一些乙烯生物合成和AP2/ERF基因在体胚发生过程中显示出特定的表达模式橡胶树取代巴西橡胶树

背景

乙烯的产生和信号传导在体细胞胚胎发生中起着重要的作用，特别是对于在植物中具有顽固性的物种在体外文化。AP2/ERF超家族已被识别并分类为橡胶树取代巴西橡胶树。这个超家族包括参与乙烯反应的erf。分析了不同再生潜力愈伤组织体细胞胚发生过程中乙烯合成基因和AP2/ERF基因的相对转录丰度，以确定在体细胞胚发生过程中调控的基因。

结果

对142个基因进行实时RT-PCR相对转录丰度分析。在体细胞胚胎发生过程的各个阶段，I、VII和VIII组的erf转录本都很丰富。鉴定了40个愈伤组织再生能力的遗传表达标记。在愈伤组织增殖阶段发现了14个标记，在胚发生诱导期发现了35个标记。区分正常和异常胚胎的标记有16个，转化成植株的标记有36个。的AP2结构域序列的系统发育分析橡胶树和拟南芥基因使我们能够预测13个表达标记基因的功能。

结论

本文首次描述了AP2/ERF超家族橡胶树揭示了AP2/ERF基因在体细胞胚胎发生过程中的显著调控。增殖愈伤组织体细胞胚再生植株能力的基因表达标记为预测适合增殖的愈伤组织系提供了可能。这些标记物的进一步功能表征为发现AP2/ERF特异性功能开辟了前景橡胶树难以发生体细胞胚胎的物种。

了解控制体细胞胚胎发生的分子机制是至关重要的，无论是生物学上还是应用上。事实上，通过体细胞胚发生繁殖的栽培植物在某些顽固性物种或基因型中仍然受到程序效率的限制。一些多年生木本和草本植物的抗逆性与它们对伤害的反应和它们的酚类化合物含量有关。1]。乙烯、二氧化碳和自由基的产生是诱导细胞防御机制的原因，导致酚类化合物氧化、细胞壁破坏和膜过氧化[2]。添加生长调节剂，和应激诱导的在体外文化在这种机制中起主导作用[3.]。这些现象导致未分化细胞的分化和组织褐变，从而导致胚胎发生能力的丧失[2，4]。

乙烯对体细胞胚胎发生的负面影响早已为人所知[5]。的一些超胚性外植体培养Medicago truncatula揭示了许多基因的抑制，包括那些参与乙烯生物合成和信号传导的基因[6]。在紫花苜蓿中，施用噻脲后胚胎发生能力的丧失与乙烯生物合成基因的诱导有关[7]。乙烯还诱导了一些有利于获得体细胞胚胎发生能力的应激因子[8，9]和胚胎成熟[10]。脱落酸和茉莉酸甲酯是体胚发生过程中乙烯生物合成的调节因子紫花苜蓿［11]。乙烯反应因子(ERF)家族的一些成员参与响应在体外压力和发育过程的调节。在Medicago truncatula,体胚相关因子1基因(MtSERF1)是由乙烯诱导的，并可能在WUSCHEL (WUS)的作用下起作用，其固定位点在SERF1基因启动子[12]。茎部再生促进剂(ESR1)拟南芥是由细胞分裂素诱导调控芽再生的开始[13]。DORNROSCHEN (DRN)/ESR1在分生组织和器官发育中起作用，从而在茎部再生中起作用[j]。14]。ESR2的表达通过转录调控“细胞分裂素不依赖的茎再生”杯状子叶1基因(CUC1) [15]。当与其他转录因子相互作用时，通过胁迫诱导愈伤组织表达因子1 (CEF1)似乎会破坏体内生长素/细胞分裂素的稳态烟草。在众多参与胚胎发生和器官发育的转录因子中([16]以供参考)，aptala2家族(AP2)的几个成员发挥了主要作用[17]。和ERF一样，这个家族也属于AP2/ERF超家族。例如，BABY BOOM (BBM)因其在胚胎发生过程中对细胞增殖和形态发生的作用而闻名[18]。AINTEGUMENTA (ANT)参与胚珠发育和花器官的生长[19]。褶皱(WRl1)参与调节种子的贮藏代谢[20.，21]。蚂蚁亚家族包括几个被称为蚂蚁样基因或ail的成员。胚后茎器官的形成发生在茎尖分生组织，AP2家族的几个成员(ANT、AIL6/PLT3和AIL7/PLT7)也参与其中[22]。

