密连接(表2)1;图2) [6，18]。所有的Glu-D3等位基因除了Glu-D3f含有8个LMW-GS基因(表2)1）.只有一个或两个等位变异(d3 - 432/441，d3 - 525/528和d3 - 578 - 1/2在LMW-GS等位基因变异中只检测到少量snp。因此,Glu-D3小麦品种间基因高度保守[16，17), whereaseGlu-A3gydF4y2Ba和Glu-B3gydF4y2Ba基因多样性较高，分别来源于i型和s型基因的多个等位基因变异。

为了分析lw - gs NILs之间种子贮藏蛋白的差异，使用2D-PAGE显示了面粉蛋白(图2)3.，4和5）.LMW-GS蛋白具有一些相似的特征，如大部分位于b组区域，pi大于醇溶蛋白。虽然很难在2D-PAGE中检测到每个蛋白点的分子量和数量的微小变化，但每个蛋白点的种子储存蛋白的组成和等位基因变化Glu-3成功地对等位基因进行了表征。这些结果与用LC-MS或n端测序鉴定的小燕54、京411、Norin 61、Butte 86等品种的2D蛋白图谱一致[18，19，36]。例如，Glu-A3d和Glu-B3d等位基因在i型(A3-568和A3-662)和s型(B3-688)蛋白上的电泳模式分别与小燕54和Norin 61相似[18，19),而Glu-B3g与Glenlea [19]。此外，对比2D-PAGE图谱显示，除了不同的lw - gs蛋白外，每个Aroona NILs中只存在1-3个独特的小麦胶蛋白点(图2)3.，4和5）.这些结果表明，Aroona NILs之间的差异主要来源于LMW-GS基因的等位基因变异。

研究了低分子w - gs对面饼性能、GMP参数及面饼质量参数的影响。结果表明，LMW-GS在小麦品质性状变异中起着重要的决定作用。三者之中Glu-3等位基因位点,Glu-A3gydF4y2Ba和Glu-B3gydF4y2Ba在确定NILs之间的加工质量差异方面具有重要意义(表2）.

Glu-A3gydF4y2Ba等位基因

在五Glu-A3gydF4y2Ba等位基因,Glu-A3e（a3 - 391，a3 - 400，a3 - 502 - 3和a3 - 646)在几乎所有质量属性中表现最差(表1)1,图6;额外的文件2(表S2、S3和S4)。这与以前的报告一致，其中Glu-A3e与较低的可扩展性和Rmax相关Glu-A3d，A3b和A3c［33]。的负面影响Glu-A3e关于面团流变特性的研究在之前的一些研究中有报道[24，33，37，38]。未检测到独特的i型蛋白条带Glu-A3e使用SDS-PAGE分析等位基因(图1) (39]。蛋白质的产物a3 - 646在2D-PAGE中也未发现i型基因a3 - 646Aroona -Glu-A3e包含完整的ORF(图2)3.b、附加文件1:图S2)。i型蛋白少，麦胶蛋白多Glu-A3e增加了麦胶蛋白与谷蛋白的比例，大大降低了%UPP(图2)6;额外的文件2:表S4)，导致性能最差的Glu-A3e面团抗伸性基因型与平底面包总分[j]39]。另一个Glu-A3gydF4y2BaNILs产生类似的质量参数，包括Rmax、ST、Ext和%UPP。这些数据表明Glu-A3a，A3c，A3d和A3f所有这些都对UPP含量、面团阻力和延伸性有相当的积极影响(图2)6）.其中,Glu-A3d对高ZSV有显著影响，这与消炎54和粳411 RILs的结果一致[18]。其他一些研究也报告说Glu-A3d等位基因对面团强度有显著影响[40- - - - - -42]。与只有一个活性基因相比Glu-A3gydF4y2Ba其他等位基因的位点Glu-A3d等位基因具有3个活性LMW-GS基因，产生最高的ZSV、Rmax和%UPP(图2)6）.大量的活性基因Glu-A3d可能是小麦品质性状优越的基础[18]。

