在珍珠稷遗传图谱基于基因的标志物候选基因鉴定耐旱性数量性状基因座底层的集成

背景

通过对抗旱性定量性状位点(QTLs)基因的鉴定，有助于了解珍珠谷子抗旱性的分子机制，也有助于通过标记辅助选择加速珍珠谷子的遗传改良。我们报告了一个基于植物适应干旱和其他非生物胁迫的功能基因的图谱，并证明了它在鉴定一个主要的DT-QTL候选基因中的应用。

结果

利用表达序列标签(est)，以h77 /833-2、PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004 4个基因型为载体，构建了75个单核苷酸多态性(SNP)和保守内含子扩增引物(cpp)标记，分别代表两个定位群体的亲本。从30.5 kb序列区共获得228个SNP, SNP频率为1/134 bp。该图谱共鉴定了18个编码PSI反应中心III亚基的基因，其中包括2个主要的珍珠谷子连锁群(LG)的dt - qtl(分别来自h77 /833-2 × PRLT 2/89-33和841B × 863B)。PHYC、肌动蛋白、丙氨酸乙醛转氨酶、尿苷酸激酶、酰基辅酶a氧化酶、二肽基肽酶IV、疯了-box、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、泛素结合酶、锌指C- × 8-C × 5-C × 3-H型、高清3、乙酰辅酶a羧化酶、叶绿素a/b结合蛋白、光解酶、蛋白磷酸酶1调控亚基SDS22和两种假想蛋白，共同定位于此DT-QTL区间。这些候选基因中有许多与干旱胁迫下籽粒产量、开花时间和叶卷的qtl存在显著相关。

结论

我们利用珍珠粟的EST序列，构建了75个珍珠粟的新基因标记，并证明了其在该物种的一个主要DT-QTL的候选基因中的应用。这些基于基因的标记为珍珠谷子非生物胁迫qtl的候选基因鉴定提供了重要资源。它们还为利用候选基因发起关联研究提供了资源，也为比较远缘植物基因组(如其他禾本科成员)的结构和功能提供了资源。

珍珠粟[Pennisetum blaucum.(l)r . Br。(2n = 2 × = 14)是全球第六大最重要的谷物作物(排在水稻、小麦、玉米、大麦和高粱之后)，在撒哈拉以南非洲和印度次大陆最炎热、最干燥的地区作为雨养谷物和饲料作物种植。它生产有营养的谷物，是生活在非洲和南亚半干旱、低投入的旱地农业地区的人们的主要食物。

基于分子标记的遗传图谱是珍珠谷子应用遗传育种计划的必要组成部分。与水稻、高粱、玉米、小麦、大麦等其他谷类作物相比，珍珠粟分子标记遗传图谱的开发和应用研究相对较少。迄今为止，珍珠谷子的遗传图谱主要基于限制性片段长度多态性(RFLP)和扩增片段长度多态性(AFLP)等标记[1- - - - - -5]，以简单序列重复(SSR)和多样性阵列技术(DArT)为基础的地图[6- - - - - -8现在处于优势地位。这些图谱不仅在qtl的鉴定和抗旱性育种中很有用[4，5，9]，抗病[10- - - - - -14]和秸秆质量[15]，但也增进了我们对珍珠谷子基因组与其他禾科物种基因组之间复杂关系的理解[3.]．尽管有一些中等密度的遗传图谱和细菌人工染色体库[16]，对珍珠粟感兴趣的潜在性状的基因鉴定的进展一直受到基于图的克隆的费力性质的阻碍。为了将重要的农艺和生理性状与功能序列变异联系起来，并发现潜在的农业性状候选基因，需要开发和定位目前在珍珠粟中缺乏的基于基因的标记。珍珠谷子将从系统定位重要功能基因的努力中获益良多，从而有助于寻找候选基因和农业重要性状的qtl之间的关联。基于特定生化或生理功能基因的分子变异将为珍珠粟的下一代分子标记提供依据。这些标记通常被描述为“基于候选基因的”，其优势是它们与控制有关性状变异的位点密切相关，从而允许“完美标记”的发展[17]，用以进行以连结不平衡为基础的绘图研究[18，19]，直接选择等位基因含量较高的基因型[20.]．