橡胶树取代巴西橡胶树是一种特别难得一见的物种，已经进行了大量的微繁殖研究[23]。这种杂交受精的物种是在没有任何其他有效的无性繁殖技术的情况下通过出芽克隆的。两种体细胞胚胎发生方法已经发展橡胶树（[23- - - - - -25]查阅资料)。第一种是在初生愈伤组织(SEP)上的体细胞胚胎发生，这种愈伤组织是从未成熟种子或花药的内被碎片中获得的[26- - - - - -28]。这种方法对20岁左右的人有效橡胶树经过大量培养基和气氛研究后的克隆[25，29]。然而，初生愈伤组织易因乙烯和二氧化碳的高释放而褐变，导致愈伤组织增殖率低[30.]。在体外SEP培育的植株通常质量好，生长和乳胶产量都比发芽无性系好[31]。第二种方法是从长期维持的易碎愈伤组织中发展出来的，目的是大规模增殖。这种方法随着使用来自SEP的胚胎片段而发展，以便快速建立胚胎性易碎愈伤组织系[29，32]。最后，易碎愈伤组织的低温保存已被纳入到该过程中，以限制组织增殖，从而减少与体细胞无性系变异相关的风险[33]。然而，这种间接的次生体细胞胚胎发生过程仅限于少数无性系，而且胚胎和植株的再生能力是可变的。在一些脆弱的愈伤组织中，缺乏植株再生潜能与胚性球细胞的早期空泡化有关。34]。一些转录的变化也被报道橡胶树不同胚性愈伤组织系[34]。

对乙烯在刺激乳胶生产中的作用的研究导致了乙烯生物合成和信号传导基因的表征，最近又鉴定了AP2/ERF超家族的不同成员[35- - - - - -38]。AP2/ERF超家族包含173个成员，其中142个被分类为家族和群体[35]。AP2家族包含20个基因，分为两个亚家族(8个ANT基因和12个AP2基因)。ERF家族分为10组，共有115个基因。最后，有4个基因的RAV家族和3个基因的soloists家族。基于这些知识，我们的研究开始更清楚地了解乙烯生物合成和信号基因，包括ERFs，以及AP2和RAV家族成员在体细胞胚胎发生过程中的调控橡胶树。利用实时RT-PCR技术对不同胚性的脆性愈伤组织进行相对转录丰度分析[33]，正常和异常的体细胞胚胎，以及不同的幼嫩植物组织。基因表达谱分析表明，这些基因是增殖愈伤组织和胚发生诱导愈伤组织的胚胎发生潜力的标志，也是体细胞胚质量的标志。对这些标记基因功能的预测提供了对体细胞胚胎发生过程的动态理解。

不同体细胞胚发生能力愈伤组织的形态发生潜能

次生间接体细胞胚胎发生过程如图所示1(参见材料与方法)。初生体细胞胚是由未成熟种子的内被皮作为母体组织诱导形成的(图2)2A)。三次传代培养后获得致密的愈伤组织成熟体细胞胚胎(图2)2B).从体胚片段中建立脆性愈伤组织。在ENT培养基上生长的可增殖的易碎愈伤组织无论其胚性如何，都具有相当的可比性(图2)2D)。在EXP上培养4周后，非胚性愈伤组织(图2)2J)和胚胎性(图2H)系比再生系含水量更大，颜色更白(图2)2E).在DEV培养基上的RITA培养体系中，胚再生过程中愈伤组织生长减慢。愈伤组织的所有线条都变成了棕色(图1)2F、I和K)。褐变有利于胚性系的胚胎形成(图2)2正常胚胎有一个胚体和两个发育良好的子叶(图1)2L)。胚胎的异常类型最多:例如，一些胚胎只有一个子叶(图2)2M)，或具有畸形子叶(图2)2N)，双胚体(图2)2O)被发现。从正常胚胎中获得的植株在一个月内发育出主根和侧根系统，以及带叶的茎2G)。

对三种易碎愈伤组织的形态发生能力进行了测试，直至体细胞胚转化为植株(表2)1)。非胚性系CI04115 (NE)未产生体细胞胚胎。细胞系CI04106为胚源性(E)，每克愈伤组织产生19.5个体细胞胚胎，其中大部分异常(93.54%)。只有再生系CI07060 (R)产生了大量的体细胞胚(每克愈伤组织590个)。胚性系和再生系的异常胚比例较高，分别为93.54%和82.71%。从再生系获得的102个正常胚胎转移到萌发培养基中，53个发育成植株。

