葡萄原花青素基因结构的定量性状位点定位分析

背景

原花青素(PAs)，或缩合单宁，是类黄酮聚合物，广泛存在于植物王国中，在保护植物免受食草动物侵袭的同时，赋予植物源食物(如葡萄酒)感官和营养价值。然而，人们对其成分的定性和定量变异的遗传基础仍知之甚少。为了阐明该复合物的遗传结构，我们首先对191个伪f1后代进行了QTL分析。评估了三类PA变量:总含量、组成亚单元百分比和复合比例变量。我们利用141个葡萄品种的多样性面板，对9个功能候选基因(其中8个与qtl共定位)进行关联分析，以确定因果snp。

结果

多重QTL分析显示，共有103个与种子PA变量相关的QTL, 43个与皮肤PA变量相关的QTL。基因座以加性效应为主，部分基因座以显性效应为主。结果还显示，在形成PA成分中，大量参与了成对上位性相互作用。葡萄果皮和种子中PA变量的qtl在数量、位置、上位互作参与和等位效应等方面存在差异，从而揭示了葡萄果皮和种子中PA组成的不同遗传决定。关联结果在大多数情况下与QTL分析一致:9个测试的候选基因中有4个(VvLAR1，VvMYBPA2，VvCHI1，VvMYBPA1)显示至少有一项与PA变量显著相关，尤其是VvLAR1揭示了对进一步功能研究的极大兴趣。一些snp -表型关联仅在多样性组中观察到。

结论

本研究首次对葡萄莓皮和种子的PA成分进行QTL分析，并进行相关性研究。我们的研究结果表明，葡萄果皮和种子之间的PA性状具有复杂的遗传控制和不同的遗传结构。这项工作还揭示了新的基因组区域，以进一步研究，以增加我们的知识，以PA组成的遗传基础。

原花青素(PAs)，或浓缩单宁，是广泛存在于植物王国中类黄酮聚合物。它们积聚在许多器官和组织中，以防止害虫[1］．它们也是食品质量的决定因素，对它们对人类健康的有益影响的研究越来越多[1，2］．这些不同的性质与聚苯胺的化学结构直接相关。作为聚合物，PA的结构取决于聚合的程度和构建块黄烷-3-醇的性质(立体化学的差异，b环上的羟基化模式和没食子酰基团的存在/不存在，图1)．通过分离两个编码浅色花青素还原酶的基因(LAR， [3.)和花青素还原酶(ANR， [4，5])，两种形成黄烷-3-醇的特定酶，分别是(+)-(gallo)儿茶素和(-)-epi(gallo)儿茶素。然而，由于所有类黄酮中间体都假定为2,3-，因此，关于PA组成的一些问题需要进一步研究，如没食子化单元的合成、聚合的遗传机制以及延伸单元的来源反式结构，类似于(+)-(gallo)儿茶素的2,3结构(图1)，而主要的PA扩展块假定为2,3-独联体结构(例如(-)-表儿茶素，图1)．此外，关于PA成分数量变异的遗传基础研究较少[6，7］．

了解葡萄中的多肽基因很有意义，因为多肽参与了葡萄的自我防御机制，并对红酒的主要感官特性负责[8- - - - - -10］．由于其丰富的PA组成和该物种可利用的多种遗传和基因组工具，如全基因组序列[11，12，葡萄也可以代表一个有趣的模型，PA遗传研究。事实上，在拟南芥(PA研究的主要模型)中，PA仅在种皮中检测到，而(-)-表儿茶素是唯一的组成部分。相比之下，PAs存在于葡萄藤的不同器官中，由四个主要的构建模块组成:(+)-儿茶素，(-)-表儿茶素，(-)-表没食子儿茶素和(-)-表儿茶素-3-O没食子酸盐(13- - - - - -16而(+)-没食子儿茶素和(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸只以微量存在[15］．葡萄浆果中富含PAs，但果皮和种子的成分差异很大:种子中的总含量通常更高，而果皮中的聚合物尺寸大得多[15，16］．就构成构件而言，(-)-表没食子儿茶素是葡萄皮PAs的主要成分[15而在种子中无法检测到[16];(-) -epicatechin-3 -O-没食子酸在种子中以延伸亚基和末端亚基的形式大量存在，而在皮肤中只少量存在[15，16］．对葡萄PA合成的认识主要通过同源克隆获得[14，17- - - - - -21］．然而，一个组织内复杂的PA组成和组织间对比的组成表明，葡萄PA组成的决定论中有许多因素的复杂相互作用。

评价性状变异遗传决定论的一种方法先天的知识是quantitative trait loci (QTL)作图。QTL定位利用分离群体，为目标表型的遗传结构提供了全球性的见解，即．基因组区域的数量、位置和作用[22］．在所有可用的作图方法中，多QTL作图方法特别适合复杂性状分析，因为它同时使用多个标记区间，并可能在QTL作图模型中包含互作项[23］．除了创建隔离的种群，人们还可以通过关联映射来探索现有的多样性，以确定涉及表型变异的位点[24］．根据目标性状的遗传结构，可以制定合适的育种策略和/或进一步开展基因功能研究。

本研究旨在探讨葡萄果皮和种子中PA成分变异的遗传决定论。为此，我们首先在西拉和歌海娜杂交的伪f1后代中鉴定了葡萄皮和种子葡萄的PA组成。为了获得复杂的PA剖面，我们构建了三类PA变量:总含量变量、评估构建块间生物合成效率的构成亚基百分比和复合比例变量，包括评估构建块间聚合物大小和代谢产物通量。然后，我们应用多qtl基因组扫描来识别PA变量的主效应qtl和两两上位性相互作用。在一个葡萄多样性面板中，对9个功能候选基因进行了测序，其中8个与qtl共定位，研究了它们的snp -表型关联。本文首次对葡萄PA组成的遗传结构进行了广泛的研究，并证实了一些候选基因参与了PA组成的变异。