EST资源已被证明是许多物种基因发现、分子标记开发、基因表达分析和表型候选基因鉴定的优秀资源[21- - - - - -23]．EST方法对于当目前不可用或以其他方式具有有限的序列信息的基因达特别有用。最近，EST已被用于鉴定许多植物种类，如米饭，玉米，大麦，大豆，甘蔗，甜菜和甜瓜等植物种类中的SNP [24- - - - - -30.]．单核苷酸多态性的丰度、普遍性和分散性，以及自动高通量分析的潜力，使它们成为构建高密度遗传图谱的理想分子标记候选[30.]，候选基因与重要农艺性状的关联分析[19，31]、qtl精细定位[32]、遗传多样性评估[33，34]和标记辅助育种[21，35]．此外，位于已知基因中的SNPs为分析育种群体中重要农艺等位基因的命运提供了一种快速的选择，从而提供了功能标记。

在本研究中，我们已经利用可用的珍珠粟EST序列生成的珍珠小米75新的基于基因标记映射的资源。两个位置和候选基因方法被组合以产生本发明的基于基因图谱。结果地图作为叠加的主要验证DT-QTL [模板4，5，9来识别潜在的候选基因。该方法展示了如何将不同的基因组资源(如est /基因)与传统的遗传和表型数据进行整合，从而提高我们对复杂性状和基因功能的理解。这种基于在植物适应干旱和其他非生物胁迫中具有特定功能的基因的分子图谱，也可能有助于比较其他禾本科植物的远亲基因组的结构和功能。

长度和单核苷酸多态性在作图群体亲本双

利用350条基因特异性引物对4个珍珠谷子自交系H 77/833-2、PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004进行DNA扩增。这些引物中有190对(54.3%)在1%琼脂糖凝胶上显示了强的单重复条带。这190个引物的产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行长度多态性筛选。18条和10条引物分别在h77 /833-2和PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004之间多态性。其余未检测到任何长度多态性，但聚丙烯酰胺凝胶上显示单一单形带的扩增子在4个亲本基因型中进行测序，进行SNP发现。

共检测75个标记的长度和(或)序列多态性。大多数成功的分析(84%)检测到序列多态性，而只有16%表现出长度多态性。共扫描30,480 bp的非冗余序列数据，共鉴定出228个SNP，总频率为每134 bp一个SNP(见表)1）.PRLT 2/89-33和h77 /833之间的SNP检测数量(202)远高于亲本对ICMR01029和ICMR01004之间的SNP检测数量(110)，SNP频率分别为1/150和1/277 bp。在这一组snp中，转换snp占141个(61.8%)，转换snp占87个(38.1%)。在发现SNP的63个基因片段中，23个有一个SNP位点，其余检测到多个SNP位点(表)1）.CISP标记的探针大小在1 ~ 61 bp之间2）.

键映射

所有多态性标记均以共显性方式分离。共133个标记(包括64个框架SSR标记)被分配到7个连锁群(图)1)，指定为LG1-LG7，对应参考地图。基于SNP和CISP的标记均分布在所有7个连锁群上。本研究的主要靶点珍珠谷子的一个主要DT-QTL所在的LG2图谱中包含了24个新的基因标记，其中20个是snp, 4个是CISPs。最重要的是，18个新的基于基因的标记被定位在验证的主要DT-QTL区域(标记间)的支持区间内XPSMP2237-XPSMP2059；数字1)在LG2上，LG2原本只有5个EST-SSR标记的位点在这个区间内作图[36]．最少(2)个基因定位在LG6上。LG1、lgg2、LG3、LG4、LG5、LG6和LG7分别被7、24、10、9、12、2和5个新基因标记定位。SSR、SNP和cisco标记组合图谱总图谱距离为815.3 cM，单个连锁群长度为50.8 cM (LG4) ~ 174.7 cM (LG7)。