愈伤组织增殖过程中体细胞胚胎发生能力14个标记基因的鉴定

在ENT培养基上的愈伤组织增殖中，分析了乙烯生物合成和信号基因以及AP2和RAV家族的相对转录物丰度(图2)3.)。除了RAVs外，每个基因家族中有几个基因的水平都很高(图2)3.A).与内控RH2b的转录本丰度相比，I、VII和VIII组的erf值分别为8、15和10个基因，相对值超过1。不同胚性系间的比较发现，有14个基因存在差异表达(图2)3.B)。在R系愈伤组织中，有11个基因的相对转录物丰度低于E系和NE系，其中3个基因与乙烯生物合成和感知有关(HbSAMS, HbACS2, HbETR1)，其中四人来自后备基金家族(HbERF-Ia1, HbERF-VI2, hberf - via4, hberf - via3)， AP2家族4例(HbAP2-1, HbAP2-5, HbAP2-12, HbAP2-18)。会议的笔录HbAP2-11基因在胚性系中大量积累。最后，是会议的笔录HbERF-VIIa23基因在非胚性系中较少，而在胚性系中则相反HbRAV-4该系愈伤组织中基因积累较多。

体细胞胚发生表达/诱导过程中35个体细胞胚发生能力标记基因的鉴定

转移到体细胞胚发生诱导培养基上的愈伤组织也强烈表达了除ERF-V组外几乎所有家族和群体中所研究的大量基因(图2)4A)。如前所述，ERF家族的I组(9个基因)、VII组(12个基因)和VIII组(10个基因)的大部分成员都具有高转录水平。35个基因在不同系愈伤组织间的表达差异显著(图2)4B)。其中15个基因在再生系中的转录量高于NE和E系:1个乙烯生物合成基因(HbSAMS)， ERF家族的11个基因(HbERF-IIIb2, HbERF-IIIc1, HbERF-IIIe3, HbERF-IVa1,HbERF-IVa2, HbERF-IVa3, HbERF-Vb2, HbERF-VI-L1, HbERF-VIIIa7, HbERF-IXb2, HbERF-IXc4)， AP2家族的2个基因(HbAP2-3, HbAP2-7)和RAV家族的1个基因(HbRAV-3)。会议纪要HbERF-VIIIa3胚性系愈伤组织中基因积累量高于其他两系。最后，包含14个erf的19个基因(hberf - iia1, HbERF-Vb3, HbERF-VI3, HbERF-VI4, HbERF-VI-L6, hberf - via3, hberf - via4, HbERF-VIIa13, HbERF-VIIa17, HbERF-VIIa4, hberf - via13, HbERF-IXa2, HbERF-IXa3, HbERF-IXa4)及5个AP2s (HbAP2-4, HbAP2-6, HbAP2-8, HbAP2-11, HbAP2-19)的转录本水平在非胚性系中低于其他系。

16个基因在正常和异常体细胞胚胎中有差异表达

再生系产生的正常和异常体细胞胚胎仅在ERF家族的某些成员中表现出差异表达谱(图2)5)。除RAV家族外，各家族和群体的基因转录本均高度积累(图2)5A). ERF-I、ERF-VII和ERF-VIII组的大部分成员在两种胚胎中都有高表达。ERF家族中有12个基因的转录本丰度在正常胚胎中低于异常胚胎(HbERF-Ia1, HbERF-Ib1, HbERF-Ib3, HbERF-Ib6, HbERF-Ib7, HbERF-Ib8, HbERF-IIb5, HbERF-IVa2, HbERF-VIIIa11, HbERF-IXb4, HbERF-IXb8, HbERF-Xb1)(图5B)。相反，4个基因的转录本在正常胚胎中积累(HbERF-VI1, hberf - via1, hberf - via3, hberf - via4)。