植物材料

在这项研究中使用的两个葡萄种群之前已经被描述过[25- - - - - -27］．简单地说，QTL定位群体(S × G)由两个酿酒葡萄品种西拉(S)和歌海娜(G)杂交的191个伪f1代后代组成，并在法国蒙彼利埃SupAgro Domaine du Chapitre (Hérault, France)的传统本地训练系统(3300株/公顷植物密度)下维持。S × G种群分两个小区种植。后代的每个个体被种植在两个基本地块(每个地块一个)，每个地块有5株。每个小区还种植亲本品种，西拉和歌海娜的初级植株分别为9株和43株。关联图谱群体(CC)由141个具有50个数量和质量性状的最大农业形态多样性的栽培品种的核心集合组成，并保存在INRA藩属庄园(Hérault，法国)[26］．

DNA提取、标记基因分型和基因测序

Adam-Blondon等人已经描述了DNA提取和标记基因分型[28］．为了增强S × G群体的97-SSR连锁图谱[25]，额外的SSR标记在西拉和歌海娜都是杂合的，从最近的葡萄藤参考地图中选择[29］．基于12X葡萄参考序列(Grape Genome Browser)http://www.genoscope.cns.fr)，我们使用Primer3 (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)，使用默认参数。本研究中使用的引物列在附加文件中1．对于SNP分析，基因片段被扩增、测序和分析，如[30.］．

连锁图施工

基于[97标记连锁图谱构建框架图25]，增加了56个ssr。以Tmap检测，153个标记的基因型错误率均低于1.5% [31］．利用CarthaGène 0.999R [32]如在[33]与Haldane映射函数。“西拉”和“歌海娜”框架图分别由121个ssr(总长度1118.8 cM)和133个ssr(总长度1349.4 cM)组成。“共识”框架图全长1256.4 cM，由153个ssr组成，其中超过70%的ssr允许伪F1后代(ab × ac和ab × cd)的4个基因型类分离。在lod2阈值下，标记顺序的可靠性得到保证。基因型类的分离畸变通过aχ²根据不同图谱中每个标记的分离类型进行检验(例如，共识图谱中ab × cd标记分离的H₀假设ac:bc:ad:bd = 1:1:1:1)。153个标记中有25个显示出扭曲的分离(P< 0.05)，主要集中在3号染色体(4个标记)、4号染色体(6个标记)和10号染色体(5个标记)上。4号染色体上的标记表现出最显著的等位基因偏差(P< 0.001)，这是由于Syrah等位基因(aa:ab ~2/3 /3)之间的分离畸变所致。

表型和PA变量构建

葡萄在成熟时(20°Brix)采收。对于每个基因型，从基本样地的5株植株上收获8个代表性浆果簇。样品均质化是基于总溶质(主要是蔗糖)的积累，这是浆果成熟过程中发育的一个主要标志。通过在盐溶液中漂浮来评估浆果的密度[34］．随机选取25个草莓，NaCl浓度在130 ~ 160 g /L之间。由于果肉中PA含量较低，果肉中PA含量仅占浆果总PA含量的2-6%，因此本研究主要对浆果皮和种子进行分析[35］．浆果的皮和种子被分离，在液氮中研磨，并在80°C保存直到分析。在间苯三酚存在下，经酸催化裂解后，用高效液相色谱(HPLC)提取PAs，按[36］．S × G种群连续2年对皮和种子进行分析:2005年(1块)和2006年(2块)对皮进行分析，2006年(2块)和2007年(2块)对种子进行分析。2005年和2006年对CC种群的皮肤和2006年的种子进行了分析。

为了全面了解PA的组成，本研究对PA的总含量、亚单位百分比和复合比例变量进行了研究。对于总含量变量，concP (mg/g鲜重)反映了每个组织的生物合成强度，concB (mg/浆果)通过考虑浆果大小将总含量提高到单个浆果的水平，而concK (mg/kg浆果)是一种考虑到产量相关性状的常用的酿酒计量方法。由于所有PA构建块都来自相同的中间结构——柚皮素查尔酮，我们使用每个PA亚基占总亚基数量的百分比来评估PA构建块之间的分配效率。我们的PA表征方法没有区分聚合物和黄烷-3-醇单体的末端单元。因此，以“T”结尾的符号对应末端亚基和单体的和。我们还构建了复合比例变量，包括平均聚合度(mDP)，比例2,3-反式- 2、3 -独联体-亚基在延伸位置(ftransis_ex)，末端位置(ftransis_t)和整体亚基(ftransis_all)以及b环二羟基化和b环三羟基化亚基的比例(F3pr35)。本研究中的变量总结在表中1．

表型数据分析

所有统计分析均使用R软件进行[37］．我们通过贝叶斯信息准则(BIC)确定了每个PA变量的最佳拟合混合模型，以提取基因型值的最佳线性无偏预测因子(BLUPs)，并估计广义遗传力(H²)．混合模型拟合采用lme4包[38］．在模型拟合后，通过比较残差和随机效应预测因子的分布与理论正态分布的分位数-分位数图检查残差和blup的正态混合模型假设(附加文件2)．没有对两个总体中测量的PA变量进行数据转换。更多关于表型数据分析和各PA变量最佳拟合模型的信息在附加文件中3.．