h77 /833-2 × PRLT 2/89-33 RIL群体的等位基因频率

有趣的是，扭曲的分离比率在几乎所有连锁群是显而易见的两个框架SSR位点，以及SNP和CISP标记基因座。在每个隔离失真区域（SDR），失真是单向的，只从一个亲本利于等位基因。例如，在LG1有偏析失真之间的主要区xibmsp42和Xipes0098．与介于两者之间的区域相比，PRLT 2/89-33等位基因在这一扭曲区域的代表性更大Xctm12和Xicmp3088其中H 77/833-2等位基因是首选。在LG3上也发现了明显的PRLT 2/89-33等位基因畸变区Xibmsp50和Xipes 0095），LG4（间Xipes0186和Xipes0076), LG5(之间Xpsmp2274和Xibmsp 40）和LG6（间Xicmp3002和Xpsmp2270）.在LG7上，在LG7和LG7之间观察到适度但一致的偏析畸变Xipes0198和Xpsmp2203父本PRLT 2/89-33等位基因的传播频率较高。而在LG2上，h77 /833-2等位基因在两者之间更为突出Xibmsp53和Xibmcp3．

利用精细定位群体验证lg2上的主要DT-QTL

大量标记(XIBMSP27，XIBMSP9，XIBMSP12，XIBMSP60，XIBMSP34，XIBMSP14，XIBMSP24，XIBMSP31，XIBMSP11，XIBMSP15，XIBMCP9，XIBMSP44和Xibmcp11干旱胁迫下，精细作图群体的产量与产量构成因素、开花时间、叶片衰老延迟和卷叶率显著相关。为了说明本研究开发的标记与DT表型共图，仅给出了籽粒产量、开花时间和叶片滚动数据(表)3.）.目前正在进行使用这些标记的DT-QTL的其他产量和生理参数的详细解剖和生理参数，并将分别报告（准备稿件）。

由于基因的多样性及其对表型变异的部分影响，候选基因方法被认为比全基因组扫描或位置克隆更适合QTL表征[37，38]．基于功能基因标记的分子连锁图谱(分子功能图谱)是在分子水平上鉴定数量性状基因的候选基因方法的先决条件。因此，最近在许多物种中生成了植物功能图[28- - - - - -30.]，利用该方法已鉴定出各种生物抗逆性和非生物抗逆性qtl的候选基因[39- - - - - -43.]．考虑到这一点，而事实上，基于基因的SNP信息迄今很少在珍珠粟可用[44.]，本研究旨在开发珍珠谷子的snp定位资源，并鉴定一个主要的已验证的耐旱QTL的候选基因。

以杂交h77 /833-2 × PRLT 2/89-33为基础，将69个基于SNPs和CISPs的基因插入到珍珠谷子现有的ssr骨架图中。虽然在该杂交上较早绘制的标记数量相对较大，但较高比例的标记是匿名序列和/或表现出显性遗传模式[1，6，8]．最近，人们尝试利用共显性基因组和est衍生的SSR标记来丰富现有的珍珠粟图谱[6，7]．基因组SSRs的局限性在于，由于重复区域的消失或引物结合位点的退化，它们的跨物种转移性较低。尽管EST-SSRs的跨种PCR扩增比基因组SSRs更成功，但其多态性率非常低。在这项研究中开发的SNP标记比SSRs提供了许多好处，包括它们在基因组中的丰度，在基因编码区域的频繁出现，以及它们在各种平台上易于分析和明确的结果[35，45.]．单拷贝DNA中的每一个SNP都可能是有用的标记。

在30.5kb序列区域中获得总共228个SNP，导致每134 bp的一个SNP的SNP频率（表1）.在玉米中，像珍珠粟这样的异交物种，通过分析38个自交系中的18个基因片段，观察到SNP频率为每61 bp一个SNP [24]．在玉米的另一项研究中，观察到每73bp每73bp的SNP频率，分析12次近交玉米线中的592个unigenes [46.]．供外种牧草之用Lolium perenne.，在100个候选基因的分析中观察到每54bp每54bp的频率[47.]．在黑麦和甜菜中，估计SNP频率为1 SNP / 58 bp [48.]和每72个碱基1 SNP [41.),分别。因此，珍珠粟的多态性频率低于其他异种。种质选择是影响SNP频率的主要因素之一。在两套不同的玉米种质中，有不同数量的SNP频率的差异被报道[24，49.]．在涉及大量不同种类植物的研究中，普遍报道了较高的SNP频率[24，26，48.，50.]．与其他研究相比，本研究用于SNP发现的基因型数量非常少。此外，本研究使用的4个珍珠谷子基因型中的2个(ICMR 01029和ICMR 01004)是在h77 /833-2背景下产生的QTL近等基因系。影响不同植物物种间SNP频率的另一个重要因素是所检测的基因组区域(如编码区、启动子、内含子或未翻译区)的差异[51.]．本研究中设定的序列对于这些类别中的任何一个都不完整;总的来说，本研究同时针对外显子区域和3' - uts。考虑到这一点，再加上EST序列数量有限，本研究的频率估计可能不能准确反映珍珠粟的真实情况。