体细胞胚胎发生和转化成植株过程中转录物丰度的进化

对使用增殖愈伤组织的再生系体细胞胚胎发生过程的全面分析表明，许多基因的表达是高度调节的(图2)6)。大量乙烯生物合成和转导基因的转录本以及AP2家族I、VII和VIII组的一些erf高度积累(图2)6A)。除了X组的erf外，所有家族或组的36个基因在胚胎发生过程中表现出差异积累(图2)6B).观察到几个基因表达谱。11个标记从体细胞胚胎发生诱导阶段就被激活(HbSAMS, HbACO1, HbEIN3, HbERF-IIIe2, HbERF-VIIa9, HbERF-VIIa23, hberf - viia3, HbERF-IXb2, HbAP2-5, HbAP2-11, HbAP2-13)。八个基因的转录本(HbERF-Ib5, HbERF-IIa3, hberf - iia1, HbERF-VIIa1, hberf - viia14, HbERF-IXa3, HbAP2-1, HbAP2-3)在胚性组织中含量非常丰富，而在苗体组织中含量明显较少。在EXP培养基上胚化诱导的愈伤组织中，有2个基因(HbERF-Vb2、HbERF-Vb3)在体胚中有6个基因(HbERF-VIIa3、HbERF-VIIa4、HbERF-VIIa17、HbERF-VIIa3、HbAP2-2、HbAP2-6)在体胚中有短暂积累，有2个基因(HbERF-IVa1、HbERF-VIIa18)在EXP培养基上愈伤组织和胚中均有短暂积累。三个基因(HbERF-IXb2、HbERF-IXb6、HbERF-IXb8)的转录本优先在叶片中积累，在HbERF-IXc3中，转录本在体细胞胚胎和叶片中都有积累。最后，除了胚胎外，所有组织的相对转录物丰度都很高，胚胎的相对转录物丰度显著降低HbAP2-16基因，除了愈伤组织，胚胎和根HbRAV4。

体细胞胚胎发生标记基因推测功能的鉴定

在体细胞胚发生过程中56个差异表达的基因中，再生系与其他2个非胚性系或胚性系比较，正常胚胎与异常胚胎比较，40个基因的表达方式相同(表1)2)。再生系的相对转录丰度与其他两系的相对转录丰度之比表明，这些标记在再生系的增殖愈伤组织中呈低表达(0.01 ~ 0.4)的趋势，而在EXP培养基上胚化诱导的愈伤组织中呈过表达(2 ~ 43倍)的趋势。在16个胚胎表达标记中，12个低表达，4个过表达。

这些基因表达标记的作用首先通过转录序列的互惠最佳命中分析(BLASTX)来预测(表1)2)。作用主要是在对生物和非生物胁迫的反应中，更准确地说是在对脱水、盐度和寒冷的耐受中。AP2和RAV家族基因以及一小部分erf基因在发育过程(胚胎发生和花发育)中发挥作用。为了找到橡胶树的潜在同源物拟南芥对AP2家族和组成标记基因的不同ERF群(I、III、IV、VI、X)的AP2结构域氨基酸序列进行分析橡胶树(附加文件1:图S1，附加文件2:图S2，附加文件3.:图S3，附加文件4:图S4，附加文件5:图S5和附加文件6:图S6)。系统发育树分析的总结见表2。十三个橡胶树标记基因被证明是16个潜在的同源基因拟南芥包括一些同源基因的基因:HbERF-Ia1与ERF53，HbERF-IIIc1与AtCBF/DREB (CBF3/DREB1A, CBF2/DREB1C, CBF1/DREB1B, CBF4/DREB1D, DDF1, DDF2)，HbERF-IIIe3与小，HbERF-IVa1和HbERF-IVa2与DREB2A, HbERF-VI1和HbERF-VI2与CRF2 / TMO3 HbERF-Xb1与RRTF1，HbAP2-1与BBM，HbAP2-3有两个AINTEGUMENTA-Like基因(AIL7 / PLT7和AIL6 / PLT3)，HbAP2-7与AINTEGUMENTA,HbAP2-12和HbAP18与APETALA2。

导致胚胎发生能力丧失的因素

虽然在正常情况下，愈伤组织褐变发生在胚胎发育的后期，但增殖愈伤组织的早期褐变会促进活性细胞(分生细胞和胚胎细胞)的分化，从而导致其胚胎形成能力的丧失[25]。在橡胶树,这种褐变与细胞中氧化多酚的大量积累和乙烯的产生有关[4，30.，71]。本研究通过在低胚性和非胚性系的愈伤组织中激活乙烯生物合成和信号基因证实了这些发现(图2)3.)，而这只发生在再生系在EXP培养基上诱导胚胎发生后。在增殖愈伤组织中发现的植物再生能力基因表达标记分别属于erf的VI、VII和VIII组(HbERF-VI2, hberf - via4, hberf - via3)，它们是对激素信号(乙烯、茉莉酸等)的反应因素。胚性系和非胚性系的愈伤组织增殖过程中，其他与发育有关的因素也被激活。AP2家族有四个基因:HbAP2-1, HbAP2-5, HbAP2-12, HbAP2-18。的系统发育分析橡胶树和拟南芥家族导致了几个同源物的预测。HbAP2-1和HbAP2-12 / HbAP2-18的潜在同源物拟南芥BBM和AP2基因，分别[18，60]。BBM在发育中的胚胎和种子中优先表达[18]。其异位表达在拟南芥，芸苔属植物和烟草导致在幼苗中自发形成体细胞胚胎和子叶状结构[18，72]。然而，这种异位表达会引起多效表型，如肿瘤生长、植物在无激素培养基上的再生以及叶和花形态的改变。BBM在胚胎发生过程中促进细胞增殖和形态发生的作用似乎在其他物种中得到证实，如芸苔属植物显著和Elaeis guineensis［17，73]。的AP2基因参与控制拟南芥花和种子的发育[68]。已知该基因在非花器官中表达，如叶和茎，并可能在控制中起普遍作用拟南芥发展。然而，这些基因的早期激活，尤其是HbAP2-12和HbAP2-18，在增殖橡胶树愈伤组织可能不合适，因为它不利于进一步诱导体细胞胚胎发生。