QTL分析

采用R/ QTL包对基因型blps进行QTL分析[39］．采用“逐步QTL”函数进行多元QTL回归。该方法采用前向/后向选择的方法确定了一个包含主效应qtl和两两相互作用的多qtl模型。在正向选择中，最大QTL数被设置为10。qtl = 10)。通过惩罚LOD评分(pLOD)进行模型选择，这是模型的LOD评分(完整模型与不含QTL的null模型的对数似然比)，并对QTL数量和两两QTL × QTL相互作用进行惩罚[40］．对于每个PA变量，通过1000个二维扫描排列(scantwo函数，method =“hk”，n.perm = 1000)得到主效应和基因两两相互作用项的特定惩罚，并使用全基因组错误率为0.05的惩罚进行多qtl模型拟合。pLOD最大的QTL模型被认为是最可能的QTL模型。一旦确定了多重QTL模型，我们细化QTL位置(“refineqtl”函数)并估算R²对于整个模型和模型的每一项，每一项的个体LOD评分和基因型效应(“fitqtl”函数)。利用“lodint”函数推导LOD-1 QTL定位置信区间。Segura估计了共识qtl的等位效应等．［41］．基因组扫描以1 cM的步长进行。

关联分析

根据功能和与qtl的共定位选择9个候选基因进行关联检验。联想测试前，我们使用R亲属关系包[42对不同嵌套模型进行模型比较，根据[43]，以选择最适合的模型对每个PA变量进行关联检验。祖先结构和亲缘关系矩阵是根据整个基因组中的20个SSR标记估算的，如[25］．

模型比较后，我们使用TASSEL包执行关联测试[44］．研究采用了两种模型:一种是遗传结构效应(一般线性模型，即TASSEL中的GLM模型)，另一种是遗传结构效应和随机遗传背景效应(混合线性模型，即TASSEL中的MLM模型)。对皮肤变量的blup和种子变量的原始数据进行关联测试，因为种子数据仅在2006年可用。对于GLM分析，使用1000种排列进行测试，以确定不同的位点P值，其中的概率较大F在多态性独立于表型的零假设下的值。的调整Pvalue(在TASSEL中称为p_adj_Marker)，是站点级别P考虑到由于连锁不平衡导致的snp之间的依赖关系，对多个测试进行了调整。由于每个基因都是独立检测的，我们使用额外的Bonferroni校正来校正研究基因的数量(9个)，这导致了调整后的阈值为0.0056P价值。由于排列法在传销中不可用，我们采用Benjamini和Hochberg [45)与问等于0.05，导致0.0039的阈值。轻度基因型频率和观察性状分布的非正态性的影响被检查(详情见附加文件)4)．

表型分析

PA变量分布和遗传力

S × G种群中所有PA变量均呈连续分布，且在S × G和CC种群中海侵分离和变化程度相当(图2)2额外的文件5)．与以往的研究一致[15，16，46研究人员对2006年采集的样本进行了分析，结果显示不同组织间的PA成分不同，如图所示2为S × G种群的平均值。S × G和CC群体中，(-)-表儿茶素(epiEx)是所有组织中主要的延伸亚基，而(-)-表没食子儿茶素(egcEx)仅在皮肤中检测到。(+)-儿茶素(catT)在果皮和种子中均以末端亚基/单体为主，而种子PA中以没食子酰亚基(galEx和galT)为主。各亚单位根据基因型表现出较大的变异。例如，在皮肤中，(-)-表儿茶素(而不是(-)-表儿茶素)可能是扩展位置的主要亚基(67.9%)(附加文件5)．

无论单位是什么，种子中的PA含量变量(concP、concB、concK)都比果皮中的高，如图中所示2 b)，不同组织之间的差异最大。复合PA比变量在果皮和种子间的变异幅度不同。种子内的pa平均长度是皮内pa的8倍，而皮内pa的长度变化很大2摄氏度)．所有这三个比值变量都在评估2,3-之间的通量反式, 3 - 2独联体形式(Ftrancis系列)指向不同的延伸和末端位置动力学:反式对于末端亚基/单体(Ftranscis_T)，皮肤中的亚基更加丰富，而当单独考虑延伸位置(Ftranscis_Ex)或延伸加末端亚基/单体时，种子中的亚基则大大减少(Ftranscis_all，图2 d-f)．因为主要的扩建区块都在独联体-构型，即(-)-epi(gallo)儿茶素，在果皮和种子中Ftranscis_Ex始终小于1。皮肤中较高的Ftranscis_T符合(+)-儿茶素是皮肤中主要的末端亚基/单体的事实。(图2 b)．在皮肤和种子中测量的每个PA变量的平均值是系统不同的(成对)t以及,P< 0.001，数据未显示)。

S × G种群为平均H²在果皮和种子中的PA变量分别为0.56(0.24 ~ 0.82)和0.44(0.26 ~ 0.54)。没有显著差异H²在皮和种子之间检测大小(t以及,P= 0.053)。然而,高H²观察皮肤变量，特别是catT和mDP(分别为0.76和0.82，附加文件5)．一个高H²在CC中，这两个性状也分别为0.86和0.72,cat和mDP分别为0.86和0.725)．