在本研究中，从标记发现到遗传图谱分配的耗损水平仅为8个snp(13.3%)。在Lolium perenne.，同样的方法只分配了基因图谱上40%的基因[47.]．基因标记的添加将珍珠粟的遗传图谱扩展了125 cM;SSR、SNP和CISP组合图谱总长度为815.3 cM。最重要的是，63个基于基因的标记被定位到与框架标记不同的位置，从而丰富了新的候选基因位点(图)1）.此外，其中一些候选基因基因座填充了框架图的一些连杆组中存在的大间隙。例如，框架地图在标记之间的LG4上具有最大（54.8cm）间隙Xpsmp2086和Xipes0186．六种基因标记(Xibmsp57、Xibmsp5、Xibmsp6、Xibmcp4、Xibmsp17,Xibmsp22）映射之间Xpsmp2086和Xipes0186LG4(图1）.

有趣的是，在本研究中使用的重组自交系(RIL)图谱显示，框架SSRs和基于SNP和CISP的基因标记都有很高的SDRs率。观察到对亲本等位基因中的任何一个的扭曲。这种由于一个亲代等位基因过多而导致的分离扭曲在之前的珍珠谷子研究中也有报道[5- - - - - -7，9]．Qi等[6例如，由于LG 4，LG5和LG7在LG2和LG4上的LG 4，LG5和LG7上，在LG 4，LG5和LG7上，在LG 4，LG5和LG7上观察到的SDR，由于LG 4，LG5和LG7，在LG2和LG4上的LG 4，LG5和LG7中，观察到的SDR在PT 732B×P1449-2中，在ICMB 841×863B中的LG3和LG6上。然而，与本研究中使用的rils中使用的偏差畸变相比，与之前的所有研究相比，与之前的所有研究相比₂种群使用的5- - - - - -7，9]．与F₂或其他早期代也在其他作物中发现了[52.，53.]．例如，在一项比较研究中，探讨了分子标记在不同作图群体(F₂结果表明，与双单倍体、回交和F₂人口[52.]．有人认为，更多的世代导致更强的选择效应，因此分离畸变随着减数分裂的更多世代积累[53.]．亲本等位基因的优先传递可能是由于等位基因在生存力或育性方面的特异性优势，基因标记可能代表或与用于ril发育的6代中选择的等位基因相连。

LG2，本研究的主要靶点，被24个新的基于基因的标记物饱和(图)1）.其中，20是衍生自编码肌动蛋白解聚因子，PSI反应中心亚基III的基因的SNP，PHY C，肌动蛋白，丙氨酸乙醛酸转氨酶，尿苷激酶，酰基辅酶A氧化酶，二肽基肽酶IV，锌指C×8-C×5-C×3-H（或CCCH型），丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，水稻开花的同系物时间的基因HD3,尼-box，乙酰辅酶A羧化酶，泛素共轭酶，光解，过氧化氢酶，丝氨酸羧III族前体和三个假想蛋白质。上LG2四个CISP标记表示基因编码的叶绿素a / b结合蛋白，蛋白磷酸酶1个调节亚基SDS22，跨膜氨基酸转运和磷酸甘油酸激酶。所述珍珠粟SNP的地图为LG2是通常与染色体级珍珠粟水稻同线性一致（珍珠粟LG2同线水稻染色体2S，3L，6S和10S）预先用RFLP标记[确定3.]．例如，从水稻染色体2s检索的三个基因（丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶，LOM_OS02G57080;丝氨酸羧肽酶III前体，LOM _OS02G02320;磷酸糖激酶，LOM_OS02G07260）和三种其他来自6S（酰基COA氧化酶，LOM_OS06G01390;锌指C-×8-C-×5-C-×3-H型，LOM_OS06G21390;跨膜氨基酸转运蛋白，LOM_OS06G12320）映射在LG2的珍珠米上。除了LG2，本研究中观察到的珍珠米米同步也与之前的研究相一致[3.]用于其他连接组。然而，从水稻中检索到的少数位点被定位到珍珠谷子连锁群的非同位。例如，来自水稻染色体1S和5S的尿苷酸激酶和乙酰辅酶a羧化酶分别被定位到珍珠粟的LG2上。同样，水稻5l染色体液泡atp酶C亚基定位于珍珠谷子LG4上。据报道，在大麦等其他作物中也发现了这种现象[28]和高粱[54.这并不奇怪，因为水稻基因组经历了大规模的片段性和单个基因复制，大部分是在水稻和小麦科祖先分化之后。