体细胞胚胎发生诱导过程中发生的变化

体细胞胚胎发生是通过降低培养基中生长调节剂的浓度来触发的橡胶树愈伤组织。这有助于减缓愈伤组织的生长，有利于胚胎的形成[74]。胚胎发生诱导也伴随着愈伤组织褐化。在这项研究中，这种转变与基因表达的变化有关。几种乙烯生物合成基因，如HbACS3和HbACO2,在胚发生诱导前后愈伤组织中均有高度转录。当愈伤组织转移到EXP培养基上时地空导弹基因急剧积累。在愈伤组织增殖阶段和体细胞胚发生诱导过程中，该基因也是区分再生系和其他两种低胚发生系或非胚发生系的标志。地空导弹催化s -腺苷基蛋氨酸的形成，这是乙烯和多胺生物合成途径的底物。后者似乎在体细胞胚胎发生中起决定性作用橡胶树［75]。然而，几个erf的诱导表明乙烯信号的建立。四个erf (HbERF-IVa1，HbERF-Vb2，HbERF-Vb3，HbERF-VI2)及HbRAV4基因在EXP培养基上瞬间诱导愈伤组织体胚发生(图2)6)。在这一阶段，再生系与低胚性系或非胚性系的比较也显示出13种erf的强烈诱导(HbERF-IIIa1, HbERF-IIIb2, HbERF-IIIc1, HbERF-IIIe3, HbERF-IVa1, HbERF-IVa2, HbERF-IVa3, HbERF-Vb2, HbERF-VI-L1, HbERF-VIIa17, hberf - viia7, HbERF-IXb2, HbERF-IXc4)， 2ap2 (HbAP2-3, HbAP2-7)及RAV3基因(图4或表2)。

这些基因表达标记中有几个被预测为同源物拟南芥具有特征功能的基因。HbERF-IIIc1与几个是同源的吗拟南芥DREB1s来自1组低温诱导[52，53]。HbERF-IIIe3假定的同源词是小已知可被干旱、寒冷、乙烯以及茉莉酸甲酯(程度较轻)激活[47]。的semi-dominant小突变导致植株高度降低，影响下胚轴伸长和育性。小可能在生物和非生物应激信号通路之间的交流中起作用。HbERF-IVa1和HbERF-IVa2两个可能的同源词是DREB2A参与干旱响应基因表达[50]。HbERF-IVa1将愈伤组织置于体细胞胚发生诱导培养基上进行过渡性诱导HbERF-IVa1和HbERF-IVa2与低胚性系和非胚性系相比，是较好的再生潜力标记。因此，这两个基因可能是非常好的基因表达标记，但似乎也在体细胞胚胎发生过程中发挥关键作用。会议记录HbERF-VI1在正常胚胎中积累HbERF-VI2在再生系的增殖愈伤组织中表达不足。这些基因是假定的同源基因CRF2，之前被描述为mp3目标(tmo3)。的TMO基因被生长素依赖转录因子MONOPTEROS (MP)靶向，这是胚胎根发育的调控信号[59］。AP2在发育过程中，基因通常在多个组织中转录。ail还在分生组织或分裂主管状态的规范中发挥作用[76]。HbAP2-3是假定的2的同源物吗拟南芥的基因,AIL7 / PLT7［66),AIL6 / PLT3,参与花分生组织的生长[67]。HbAP2-7似乎是与蚂蚁基因(19]。在器官发生过程中，ANT通过维持细胞的分生组织能力来调节细胞增殖和器官生长[77]。最近，它被证明可以促进侧边器官原基的起始和生长，以及器官极性[64]。因此，它在再生剂中有很高的表达橡胶树愈伤组织系与非胚性系和胚性系相比，其在胚胎发育中的作用是一致的。关于RAV，这个家族是由乙烯调控的[78]和油菜素内酯[79]。RAVs参与对生物和非生物应激的反应[80]。增加HbRAV4体胚诱导过程中的转录本与乙烯引起的剧烈变化一致。