PA变量相关

我们对S × G种群的基因型值(BLUPs)进行了PA变量相关性分析，因为两年的皮肤和种子数据使我们可以在环境影响大大降低的情况下进行研究。所有三个总含量变量在特定组织内高度相关，而组织间显著相关仅在concB和concK中观察到(图3.)．皮肤亚单位百分比变量(图3.)中，最显著的特征是egcEx (b环三羟基化亚基)与所有其他亚基(b环二羟基化亚基)呈显著负相关，(-)-表儿茶素与(+)-儿茶素在延伸位置(Ex)和末端/单体位置(T)呈显著正相关。最显著的特征是epiT与所有其他变量显著相关(延伸单位为负，末端单位为正)，而epiEx与其他亚单位为负相关。同一亚基在特定组织中，除种子中epiEx和epiT呈负相关外，延伸和末端位置之间没有显著的相关性(P< 0.001)。亚单位百分比变量与组织内复合变量之间的显著相关反映了变量的构建(表1)．在组织间，conk、大部分末端亚基/单体对、galEx、以及mDP和ftransis_all均呈显著正相关。

QTL分析

PA qtl的全局特征

我们在共识图谱和亲本图谱上对基因型blps进行QTL检测。总共有103vs43个qtl和24个qtlvs在种子和皮肤PA变量的共识图谱上分别发现了2个同源上位性相互作用(图4)．在亲本图谱上检测到的qtl，除了皮肤上的concP、concK、catEx、galEx、epiT、F3pr35和种子上的concP外，其它qtl也在共识图谱上检测到6)．在共识图谱中比在亲本图谱中发现了更多的QTL和基因两两相互作用，使得一些QTL模型能够解释共识图谱中超过80%的BLUP方差(附加文件)6)，正如epiT在种子中的例子所示(图5 d)．有些位点几乎完全通过基因互作参与表型变异，如种子conb的位点10@32或种子epiT的位点14@16.0(图2)5)．基因座以加性效应为主，而部分基因座在皮肤中的concK、epiEx、mDP和Ftranscis_T和种子中的galEx、epiT、ftransis_t和ftransis_all表现出显性优势(图1)4)．在所有检测到的qtl中，只有10个主效应位点在两种组织中重合:1个为concB, 2个为concK, 1个为epiEx, 1个为galEx, 2个为catT, 1个为epiT, 1个为mDP, 1个为Ftranscis_T(见图)5一些例子)。亲本等位基因对这些常见位点的贡献在不同组织中并不总是一致的6)，这可能是一种组织特异性遗传机制的指示。如图所示，在浆果皮和种子之间观察到相同的PA变量的不同遗传结构5:皮肤中少量中度QTL(< 3)或无QTLvs几个(> 5)可能参与上位性的小到中度qtl(对于concP、concB、catEx、galEx、ftransis_ex和ftransis_t，如图中concB所示)5）;许多与皮肤上位有关的qtlvs在种子中存在少量(2)主效应qtl(图中epiEx)5 b）;主要QTL (R²> 50%)及部分在皮肤中中度作用的qtlvs．许多小到中效的qtl(对于catT和Ftranscis_all，如图中catT所示)5度)或少量中度qtlvs在种子中存在一个大效应和上位性QTL (epiT, Figure5 d)．相反，conk在果皮和种子之间观察到相似的遗传结构(只有中度主效应qtl，图5 e)和mDP(一个主要QTL和少数中度效应QTL，图5 f)．关于位置、主要等位基因效应、LOD评分、LOD-1置信区间和被解释变异百分比的详细信息(R²)在附加文件中给出6．

爸爸总含量

在皮肤中，在concP、concB和concK的共识图谱上分别鉴定出1个、1个和3个qtl。通过亲本检测，在Syrah图谱上又鉴定出一个与concP相关的QTL。与此相反，对于conk，所有QTL均表现出较大的歌海娜等位效应，并且在歌海娜图谱的第9染色体上发现了一个额外的QTL。

在种子中，共鉴定出6个、10个和5个与concP、concB和concK相关的qtl。3个变量均鉴定出位于2号染色体40-50 cM的位点。上位性在concB的遗传结构中起着非常重要的作用，总共约占BLUP方差的30%1)．

综上所述，果皮中检测到的qtl总量低于种子。在第8、13和17号染色体上分别发现了皮和种子之间的共有位点。在每个组织中，鉴定出一个与3个总含量变量共有的位点:皮肤的8号染色体上的QTL和种子的2号染色体上的QTL。

简单变量:组成单元的百分比

在皮肤中，分别有1个、9个、3个和5个qtl在共识图谱上被鉴定出，分别为catEx、epiEx、galEx和egcEx，其中有多个qtl存在重叠(图1)4)．对于catEx，在歌海娜图谱上又特异性鉴定了14号和18号染色体上的2个qtl。确定了epiEx的两两相互作用。在末端亚基/单体中，分别检测到2个和4个与epiT和catT一致的qtl。这两个性状在8号和17号染色体上有一个特别大的共定位位点R²17号染色体基因座阳性率为55.8%。

在种子中，epiEx的2个qtl在共识图谱上被鉴定，而8号染色体和12号染色体上的另外2个位点分别在歌海娜(Grenache)和西拉(Syrah)图谱上被鉴定4额外的文件6)．对于所有其他简单变量，在共识图谱上至少有7个qtl和1个两两相互作用参与了多qtl模型。对于galEx，通过亲本检测在第3、5和9号染色体上发现了额外的位点。

联合考虑从两种组织中获得的结果表明，不同的qtl被鉴定为性质相同但在聚合物中位置不同的亚基(如epiEx和epiT)。位于约的轨迹。除皮肤中的egcEx、galEx和catEx外，两种组织中所有PA简单变量的17号染色体均为7cm。