Glu-B3gydF4y2Ba等位基因

我们的研究证实了Glu-B3gydF4y2Ba面包小麦品种品质变异的基因座分析。在八Glu-B3gydF4y2Ba等位基因,Glu-B3c（b3 - 530 - 1，b3 - 548和b3 - 688 - 1)产生了最低质量参数，包括ZSV、ST、Rmax、%UPP和PBTS(图2)6）.的不良影响Glu-B3c等位基因在以前的研究中也有报道[24，33，43，44]。Glu-B3c和Glu-B3d（b3 - 530 - 1，b3 - 548和b3 - 688 - 2)具有相同的LMW-GS组成，除了B3-688-1和B3-688-2之间有5个氨基酸差异(表2)1;图2、附加文件1:图S5)，但产生了显著不同的Rmax和ZSV(图S5)6）.b3 - 688 - 2似乎比b3 - 688 - 1。另一方面，Glu-B3c和Glu-B3h（b3 - 530 - 2，b3 - 548, b3 - 688 - 3和b3 - 813)也含有类似的活性LMW-GS基因，并且在基因组中只有少数snpb3 - 530和b3 - 688等位基因变异，但是Glu-B3h对PBTS和ZSV的积极作用明显大于Glu-B3c(图6）.2D-PAGE显示了这一点Glu-B3cb83 -688-1蛋白含量低于Glu-B3d和B3h(图4、附加文件1:图S6)。这表明在b3 - 688 - 1可能导致表达较低或翻译和聚合困难。少量的b83 -688-1可能直接导致麦胶蛋白与谷蛋白的比值较高，而UPP %较低Glu-B3c等位基因，最终导致其对小麦品质的不良影响(附加文件)2(表S2、S3和S4)。与三个人中两个活跃的基因相比Glu-B3gydF4y2Ba等位基因,Glu-B3i含有4个活性基因，m型单倍型b3 - 510/b3 - 570s型单倍型b3 - 688/b3 - 691。这两种单倍型在4个等位基因中提供了最多的活性基因，并导致了最好的品质性能[18]。

的Glu-B3a，B3b，B3f和B3g等位基因属于同一组s型单倍型。它们具有相似的电泳模式，并且各自具有3个活性LMW-GS基因，但对品质特性的影响有显著差异(图2)6）.Glu-B3g（b3 - 530 - 3，b3 - 548，b3 - 544和b3 - 621 - 2)产生了最佳质量参数，包括ZSV、Rmax、ST、%UPP、LV和PBTS(图2)6)，与先前的报告一致[40，42，45]。Glu-B3b（b3 - 530 - 2，b3 - 548，b3 - 607和b3 - 621 - 1)对大多数质量参数也有积极影响(图2)6)，再次与之前的研究相一致[46，47]。SE-HPLC参数分析表明，醇溶蛋白含量低，UPP含量高可能是其性能优越的主要原因Glu-B3b和B3g(图6;额外的文件2:表S4)。UPP的高含量可能来源于三个活性基因的核苷酸序列中的snp或indel (b3 - 530 - 2/3.，b3 - 544/ 607和b3 - 621 - 1/2)，这增强了蛋白质产物形成大的谷蛋白高分子聚合物的能力。通过比较，获得了更多的证据Glu-B3f和Glu-B3g。两个等位基因都含有相同的m型基因，b3 - 530 - 3但在ZSV、ST、UPP和PBTS中存在不同的s型单倍型，且差异显著。s型单倍型b3 - 578/b3 - 544/b3 - 621 - 2形成更多的UPP，生产出更好的面包品质b3 - 578/b3 - 601/b3 - 621 - 1。

Glu-D3等位基因

五个Glu-D3在本研究中，等位基因对几乎所有的品质特性都产生了相似的值(图2)6;表2)，这证实了此前的报道Glu-D3等位基因在大量小麦品种中产生相似的Rmax和可扩展性[24，33，48]，尽管一些研究表明了不同的效果Glu-D3影响面团强度或混合性能的等位基因[27，29，38，49]。Glu-D3a，D3b，D3c和D3d具有相似的2D-PAGE斑点模式，6个活性基因在等位基因间高度保守(一致性> 99%)。它们在LMW-GS基因和全蛋白上的相似性与它们在所有品质性状上的等效效应是一致的。虽然Glu-D3f该等位基因缺乏2个LMW-GS蛋白和3个麦胶蛋白点，其质量特性与另一个相似Glu-D3等位基因(图5;表2）.这些结果表明d3 - 385，d3 - 432三种缺失的麦胶蛋白与质量改善无关。然而，缺乏活性基因d3 - 394和d3 - 528在Glu-D3京411位点(Glu-D3l)对ZSV有显著的负面影响[18]。因此，除了Glu-D3l，Glu-D3等位基因对面包用小麦品种品质变异的影响较小，在小麦面包品质改良的选择中应优先考虑LMW-GS等位基因。