发育和体胚质量的控制

体细胞胚胎的个体发生包括一个胚胎生长阶段，随后是顶端分生组织和根的形成，以及原形成层束的形成，最后是萌发所需储备的积累。81]。体细胞胚胎逐渐脱水，进入静止状态[82]。的分析AP2 /小块土地在体细胞胚胎成熟末期进行的基因表达显示，大量参与乙烯生物合成和信号传导的基因以及几个基因的相对转录丰度非常高AP2基因,包括HbAP2-3，HbAP2-6，HbAP2-9，HbAP2-10，HbAP2-13，HbAP2-18和HbAP2-20(图5)。先前描述的HbAP2-3(与AIL6和AIL7同源)和HbAP2-18(与APETALA2同源)的潜在作用突出了这些基因的重要性。区分正常与异常胚胎的16个标记基因均属于ERF家族。异常胚胎积累了属于I组(DREB亚家族)的6个erf的转录本[50)比正常胚胎多。在正常胚胎中，另一种DREB基因(DREB2A的同源基因HbERF-IVa2)的转录本的丰度值得注意。这表明两种类型的胚胎对参与脱水、盐度和寒冷反应的erf有不同的调节。

在这132人中AP2 /小块土地所研究的基因中，有40个是与体细胞胚胎发生过程的不同阶段相关的表达标记橡胶树。通过对11个极早期标记的鉴定，可以预测愈伤组织增殖的再生潜力，为利用这些标记选择适合大规模繁殖的材料开辟了前景。系统发育分析使得更精确地预测某些基因的功能成为可能拟南芥。9个标记的功能表明，激素和应激信号的调控在体细胞胚胎发生中与参与形态发生调控的基因一样重要。除了这些标记基因，另一个小块土地在体细胞胚胎发生过程中表达的基因可能与细胞分裂素反应因子(CRF)同源HbERF-VI1或HbERF-VI2［58]。对这些标记进行深入的功能表征将有助于更好地理解体细胞胚胎发生，并解释胚胎发生能力的丧失和胚胎异常。还可以研究这些基因的遗传变异，以确定等位基因变异是否可以用于育种计划进行选择橡胶树克隆不仅表现在农艺性状上，而且表现在对体细胞胚胎发生的反应上。因此，AP2/ERF超家族可能在多种其他生物学功能中发挥重要作用橡胶树。首先，应用乙烯利刺激橡胶生产。在过度敲击的情况下原位胶粒凝结导致生产损失:这是攻丝板干燥。第二,ERF1，ERF2，ERF3和RAV1基因，与HbERF-VIIa1，HbERF-VIIa3，HbERF-VIIa17和HbRAV1［35]，与次生乳汁管分化同时发生[83]。研究这个超级家族橡胶树从而提供了一些新的生物学知识。

植物材料

体细胞胚的植株再生过程包括四个步骤，如图所示1。首先，利用玉米种子的内被进行初生体细胞胚发生橡胶树克隆pb260 [24]。其次，利用体细胞胚片段建立易碎愈伤组织[29]。第三，将愈伤组织长期冷冻保存，避免长期传代培养[33，39]。第四，解冻后的脆性愈伤组织诱导胚胎发育和植株再生[24]。

在这项研究中，先前从冷冻保存的材料中鉴定出三种不同胚胎发生能力的愈伤组织[33]。非胚性愈伤组织系CI04115不具有产生体细胞胚胎的能力。胚性非再生愈伤组织CI04106能产生少量体细胞胚胎，但不能再生植株。再生愈伤组织系CI07060可再生胚和植株。将这些冷冻保存的愈伤组织浸泡在37°C的温水浴中2分钟解冻。ENT培养基中加入基本的MH常量和微量元素，并添加9 mM的CaCl_2，234mm蔗糖，30 μM AgNO_3.1.34 μM BAP, 1.34 μM 3,4- d, 0.5 μM ABA, 2.3 g。l¹Phytagel [24]。冷冻瓶的内容物在含有25 mL ENT解冻后培养基的培养皿中放置1小时，ENT解冻后培养基是添加1 M蔗糖和1 mM氯化钙的改性ENT培养基₂［33]。然后将愈伤组织转移到添加0.5 M蔗糖的新鲜ENT解冻2培养基中1天，之后再次转移到含有正常蔗糖浓度(234 mM)和1 mM CaCl的ENT恢复培养基中₂。在培养皿中愈伤组织生长恢复后，分离出易碎的愈伤组织聚集体并转移到含有ENT培养基的试管中。愈伤组织在27°C的黑暗环境中生长，每两周在新鲜ENT培养基上进行传代培养。