复合比例变量

在皮肤中，mDP、ftransis_t和ftransis_all的最佳QTL模型仅包含少数主效应QTL(2 ~ 4个QTL，附加文件)6)而没有基因相互作用。这3个变量在17号染色体上的主位点也被确定:在mDP的情况下，它解释了超过50%的总BLUP方差(图5 f)．在共识图谱上检测到6个与F3pr35相关的QTL，在13号染色体上通过亲本检测鉴定到1个syrah特异性QTL。ftransis_ex的QTL仅通过亲本检测得到(Syrah图1个QTL，歌海娜图2个QTL)。

在种子中，mDP具有一个三加性qtl模型，而ftransis_ex、ftransis_t和ftransis_all具有10个qtl和1 ~ 4个基因互作的qtl模型效果最好。此外，基因互作约占ftransis_ex和ftransis_all的BLUP方差的30%(图5和额外的文件6)．

综上所述，对于相同的变量，不同的qtl在不同的浆果组织中被鉴定出来。在所有复合变量中，只有17号染色体上的mDP和ftransis_t的大效应QTL在皮和种子上是常见的。两种组织间的多qtl模型比较表明，种子变量比皮肤变量涉及更多的基因互作。

候选基因的关联分析

我们利用葡萄基因组上SSR标记的相对位置，定位了21个已知的葡萄PA功能候选基因([11),http://www.genoscope.cns.fr,图4，请参阅附加文件7候选基因侧翼标记的名称)。对9个功能候选基因进行关联检验，其中8个与qtl共定位。在候选基因中，编码类黄酮途径酶的基因和假定的调控因子基因都存在。基因部分到全部测序(基因覆盖率为25 ~ 100%)，主要是外显子(Table2)．两种模型用于关联研究，因为模型比较显示了等效的拟合(附加文件8):一种解释固定祖先结构效应(TASSEL中的GLM)，另一种解释固定祖先结构效应和随机遗传背景效应(TASSEL中的MLM)。9个基因中有4个显示至少一个与PA变量显著相关，GLM和MLM结果一致(表)3.)．78%的显著性测试(27个测试中的21个)与GLM和MLM相同，而6个额外的关联仅与MLM模型显著。造成这种差异的原因可能是调整后的P- GLM的值是通过考虑由于连锁失衡导致的测试之间的依赖性来估计的[44而在传销中，每个SNP都是在独立性假设下进行检验的。关联结果与以下基因-表型对的QTL分析一致:VvLAR1皮肤土和VvLAR1皮肤mDP(表3.)．特别是在连锁不平衡的几个SNPsVvLAR1(数据未显示)与皮肤中的catT和mDP显著相关，而这两个变量的qtl的置信区间重叠。相反，我们只在多样性组中观察到一些snp -表型关联:VvLAR1皮肤Ftranscis_all,VvMYBPA2皮肤concP,VvMYBPA2皮肤concK,VvMYBPA2皮肤mDP,VvMYBPA2种子高尔特,VvCHI1皮肤concP,VvMYBPA1皮肤点蚀电位和VvMYBPA1种子Ftranscis_T。

与以往研究相比，PA的变异程度

Hernandez-Jimenez和他的同事提供了葡萄藤伪f1群体中PA成分的第一个特征[46］．他们的种群由42个后代组成，来自西拉和蒙纳斯特雷尔的杂交后代。在所有组织中，Syrah × Monastrell种群延伸位置的亚单位百分比和Ftranscis-series变量的大小和程度与本研究相当。1) epiT在Syrah × Monastrell种群中更为丰富;2) mDP，在我们的研究中更高;3)总含量变量，本研究的总体均值和变异程度是[的3 ~ 2倍]。46］．共同亲本西拉(Syrah)在两项研究中表现相似，尽管我们在皮和种子中分别观察到10倍和2倍的总PA含量。亲本差异可能是两个居群间差异的结果，但同一亲本品种的亲本组成不同，环境差异以及提取和定量方法也可能影响亲本性状。事实上，混合模型拟合表明，年份对两种组织中PA相关变量都有重大影响，这与之前的一项连续两年测量两个品种中PA含量和组成的研究一致[53］．S × G中PA变量的巨大数量变异，在CC多样性面板中也达到了相同的程度，这强调了在一个F1群体中应用数量遗传方法研究葡萄PA的兴趣。

两项研究仅对不同葡萄品种的PA成分进行了表征[54，55]最多有37个品种的样本[54］．不同的生化分析不允许对后一项研究和当前工作的结果进行比较。然而，在我们的研究中，CC由141个地理来源广泛的葡萄品种(从东欧到西欧)组成，最初被定义为最大化50个农业形态性状的多样性[26］．因此，多样性面板中PA组成的变化为在较大遗传背景的群体中细化PA qtl提供了潜力。

葡萄PA组成伪f1群体的多重QTL定位

据我们所知，本研究首次对葡萄果实果皮和种子的PA成分进行QTL分析。这也是第一个在定位过程中同时考虑主效应和同源上位效应的多个QTL模型在葡萄上的研究。动物QTL定位表明，上位性效应通常足够大，可以被检测到，因此无论种群大小，都值得进行系统扫描，尽管更大的种群(> 500个个体)可以进行更强大的上位性检测[56］．通过采用多重QTL作图方法，我们实际上证明了上位相互作用在形成PA成分变异中的重要作用;事实上，一些位点几乎完全通过两两相互作用参与表型变异。我们的测绘群体有足够的规模(191个个体)，允许识别小效应qtl。然而，人们应该记住的是R²个别qtl的估计通常被高估[57并且可能有较大的置信区间[58］．因此，一些已确定的qtl在现实中可能影响较小。因此，尽管我们最初确实检查了全基因组第一型错误率，但在解释结果和进一步鉴定因果多态性时应该谨慎。