利用目前的共识图谱与其他珍珠谷子连锁图谱的共同标记，将主要的dt - qtl位置添加到目前的功能图谱中，以鉴定潜在的耐旱候选基因(图)1）.18个基于基因的标记定位在LG2的主要DT-QTL区域的支持区间(图)1）.其中，有10个基因已被报道在调控中发挥重要作用[转录因子如锌指C × 8-C × 5-C × 3-His型(或CCCH型)，疯了-box]、信号转导(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白磷酸酶1调节亚基SDS22)、能量和碳代谢(光合作用、光呼吸和β-氧化基因，如PSI反应中心亚基III、叶绿素a/b结合蛋白、丙氨酸乙醛转氨酶、酰基辅酶a氧化酶)、在干旱和渗透胁迫下嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成(尿苷酸激酶)和脂质生物合成(乙酰辅酶a羧化酶)[55.- - - - - -63]．存在Zn指型和CCCH型的转录因子疯了-box基因家族在主要DT-QTL支持区间值得注意。据报道，这些转录因子基因家族可以激活下游基因的级联，共同作用增强对多重压力的耐受性[57.，61.- - - - - -65]．在不同类型的Zn手指家庭中，C的作用₂H₂在水稻和拟南芥中，锌指型基因家族的抗旱性已经得到了功能验证[64，65]．然而，CCCH型锌指蛋白在干旱胁迫下的植物中缺乏特征。植物中特征最明显的ccch型锌指蛋白是水稻中的OsDOS [66]、拟南芥AtSZF1和AtSZF2 [56.]和ghzfp1在棉花[67在盐和真菌胁迫下。珍珠粟的CCCH型锌指与环指型锌指具有显著的同源性_3.H_41.和空中交通管制_3.H₆₉稻米（Blastx; 2E-100）和拟南芥（Blastx; 1E-65），其成员据报道，各种生物和非生物应激，包括甘露醇诱导的水应激[68]．

这疯了-box家族，最初被鉴定为花同源基因，是植物中研究最广泛的转录因子基因家族之一[57.，69]．最显著的特征疯了-box基因家族是指其成员在植物生长发育的不同方面承担的不同功能，包括控制开花时间[69]．据报道，疯子家庭的不同成员在水稻干旱胁迫下诱导[57.，70]，玉米[71]和小麦[72]．珍珠谷子MADS box基因与MIKC型MADS-box基因具有显著的同源性Triticum Aestivum.(BlastX;2 e15汽油),Zea Mays.（MADS22BlastX;2 e15汽油)和毛花瓣（MADS22BlastX;4 e15汽油)。MADS22在水稻中的同源物，OsMADS22，据报道，在对脱水压力的反应中，其上调幅度超过两倍[57.]．在珍珠粟里，多态在疯了盒基因MADS11已被报道与花期变化有关[73]．研究表明，参与花发育的大量基因与非生物应激反应相关[74，75]．MADS的显著关联box基因与干旱胁迫下开花在珍珠粟时间和产量的QTL（表3.）认为这是珍珠粟为DT-QTL另一个强有力的候选基因。