胚胎诱导时，将1克在ENT培养基上增殖的易碎愈伤组织转移到含有50 mL表达培养基(EXP)的250 mL瓶中。EXP是一种添加9mm CaCl的改良ENT培养基_2，58.5 mM蔗糖，175.5 mM麦芽糖，0.44 μM BAP, 0.44 μM 3,4- d和0.5 μM ABA。27℃黑暗培养4周。将愈伤组织从一个瓶子转移到含有200 mL DEV液体培养基(RITA®，CIRAD, France)的临时浸泡系统中，获得体细胞胚胎的发育。在组成相同的DEV培养基中连续培养2次，每次4周，每天浸泡1分钟。DEV培养基为改良的ENT培养基，加入3mm的CaCl₂没有植物生长调节剂。培养8周后，将胚轴和子叶发育良好(正常)的成熟胚转移到含有萌发培养基(GER)的玻璃管中。萌发培养基(GER)含有MS常量元素、MH微量元素和维生素，以及234 mM蔗糖，用7 g/L琼脂半固化。在60 μmol m光强下培养胚²年代¹白昼12 h /黑暗12 h的光周期使胚胎转化为植株。在DEV2结束时计数异常胚胎并丢弃。

总RNA的分离

对于不同胚性的愈伤组织系，分别在ENT和EXP培养结束时收集愈伤组织。再生愈伤组织系在DEV2末分别收集正常胚和异常胚。从一个月大的植株上采集叶子、茎和根。所有样品在液氮中冷冻，并在-80°C的冷冻室中保存，等待总RNA提取。采用Sambrook和coll的氯化铯缓冲法分离总rna。［84由Duan和coll。［38]。将1克新鲜物质磨碎并转移到含有30 mL萃取缓冲液的试管中，萃取缓冲液由4 M异硫氰酸胍、1%肌氨酸、1%聚乙烯吡咯烷酮和1% ß-巯基乙醇组成。匀浆后，将管置于冰上保存，4℃下10000 g离心30 min。将上清转移到含有8ml 5.7 M CsCl的新管中。89,705 g在摆动桶中超离心，20℃，20小时。丢弃上清和铯垫，用70%乙醇洗涤RNA小球。空气干燥30 min后，将颗粒溶解于200 μL无菌水中。尽管在这种离心条件下，DNA不能穿过铯缓冲层，但使用Actin基因的引物(包括内含子序列)进行PCR扩增来检查DNA污染情况。rna在-80℃保存。

引物设计及实时RT-PCR分析转录物丰度

为了减少相对基因表达数据的错误风险，应用了一些规则。电泳检测总RNA的完整性。在每个序列的3 '侧设计引物，以减少使用Geneious (Biomatters Ltd.， New Zealand)的Primer 3模块合成cDNA短而导致的错误风险。使用混合cdna进行实时PCR扩增和融合曲线，以检查每对引物的特异性。引物序列在附加文件中列出7表S1。

根据制造商的说明书(MBI, Fermentas, Canada)，使用RevertAidTM M-MuLV逆转录酶(RT)试剂盒，从2 μg的总RNA合成cdna到最终的20 μL反应混合物。利用cDNA末端引物对Actin cDNA进行PCR扩增，对每个cDNA样本进行全长cDNA合成检查。最后使用Light Cycler 480 (Roche, Switzerland)进行实时RT-PCR定量基因表达分析。Real-time PCR反应混合物为:RT产物cDNA 2 μL，每种引物5 μL各0.6 μL, 2 × SYBR green PCR主混合物(LightCycler®480 SYBR green I master, Roche Applied Sciences) 3 μL，体积为6 μL。PCR循环条件包括95°C下1个变性循环5 min，随后45个扩增循环(95°C 20s, 60°C 15 s, 72°C 20s)。在384孔板上进行表达分析。使用自动化工作站(Biomek NX, Beckman Coulter)装载样品。