等位基因对个体QTL的贡献主要来自Syrah和/或歌海娜等位基因的加性效应6)．亲本检测与共识检测(亲本检测和共识检测分别有2个和4个基因型类)相比，每个基因型类中有更多的个体，因此可以识别较小的加性qtl。另一方面，共识图上的QTL检测使我们能够估计QTL的显性效应s，即等位基因类别之间的相互作用，但不一定是显性隐性关系的假设[59］．在本研究中，在果皮和种子中检测到的qtl中，分别有9.8%和30%的qtl具有显性作为主要等位基因效应(D In Figure4和额外的文件6)．例如，种子中concB的8@69位点几乎完全通过显性参与表型变异(附加文件6)，如果只进行了父母映射，这些信息就会被忽略。

葡萄PA组分的遗传结构

爸爸总含量

QTL结果与PA变量相关结果一致，组织间未发现显著相关，且未在皮肤和种子间发现该变量的共定位QTL，而组织间发现了concB和concK的共定位QTL。由于concB和concK兼顾了果实大小和产量相关性状，因此这些针对concB和concK的共定位qtl可能通过改变果实发育或产量相关性状间接参与了PA总含量的变化。事实上，concK的多个qtl与产量相关性状的qtl共定位，尤其是位于染色体8、13、17和18的qtl，其中产量相关和浆果大小相关的qtl也在同一个S × G群体中被鉴定出来(Doligez等，未发表的数据)。与这些产量相关的基因座不同的是，concP和concB、concK所鉴定的基因座可以作为进一步了解浆果区隔中差异的PA含量的特异靶点。

关联测试是根据参与程度而进行的VvMYBPA2如之前的一项研究所示[50］．两个VvMYBPA2snp与皮肤PA含量变量显著相关。(表3.)．VvMYBPA2主要表达在绿色期的浆果皮中，在葡萄毛根中过表达显著增加了PA的产量[50］．显著的关联VvMYBPA2定位于启动子和内含子，可能参与转录水平的改变或通过连锁失衡与其他因果突变。在非同义多态性之间确定了一个次要的关联VvCHI1和皮肤concP(表3.)．VvCHI编码葡萄类黄酮途径的上游酶。该基因可能通过控制中间底物通量参与PA含量的变异。然而，精确的介入VvCHI1PA含量变异还需要进一步的基因和功能验证。

在测试的候选基因中，VvMYB5a位于8号染色体上，被多个qtl覆盖，尤其是与总含量相关的qtl。先前的一项生理学研究表明，异位表达VvMYB5a在烟草诱导的类黄酮基因表达中，显著提高了PA和花青素的产量[49］．因此，作者提出VvMYB5a作为类黄酮途径的上游调节剂。在我们的工作中，没有发现显著的关联VvMYB5a同时对整个基因进行测序(Table2)．该基因是否与葡萄PA含量变异有关还需要进一步的研究。

PA亚基合成:黄烷-3-醇的羟基化模式

所有的类黄酮在b环的4'位置都有一个羟基(图1)．b环类黄酮羟基化模式首先在色彩工程的观赏植物中被研究，因为它是花青素的主要颜色决定因素，花青素是另一类黄酮，与PA单体亚基共享类似的C6-C3-C6骨架[60，61］．之间的联系F3'H而且F3’5是什么由于缺乏容易评估的报告，基因活动及其相关黄烷-3-醇不太明显。我们对葡萄果皮变量的研究结果表明，在3、6、8、10和18染色体上的5个基因组区域存在epiEx、egcEx和F3pr35的共定位qtl。这种共定位并不奇怪，因为epiEx和egcEx是F3pr35变量构建的主要组成部分，因此高度相关(图2)．这些位点可能参与了二羟基化和三羟基化PA构建块之间的通量。有趣的是，egcEx和F3pr35在第6染色体上的QTL与对应的基因组区域共定位F3’5是什么基因家族。

然而，在两个测试之间没有检测到显著的关联VvF3的5是什么同工基因和羟基化模式变量的研究。F3’5是什么作为一个多基因家族存在于葡萄基因组中，其中至少有15个同基因已被鉴定[62］．对于重复基因，新功能化和/或次功能化可以以时空方式对每个亚型进行专业化[63- - - - - -65］．实际上,isogeneVvF3 5是什么1.1(或VvF3 5是什么n在[62])仅在营养器官中表达，而VvF3 5是什么2.1(或VvF3 5 f是什么在[62)在浆果皮中表达。对所有同工基因多态性的评估可能会对两者之间的联系提供更多的见解F3’5是什么和羟基化变化。

PA亚基合成:没食子化黄烷-3-醇

到目前为止，PA没食子化构件产生的潜在遗传决定论仍不清楚。我们在葡萄莓皮和种子中的结果表明(-)-表儿茶素-3-的数量变化O-没食子酸可能受许多基因组区域和双基因上位性相互作用的控制4和额外的文件6)．关联测试提供了额外的信息，揭示了种子中galT和snp之间4种微弱但显著的关联VvMYBPA2．这些相关的snp位于内含子或蛋白质的c端，可能包含蛋白质-蛋白质相互作用域[66)(表2)．这一结果表明，相关的snp可能导致转录复合体招募或与其他蛋白相互作用的改变。［50］．糖基转移酶最近被确定为参与PA没食子酰化的第一步酶促反应的候选酶[67］．由于它们位于第3染色体上，而皮肤和种子中galEx的qtl位于第3染色体上4和额外的文件7)，它们可能是未来进行关联遗传学测试的好对象。