在本研究中，我们分析了16个LMW-GS NILs的遗传和蛋白质组成，测量了单个NILs的面团特性和面包品质特性，并对每个等位基因进行了功能分析。在五Glu-A3gydF4y2Ba等位基因,Glu-A3e(i类型单体型a3 - 502 - 3/a3 - 646)较差，对所有质量特性都有负面影响。在八Glu-B3gydF4y2Ba等位基因,Glu-B3b(斜基因b3 - 530 - 2s型单倍型b3 - 578/b3 - 607/b3 - 621 - 1)，Glu-B3g(斜基因b3 - 530 - 3s型单倍型b3 - 578/b3 - 544/b3 - 621 - 2)和Glu-B3i(斜单体型b3 - 510/b3 - 570s型单倍型b3 - 688 - 4/b3 - 691)与优异的面包品质相关，而Glu-B3c(斜基因b3 - 530 - 1s型单倍型b3 - 688 - 1/N)生产劣质产品。在五Glu-D3在等位基因方面，本研究测量的所有质量参数均无显著差异。此外，所有具有优异面团性能和锅面包品质的等位基因也具有较高的UPP和%UPP含量。因此，LMW-GS等位基因可能通过改变谷蛋白聚合物的大小分布和谷蛋白的聚集特性来决定面团的粘弹性[50]。这些结果大大提高了我们对低分子量小麦多糖组成的认识，证实了低分子量小麦多糖不仅对面团的延展性有很强的影响，而且对面团的强度也有很强的影响，为面包小麦的品质改良提供了有用的信息。

植物材料

小麦品种Aroona和15个近等基因系(NILs)由南澳大利亚SARDI谷物质量研究实验室的Marie Appelbee博士和Ken Shepherd教授提供。每个NIL包含一个唯一的LMW-GS等位基因，来自一个供体品种，添加到Aroona(附加文件)2表5)。于2010年种植季在新疆石河子农垦科学院和新疆乌鲁木齐市农业科学院随机整块种植，2个重复。

LMW-GS基因分析

采用Saghai-Maroof等人的方法，从幼苗幼叶中提取了16个Aroona NILs的基因组DNA。51]。通过lw - gs基因分子标记系统分离lw - gs基因[22]。在Aroona NILs和其他一些小麦品种的LMW-GS基因的帮助下[10，13，14，17，18]， LMW-GS基因采用Lasergene软件(DNAStar;http://www.dnastar.com/)、ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，以及MEGA 5软件[52]。

LMW-GS蛋白的分离

根据Singh等人描述的方法进行谷蛋白提取。11]。使用Sunbrook和Russell描述的方法通过SDS-PAGE分离这些蛋白[53]。采用SDS/苯酚法从小麦粉中分离出全种子蛋白[54做了一些修改。简单地说，用10% TCA/丙酮在- 20°C下沉淀0.12 g面粉中的蛋白质过夜。4℃，20000 g离心15 min后，用80%丙酮洗涤3次，50℃烘干。用SDS/苯酚缓冲液(50% tris -苯酚pH 8.0, 30%蔗糖，2% SDS, 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 2% DTT)提取全蛋白。将上相苯酚转移到一个新的2ml管中。将五倍体积的甲醇(含0.1 M醋酸铵)加入管中。蛋白质在- 20°C下沉积10分钟或过夜。在4°C下，20000 g离心5分钟后，用100%甲醇洗涤一次，用80%丙酮洗涤两次，然后在空气中短暂干燥。根据Dong等人的研究，将蛋白质溶解在等电聚焦(IEF)样品提取液中，用于2D-PAGE分析。[18]。采用NIH ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/）.