同样，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酰基辅酶a氧化酶在DT-QTL区间的候选性也得到了珍珠谷子中这些基因表达证据的支持[76]．在干旱胁迫下，珍珠谷子幼苗中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酰基辅酶A氧化酶的表达均增加了10倍[76]．另一个在DT-QTL支持区间定位的重要基因是乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的编码基因。在植物中，ACC同工酶提供丙二酰辅酶a库德诺维质体和线粒体中脂肪酸的合成，以及细胞质中脂肪酸伸长、类黄酮和二苯乙烯的生物合成[77]．ACC反应是应激反应中最重要的调节步骤，控制代谢产物的流动。从水分亏缺胁迫耐受性的角度来看，脂肪酸在膜生物发生、硫辛酸和角质层蜡的合成和胁迫信号传递中是必不可少的[78]．

本研究鉴定的候选基因与干旱胁迫下籽粒产量、开花时间和叶片滚动的qtl显著相关(见表2)3.）因此，在珍珠米中与耐旱耐受表型进行缔合（表3.）.候选基因的这种映射还提供给其它生理[一系列可能的链接79]和农学的[4，5，15包括耐盐性[80]与主要LG2 DT-QTL区域共同地图。在其他作物中使用类似的方法来寻找QTLS下面的位置候选基因[28，40，42.，81]．例如，以马铃薯碳水化合物代谢和运输相关的69个基因为基础，构建了85个位点的分子功能图谱，以确定马铃薯淀粉含量的候选基因[81]．同样，将16个转录因子基因整合到大麦框架图上，将耐旱耐寒qtl定位到共识图上，寻找耐旱耐寒的定位候选转录因子[42.]．在后者的研究中，重点是转录因子和上游调控因子，而不是结构基因。然而，在本研究中，我们收集了结构因子和转录因子基因的序列，以获得更完整的珍珠谷子DT-QTL区间和整个基因组的非生物胁迫基因分布。

该分子功能图谱的构建为探明珍珠粟的非生物胁迫qtl候选基因和其他重要农艺性状的候选基因奠定了重要的基础。此外，它还提供了一种跨不同谱系锚定映射的方法在Silico.比较基因映射。先前报道的抗旱性主要qtl在本图上的位置揭示了一些有趣的候选位置。目前，我们正在珍珠谷子自交系种质协会中研究这些LG2候选基因的多态性，这将进一步验证它们在更广泛的物种种质中与抗旱性相关性状的关联。我们未来的工作还包括在敲除突变体和转基因中使用过表达、反义抑制和(或)双链RNA干扰等方法对这些候选基因进行功能验证。

植物材料和绘图群体

用于SNP和CISP发现的珍珠粟自交系分别为:h77 /833-2、PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004。终末耐旱品种PRLT 2/89-33在终末干旱胁迫条件下具有较好的灌浆能力。h77 /833-2(末端干旱敏感)是一些耐热、超早、高分蘖、高产的珍珠粟杂交种的父本，原产于印度西北部。ICMR 01029是一个近等基因系，通过4代标记辅助回交，在h77 /833背景的LG2上导入PRLT 2/89-33等位基因，获得一个主要的抗旱性QTL。ICMR 01004是利用LG1和lg4抗霜霉病QTL的标记辅助回交转移，在h77 /833-2背景下开发的另一个QTL渐渗系[82]．一架F₆从单个f的单种子血统来源的群体₁来自Cross H 77 / 833-2×PRLT 2 / 89-33的植物，用于映射基于基因的标记。为人口筛查和地图建设而受雇了八十八条左右。

利用两个近等基因系(NILs)的杂交，建立了一个高分辨率杂交(HRC)，以精细定位主要耐旱性(DT) QTL;ICMR 01029和ICMR 01004)，分离到lg2上的DT-QTL区域[82，以验证本研究开发的基于基因的标记与DT-QTL的关联。短句来源简要地说，利用6个SSR标记对2500个HRC个体进行基因分型，利用本研究开发的针对目标DT-QTL区域的基因标记对160个信息最丰富的重组进行基因分型，并对其在干旱胁迫下的响应进行表型分析[82]．

用DNeasy植物DNA试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)提取亲本和ril的基因组DNA。