PA亚基的合成:反式亚基和顺式亚基

综合考评的反式——独联体-亚基与PA聚合密切相关，因为类黄酮途径的中间底物被假定占用a反式-configuration，而主扩展子单元假定为独联体-构型(例如(-)-表儿茶素)[68］．通过分离编码末端/单体形成的特定酶活性的两个基因:2,3-，在了解PA亚基生物合成方面取得了重大进展反式——(gallo)儿茶素和2,3 -独联体epi (gallo)儿茶素(3.- - - - - -5］．最近，另一种动态的观点认为反式-而且顺式终端单位/单体是由Gargouri和同事提供证明的能力葡萄ANR epimerise(+)儿茶素(-)表儿茶素(69］．我们的结果似乎与这项工作一致，因为在17号染色体上发现了两个手性黄烷-3-醇catT和epiT的主位点，这也是皮肤中ftransis_t和ftransis_all的主位点。这个位点进一步与VvLAR2该基因属于还原酶-表吡酯酶-脱氢酶(RED)家族，属于ANR，因此可能同时具有表吡酯酶和还原酶活性。同样,三VvLAR1SNPs与皮肤中的Ftranscis_all显著相关，因此值得进一步的功能研究以了解其参与在活的有机体内PA亚基合成。

另一方面，延伸亚基的来源仍不确定:延伸亚基是来自途径中的中间底物还是来自最终产物，如(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素?［1，68，70］．在我们的工作中，没有系统地观察到性质相同但在聚合物中位置不同的亚基之间的显著相关性，并且很少有qtl同时定位。此外，还得到了与通量有关的qtl反式-而且顺式亚基在延伸位置(ftransis_ex)和末端亚基/单体(ftransis_t)之间差异最大。这些结果表明，不同基因座参与PA构建块的合成和之间通量的控制反式——独联体-亚单位根据它们在聚合物中的位置。斯塔福德等．已经从放射性标记实验中提出，上部和下部单元产生于途径的不同步骤，而不是类似单元的凝结[71］．

PA聚合

关于PA聚合的争论的一个方面涉及酶或非酶聚合(由[1，70])。大麦PA突变体支持了聚合酶的存在ant26，含有相当于野生型含量的(+)-儿茶素，但只有微量的PAs [72］．另一方面，在体外也有报道称PAs的化学合成[73]，这些作者观察到聚合物大小的调制通过调节延伸单元中间体和单体的相对数量。因此，我们可以假设不是聚合酶，而是ant26突变可以直接影响PA自发聚合的适宜条件，如合适的pH值[70］．对本研究中发现的qtl的进一步研究将为这一聚合问题带来更多的见解。事实上，就皮肤mDP而言，H²高(0.82)，多重QTL模型占基因型方差的70%，对应总表型方差的57%。第17染色体上最大的QTL仅解释了55%的基因型方差，也是种子mDP的主要位点(图1)5 f)．因此，该QTL是研究mDP遗传机制的重要靶点。另一个位于1号染色体上的QTL也可能是了解PA聚合的一个有趣的靶点。这个QTL与一个编码pa特异性合成酶的基因共同定位，VvLAR1，其中连锁失衡中的多个snp(数据未提供)与皮肤中的mDP和catT显著相关，与相应的QTL一致。有趣的是,VvLAR1在歌海娜中是高度多态的，而在西拉中是近乎纯合的(编码区有1个SNP，数据未呈现)，这表明该区域的mDP QTL主要是歌海娜等位效应所致。

PA组成的组织特异性遗传结构

根据之前的一项研究，该研究证明了葡萄浆果转录谱的组织特异性[74，本研究阐明了葡萄果皮和种子间PA组成的不同遗传机制:qtl在数量、位置、R²和等位基因的效果。总含量变量中，主要qtl在果皮和种子中存在差异。对于亚单位百分比和复合变量，也观察到组织之间的重要差异。在两种组织中，对于相同的PA亚单位百分比变量，74个qtl中只有5个在皮肤和种子之间存在重叠区间。另一个对比特征是:在皮肤中，54%的qtl占西拉加性效应，78%的qtl占歌海娜效应，而在种子中，74%的qtl占西拉加性效应，53%的qtl占歌海娜效应6和图4)．即使在两个组织中都发现了一个特定的基因座，主要的等位基因效应和R²差异(如catT的第17染色体QTL，附加文件6)．我们的结果表明，种子PA的变异受中等和等量级的qtl控制，并与上位作用有关。另一方面，皮肤变量主要受少数大效应位点的遗传控制，其波动方差由qtl无法解释。

不同组织间不同的遗传结构可能是这两个浆果区隔中PAs功能进化不同的结果。对于一般的水果来说，确保胚胎的保护是至关重要的。由于PAs和黄烷-3-醇的丰度和保护植物免受生物胁迫的能力，它们可能是参与葡萄胚芽保护的主要分子。事实上，它们在维持种子休眠方面的影响已经在拟南芥中得到证实[75]和它们与植物激素的相互作用也有报道[76，77］．因此，为了防止单一多态性突变造成的生物波动，可以假设在种子pa中存在一个没有人类选择的进化产物，即具有多个相互作用的参与者的网络，这是通过识别众多的小效应qtl和上位性的参与提出的。相反，果皮是葡萄浆果抵御环境的第一道屏障。在植物中，pa被认为与自我防卫机制有关[1］．对于浆果消费者来说，果皮PAs赋予浆果风味，也负责葡萄酒的主要感官质量。消费者反过来可以帮助植物的种子分散或营养繁殖。然而，大量的PAs会给浆果带来太多的涩味和苦味，这将导致消费者(特别是人类)拒绝直接消费(或酿酒)生产这种浆果的葡萄。因此，随着时间的推移，人类选择尤其可能缩小了皮肤PA的遗传基础，从而产生了具有一些针对皮肤PA变量的大效应qtl的特定遗传结构。