为了选择最稳定的基因作为所有比较组织(HbelF1Aa、HbUBC4、HbUBC2b、HbYLS8、HbRH2b、HbRH8、HbUBC2a、HbalphaTub、Hb40S、HbUbi、HbActin)的内控基因，对11个内控基因进行了Real-time PCR8表2)。HbRH2b因其在体细胞胚发生各阶段组织中的稳定性而被选为最佳内参基因。的均匀性HbRH2b基因Cp证实该基因可作为内参基因(表2)3.)。的HbRH2b在每个反应板上与靶基因平行扩增基因。每个基因的转录物丰度水平通过与参考基因的转录物丰度归一化来相对量化HbRH2b基因。相对转录物丰度考虑了引物效率。所有转录本积累对应的归一化比率均由厂家提供的Light Cycler软件1.5.0版本自动计算，计算方法如下:归一化比率=效率^{——Δ(Cp靶-Cp RH2b)}。

统计数据分析

每个愈伤组织维持3个生物重复。记录并计算每克愈伤组织转移到EXP培养基上的形态学数据。统计分析采用方差分析和学生Newman-Keuls检验。表中相同字母的值在0.05概率水平上无显著差异1。

Real-time PCR反应建立3个生物重复。对原始数据进行对数变换后的方差分析进行统计分析。对3种不同胚性愈伤组织(再生、胚性和非胚性)、2种胚型(正常和异常)以及从愈伤组织到植株(ENT和EXP培养基上的再生愈伤组织、正常胚、叶片、茎和根)各阶段体细胞胚发生过程的相对转录本丰度进行方差分析和Student Newman-Keuls检验。相同字母的值在0.05概率水平上无显著差异。

在表2，表达量计算为再生系/胚性系、再生系/非胚性系在ENT和EXP培养基上生长的愈伤组织中转录本相对丰度的比值，以及正常/异常体细胞胚中转录本相对丰度的比值。将其视为比值> 1.0的上调和比值< 1.0的下调。采用双尾概率值对原始数据的对数进行统计分析t测试。以相对转录物丰度p值≤0.05的比值作为下调或上调的显著性。文中只讨论了有意义的数据。

AP2/ERF标记基因AP2结构域的系统发育分析

对来自橡胶树和拟南芥AP2, ERF (III, IV, V, VII, VIII, X组)和RAV家族(附加文件1:图S1，附加文件2:图S2，附加文件3.:图S3，附加文件4:图S4，附加文件5:图S5和附加文件6:图S6)。完整的ap2结构域序列来源于橡胶树和拟南芥然后使用MUSCLE软件对大约60个氨基酸的ap2结构域蛋白进行排列[85，86]，它使用渐进的多重对齐方法。对齐是由Gblocks软件策划的[87]，寻找至少10个氨基酸长的保守片段，并提取了含有57个氨基酸的片段。利用这段57个氨基酸，用PhyML软件构建系统发育树[88]，实现了一种极大似然树重建方法，使用LG+gamma模型，从BioNJ树开始[89]。从初始PhyML树中进行RAP-Green分析，以改进基因功能推断并预测系统发育树中的基因重复[90]。最终的树是用始祖鸟程序绘制和展示的，并扎根于将RAV家族与树的其他部分分开的分支上。分支支撑力采用类似alrt - sh的方法计算[91]。

这项工作得到了法国Caoutchouc研究所和泰国橡胶研究所的研究金的支持。作者感谢Peter Biggins提供的英文版手稿。

从属关系

1. CIRAD, UMR AGAP，蒙彼利埃，F-34398，法国

   Piyanuch Piyatrakul, Riza-Arief Putranto, Florence Martin, Maryannick Rio, Florence dessaily, Julie Leclercq, jean - franois Dufayard, Ludovic Lardet和Pascal Montoro

2. 橡胶研究所，泰国曼谷，10900

   Piyanuch Piyatrakul

3. 印度尼西亚农业作物生物技术研究所，茂物，印度尼西亚

   Riza-Arief Putranto

相应的作者

对应到帕斯卡Montoro。

作者的贡献

FD和FM从冷冻保存的材料中为本实验建立了各种脆性愈伤组织。PP诱导体细胞胚发生，再生胚和植株，然后从样品中分离总RNA和合成cDNA。PP和RP从AP2/ERF基因设计引物。MR和JL在Roche平台上监督实时RT-PCR分析。LL指导组织培养实验。JFD就策略提供建议并监督系统发育分析。PP和PM起草了手稿。PM协调了这项研究工作。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

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