引物设计

我们的主要目的是产生用于验证的主要DT-QTL的精细作图基于基因的标志物上使用LG2测交后代从横ħ最初检测到的77 / 833-2×PRLT 2 / 89-33 [4]．为了用基于基因的标记来饱和LG2，我们利用了珍珠谷子LG2与水稻染色体2S、3 L、6S和10 L之间的同步信息[3.，82]．100选择基因在水稻的基因组序列细菌人工染色体(BAC)重叠群的四个syntenic水稻染色体(水稻标记之间C1246 C630 2 s, C136和RZ624 3 L, PSR 490和C235 6 s和R2447和C1361之间10 L)被使用TIGR水稻基因组注释项目门户http://blast.jcvi.org/euk-blast/index.cgi?project=osa1．这些基因大部分与细胞代谢、信号转导和/或转录调节有关。对与珍珠谷子est具有显著同源性(e值为1e-10)的基因进行引物设计。利用MACAW version 2.05预测外显子-内含子边界后，设计的引物平均长度为20个核苷酸，GC含量为50±5%，熔点温度为60℃左右，预期PCR产物为400-800个，涵盖外显子和内含子。引物质量如3'端互补，存在发夹环使用在线寡核苷酸计算器http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html．对于可用的珍珠米特序列对底漆设计，高粱和玉米EST有助于的基因（确定使用上的所有记录选择在TIGR水稻基因组注释项目门户网站)设计合适的引物。

除了用基于基因的标志物饱和Lg2之外，我们还旨在基于非生物应激响应基因的SNP地图，其可以是先前在珍珠米中报道的生物或非生物胁迫QTL的候选者的候选者[4，5，9- - - - - -14]．为了识别这些基因，我们使用了另一种基因在Silico.方法，其中我们确定了来自NCBI的200颗珍珠米特http://www.ncbi.nlm.nih.gov/利用BLAST2GO项目，在其他模型或非模型作物中广泛报道了与干旱和其他非生物胁迫基因同源的数据库http://www.blast2go.org/．对这200条est序列，利用Batch Primer 3软件设计引物http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html.扩增平均400 bp的区域，覆盖部分3'非翻译区(3' utr)。预计3' utr区域具有更大的序列多态性，因此3'-最多的500 bp作为引物设计的目标。设计的引物平均长度为20个核苷酸，熔点温度为58℃或60℃，理论PCR扩增产物为150- 600bp。此外，一套已发表的50种crisp引物[83在4个基因型(H 77/833-2、PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004)中检测snp和插入缺失(Indels)。

PCR扩增

所有的PCR反应都是在20 μl的PCR反应混合中使用20 ng的基因组DNA进行的Taq聚合酶，1.5 mM氯化镁₂，四个DNTP中的100μm，和每个前向和反向引物中的5pmol。用于大部分底漆对的PCR循环包括在95℃下初始变性步骤3分钟，然后在95℃下在95℃下进行10个循环，从63-58℃下，对于20 s（0.5°C每循环减少），72°C为80秒。接触向下之后是36个95℃的循环，20s，58℃，20s，72℃，80秒。在这些一般条件不起作用的情况下，通过将周期数延伸至40（没有初始接触循环）并通过从55至60°C的退火温度变化来修改它们。

基因多态性和基因分型的检测

在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解PCR产物，并通过银染色可视化[84]．选择4个亲本之间无长度多态性的扩增产物进行测序。测序用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, UK)对PCR产物进行纯化。测序使用ABI Prism大染料终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems, CA, USA)和ABI Prism 377基因分析仪(Applied Biosystems)。PCR产物均进行正向和反向测序。利用MACAW 2.05软件对4个基因型(h77 /833-2、PRLT 2/89-33、ICMR 01029和ICMR 01004)的序列进行比对，并进行snp鉴定。假定的SNP位点使用Chromas 1.45程序在序列色谱图上直接目视验证。从亲本中排除杂合位点进行SNP鉴定。

用于基因分型用CISP标记的映射群（第一页之间的父母之间的大小多态性），在前后引物的5'末端加入18核苷酸M13尾序列（5'cacgacgttgtaaaacGAC3'），以促进用荧光团标记PCR产物- 标记为M13底漆。使用的荧光团为6-FAM，NED，VIC和PET（应用生物系统，福斯特城，USA）。用于M13尾的PCR反应的程序包括在94℃下的变性10分钟，然后在94℃下在56℃下在72℃下为30秒，在72℃下的55秒，进一步接下来是8个循环30s在94℃，45℃，45℃，45秒，以72℃以72℃的延伸步骤结束10分钟。在ABI 3730DNA测序仪（应用生物系统，福斯特城，USA）上分解PCR产物后，Genemapper计划，3.7版（应用生物系统，福斯特城，USA，USA）用于评分等位基因。