平底面包的质量检测与评价

谷物硬度、蛋白质含量、Zeleny沉降值、Farinograph和Extensograph参数以及pan面包品质的测量采用He等人报道的方法进行。55]。根据Zhang等人的研究，测定了谷蛋白高分子聚合物的组成[56]。

统计分析

使用SAS统计软件包(SAS Institute, Cary, NC)进行数据分析。所有的统计分析都是基于两个地点的平均数据。

2 d-page:

二维凝胶电泳(IEF × SDS-PAGE)

% UPP:

upp /(upp + epp) × 100

方差分析:

方差分析

国际玉米和小麦改良中心:

国际玉米小麦改良中心

cMs:

厘摩

DT:

发酵时间(min)

德勤:

二硫苏糖醇

EA:

能量面积(cm)²）

电子商务:

外部的颜色

EPP:

可提取的谷蛋白聚合蛋白

Ext:

可伸性(mm)

Gli / Glu:

麦胶蛋白与谷蛋白的比例

GMP:

麦谷蛋白macro-polymers

HMW-GS:

高分子量谷蛋白亚基

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

集成电路:

内部颜色

IEF:

等电点聚焦

kDa:

Kilodalton

KP:

核蛋白(%，14% m.b。)

LMW-GS:

低分子量谷蛋白亚基

LV:

面包体积(厘米)^3.）

金沙集团:

面包体积分数

零:

Near-isogenic行

子:

开放式阅读框

pbt:

平底面包总分

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

pI:

等电点

瑞来斯:

重组自交系

做:

拉伸仪最大电阻(B.U.)

SDS:

十二烷基硫酸钠

sds - page:

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

沙:

形状

Smo:

平滑度

Spr:

有弹性

圣:

稳定时间(min)

Str:

结构

柠檬酸:

三氯乙酸

TF:

品尝味道

Tris-HCl:

三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐

UPP:

不可提取的谷蛋白聚合蛋白

war:

吸水率(%)

ZSV:

泽连尼沉降值(mL)。

作者感谢悉尼大学Robert McIntosh教授审阅本文。我们感谢南澳大利亚阿德莱德SARDI谷物质量研究实验室的Marie Appelbee博士和Ken Shepherd博士，他们为我们提供了春小麦品种Aroona及其近等基因衍生物。本研究由国家基础研究计划项目(2009CB118300)、国家自然科学基金项目(30830072)、农业部国际合作项目(2011-G3)和中国农业科学研究中心(cas -3-1-3)资助。

作者指出

从属关系

1. 中国农业科学院国家小麦改良中心作物科学研究所，北京中关村南大街12号，100081

   张晓飞，金辉，张艳，夏先春，何忠虎

2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所，国家植物基因研究中心，植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京北辰西路1号，100101

   张晓飞，刘东成，张爱民

3. 山东省农业科学院作物研究所，山东济南250100

   精灵李

4. 100081北京中关村南大街12号，中国农科院国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)中国办事处

   Zhonghu他

相应的作者

对应到Zhonghu他或爱民张。

作者的贡献

XZ进行了SDS-PAGE、2D-PAGE和LMW-GS基因标记系统分析，并撰写了稿件。HJ测定了谷蛋白大聚合物、面团性能和平底面包的质量参数，并进行了统计分析。YZ参与了加工质量参数的测量。DL参与了SDS-PAGE、2D-PAGE和LMW-GS基因标记系统对LMW-GS基因和蛋白的鉴定，并修改了稿件。GL参与了设计研究和质量参数分析。XX参与了研究的设计并修改了稿件。ZH构思并参与研究设计，协调各研究组，修改稿件。AZ构思并参与研究设计，并修改稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

金融竞争利益

·在过去的五年中，您是否收到过任何组织的报销、费用、资助或工资，这些组织可能以任何方式从您的手稿出版中获利或损失，无论是现在还是将来?是否有这样的机构资助这篇稿件(包括文章处理费)?如有，请说明。

不。

·您是否持有任何组织的股票或股份，这些组织可能以任何方式从本手稿的出版中获利或亏损，无论是现在还是将来?如有，请说明。

不。

·您是否持有或正在申请与稿件内容相关的专利?您是否从持有或已申请过与稿件内容相关的专利的组织获得过报销、费用、资助或薪水?如有，请说明。

不。

·你是否有其他财务上的竞争利益?如有，请说明。

不。

非金融竞争利益

是否有任何非经济利益(政治、个人、宗教、意识形态、学术、知识、商业或任何其他)需要声明与此手稿有关?如有，请说明。

不。

张晓飞、金辉对这项工作也做出了同样的贡献。

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