QTL定位和关联分析作为候选位点鉴定的补充方法

在这项工作中，我们使用QTL定位和关联分析来确定表型标记的关联。对于表型相关标记的鉴定，由于亲本品种的杂合性，葡萄分离群体比自交系衍生群体具有更大的多样性。然而，与多样性面板相比，它们的遗传背景仍然相对狭窄。另一方面，QTL定位可能揭示了由于等位基因频率低而在多样性面板中未检测到的关联。因此，在这项工作中有时遇到的两种方法之间的不一致可能是由于两个种群之间可用的遗传多态性不同:一个种群中的因果多态性可能在另一个种群中是单态的。此外，我们的分析集中在与QTL共定位的已知功能基因，而其他候选基因可能是QTL区间的基础。除了耗时的精细定位外，还可以结合QTL结果和其他数据(如转录组学)来选择候选基因。尽管如此,LAR1通过关联测试，基因引起了一种特殊的兴趣。对单一品种进行的互补功能研究[14]，我们在此提供额外的确认LAR1通过多样性面板研究，研究葡萄PA组成的基因参与。

本研究证实了葡萄浆果中PA成分的复杂遗传结构的推测。鉴定出了PA总含量、PA构建块、聚合度和构建块间比的qtl。浆果PA组成为组织特异性遗传结构提供了一个案例研究:在皮肤中，多个PA变量涉及相同的主位点，而具有强上位性的多个中等qtl是种子PA组成的主要遗传因子。这些差异可能是由于人类对表皮PA的选择导致相关基因多样性的减少，而控制种子PA合成的多因素网络对保护葡萄胚胎是必要的。协会测试证实了VvLAR1作为调控浆果皮中catT和mDP的候选基因VvMYBPA2对总含量，可能对亚单位galloylation。本研究首次对葡萄PA组成的遗传机制进行了评估，为进一步的PA遗传研究打开了大门。

ANR:

花青素还原酶

BLUP:

最佳线性无偏预测器

4 cl:

4-coumaroyl辅酶a连接酶

C4H:

肉桂酸4-hydroxylase

catEx:

(+)儿茶素扩展子单元

卡特:

(+)儿茶素终端单元/单体

气:

查耳酮异构酶

CHS:

查耳酮synthasel

concP:

鲜重总含量为mg/g

concB:

总含量mg/浆果

concK:

浆果总含量为mg/kg

DFR:

Dihydroflavonol还原酶

egcEx:

(-)表扩展单元

epiEx:

(-)表儿茶素扩展子单元

点蚀电位:

(-)表儿茶素终端单元/单体

F3H:

黄烷酮3-hydroxylase

F3'H:

类黄酮3 ' -羟化酶

F3’5是什么:

类黄酮3 ' 5 '羟化酶

星系演化探测器:

(-) -epicatechin-3 -O没食子酸盐扩展单元

高尔特:

(-) -epicatechin-3 -O没食子酸盐终端单元/单体

LOD:

概率的对数

LDOX:

Leucoanthocyanidin加双氧酶

政治:

Leucoanthocyanidin还原酶

PA:

Proanthocyanidin

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyse

QTL:

数量性状位点

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复。

我们感谢a。Saïdou，希望对关联模型的选择提供有益的讨论和帮助。我们感谢所有研究团队成员参与样品制备。我们感谢M. Farnos和P. Ortigosa收集多样性样本，感谢杜查皮特酒庄和瓦萨酒庄的工作人员进行葡萄种植。我们感谢三位匿名审稿人的建议和P. Chatelet的英语复习。这项工作部分由欧洲项目FLAVO资助。513960)，以及INRA和朗格多克-鲁西永地区颁发的YFH博士学位。

从属关系

1. UMR AGAP, INRA, 2，维亚拉，蒙彼利埃，34060，法国

   黄荣芬，Agnès Doligez, Alexandre Fournier-Level, Loïc Le Cunff, Yves Bertrand, Cécile Morel, Valérie Miralles & Patrice This

2. INRA, UMR1083 SPO, 2, place, Viala，蒙彼利埃，34060，法国

   黄永芬，Frédéric Veran, Jean-Marc Souquet, Véronique Cheynier & Nancy Terrier

3. UMT Geno-Vigne®，IFV, 2, place Viala，蒙彼利埃，34060，法国

   Loic Le Cunff

4. UMR Génomique Végétale, INRA UEVE ERL CNRS, 2, rue Gaston Crémieux, Evry, 91057，法国

   Aurelie Canaguier

5. 布朗大学生态与进化生物学系，Box G-W, 80 Waterman Street，美国，RI, 02912

   亚历山大Fournier-Level

相应的作者

对应到艾格尼丝Doligez．

作者的贡献

YFH进行基因测序和比对，进行数据分析，制作表格和图表，并起草稿件。AD检查表型和基因分型数据，进行连锁图谱构建和首次统计分析，并参与稿件编写。AFL参与了基因测序、序列比对、关联试验分析和稿件编写。LLC参与上游数据分析，数据解释和手稿准备。YB进行了现场试验和样品采集。AC进行基因分型，构建连锁图谱。FV、VM、CM、JMS进行生化分析。NT指导PA变量的构思，解释结果并参与稿件编写。VC和PT构思了这项研究，参与了它的设计、协调、数据解释和手稿准备。所有作者阅读并批准最终稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇基于知识共享署名许可条款发布的开放获取文章(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是正确引用原作品。

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