对于SNP基因分型，使用KASPar技术对每个包含SNP的位点只使用一个SNP进行基因分型(K Biosciences, UK)。

遗传映射，QTL位置的比较和标记性关联分析

在88个作图群体的ril上进行SNP和CISP标记的基因分型。标记基因分型数据使用χ²测试以评估每个标记的拟合优度，以达到预期的1:1分离比率。随后，使用JoinMap软件3.0版本进行连锁分析，对所有标记(包括扭曲分离标记)的基因分型数据进行连锁分析[85]．(h77 /833-2 × PRLT 2/89-33) RIL作图群体的基因组骨架图谱及EST-SSR标记[36]，用于七个珍珠粟连锁群的鉴定和定位。标记物在LOD = 6处分组，利用Haldane函数确定每个连锁组的图谱位置。我们考虑了连锁组内r = 0.4999以内的所有重组率，以便纳入更远处、联系不紧密的位点，因此将LOD阈值设置为0.0001的最小值。进一步选择的参数包括RIPPLE值为1,JUMP THRESHOLD值为5，以及TRIPLE THRESHOLD值为5。在LOD 3.0时，使用MAPMAKER 3.0再次确定各组标记的顺序，并使用ripple命令对顺序进行测试。然后用MapChart程序绘制地图[86]．使用先前映射的SSR基因座测定七个连杆基团的身份和极性[6，7]．

计算每个标记位点的等位基因频率，以评估每个亲本等位基因在RIL群体中每个基因型位点的预期0.5传播频率的偏差程度。对所有具有分离数据的标记进行分析，包括骨架图中的SSR标记。

通过本地图和珍珠粟发表图谱之间的标记共同的关系，主要DT-QTL的LG2上的位置已被添加到地图中。协会，如果有的话，基于基因标记（本研究开发）的耐旱表型是使用专门开发的罚款作图群体对LG 2映射耐旱QTL区域追捧82]．标记-性状分析在F₂在MINITAB (ver)中使用方差分析(ANOVA)特征完成精细映射人口。14)。根据标记基因型(AA、BB、HH)将重组子分为3类;A为ICMR 01029等位基因，B为ICMR 01004等位基因，H为杂合子)。然后对26个标记的表型进行单因素方差分析。

DT:

耐旱

QTL:

数量性状位点

SNP:

单核苷酸多态性

CISP：

保守的内含子跨越引物

RFLP:

限制性片段长度多态性

妊娠:

扩增片段长度多态性

SSR：

简单的序列重复

省:

多样性阵列技术

美国东部时间:

表达序列标签

格林:

连锁群

特别提款权:

隔离变形区域

瑞来斯:

重组自交系

人权理事会:

高分辨率的十字架。

作者希望感谢生物技术与生物科学研究理事会(BBSRC)和国际发展部(DFID)通过拨款号BB/F004133/1资助他们的工作。

从属关系

1. 阿伯里斯特威斯大学生物、环境与农村科学研究所，Gogerddan, Aberystwyth, Ceredigion, EB, SY23 3，英国

   Deepmala Sehgal，Ian Peter Armstead＆Rattan Singh Yadav

2. 国际作物研究所的半干旱热带地区（ICRISAT），ICRISAT-PATENCHERU，HYDERABAD，ANDHRA PRADESH，印度502 324

   Vengaldas Rajaram，Vincent Vadez＆Charles Thomas Hash

3. Chaudhary Charan Singh Huryana农业大学（CCShau），Bawal，Haryana，123 501，印度

   亚许朋友亚达夫

相应的作者

对应到藤唱歌yadav.．

作者的贡献

DS设计了基于基因的标记，进行了所有的实验和分析工作，构建了整合图谱并撰写了手稿;虚拟现实开发EST-SSRs;国际摄影学会为地图建设做出了贡献;CTH提供了框架EST-SSR图谱，并对手稿进行了编辑;VV和YPY批判性地阅读了手稿，并参与了基于基因标记的性状定位的讨论;RSY参与了它的设计，并帮助起草了手稿。所有作者均已阅读并批准本稿件。

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