II型NAD(P)H脱氢酶的双靶向能力在陆生植物进化的早期就出现了

背景

II型NAD(PH)脱氢酶位于植物、真菌、原生生物和一些原始动物的线粒体内膜上。然而，最近的观察发现几个拟南芥II型脱氢酶是双靶向蛋白。以线粒体和过氧化物酶体或线粒体和叶绿体为目标。

结果

在各种植物中都发现了ND蛋白家族的成员。对所有蛋白质进行了系统发育分析和亚细胞靶向预测。将拟南芥、水稻和小立碗芥三种模式植物的所有ND蛋白克隆为N端和c端GFP融合蛋白，并测定亚细胞定位。植物II型脱氢酶的双靶向性被观察到在植物进化的早期就已经进化了，并且在不同的植物物种中广泛存在。在所有三个物种的测试中，都发现至少一种NDA和NDB类型的蛋白质对线粒体和过氧化物酶体具有双重靶向作用。另外，在小立碗菌中还发现了两种NDB型蛋白，可靶向叶绿体。研究发现，NDC型蛋白的双靶向作用在植物进化的后期才发生。

结论

II型脱氢酶在植物细胞中的功能将必须根据这个新确定的亚细胞靶向信息重新评估。

真核细胞是由称为细胞器的亚细胞隔间定义的，细胞器的存在允许各种生化途径从胞质环境中分离出来。每个细胞器都包含一种特定的蛋白质补体，在细胞结构中起着特殊的作用。然而，虽然人们认为特定的蛋白质只靶向于一个细胞器，称为定位特异性蛋白质，但现在已经发现大量的蛋白质靶向于多个细胞器，因此被称为双靶向蛋白质。在植物中，已有超过250种蛋白质被鉴定为双靶向蛋白1)[1，2]，其中大部分靶向于线粒体和质体。然而，近年来，蛋白质的双靶向作用也被证明发生在一些额外的细胞器之间，包括:线粒体和过氧化物酶体[1，3.- - - - - -7]、质体和过氧化物酶体[8- - - - - -10]、质体及细胞核[11]、质体和内质网[12]、线粒体和细胞核[3.，13，14]、细胞骨架和过氧化物酶体[15]、线粒体和细胞质[16]、质体和细胞质[17］．

线粒体呼吸是植物代谢的重要特征，在氧化磷酸化过程中产生ATP。除了与磷酸化相耦合的经典电子传递链外，植物线粒体还包含一个非磷酸化途径。这种替代途径的一个主要组成部分是II型或鱼藤酮不敏感的NAD(P)H脱氢酶(ND)。II型ND蛋白首次在马铃薯中发现[18]在真菌、原生生物、一些细菌和一些原始动物中也有发现[19］．这些II型ND蛋白的功能是，当它们与替代氧化酶(AOX)连接时，它们构成了一个非磷酸化的呼吸通路，使细胞的氧化还原状态逃避腺苷酸的控制[20.］．改变II型ND蛋白的表达或使其失活的特定研究表明NAD(P)H氧化能力的作用(nda1)[21];活性氧的形成和表型的改变(ndb4)[19］．

近年来，植物II型ND蛋白的亚细胞定位一直是一个争论的话题。最初的在活的有机体内GFP研究涉及从五个拟南芥ND蛋白融合到GFP的靶向信号，确定了所有蛋白质位于线粒体[22］．独立分析使用在体外对分离线粒体的导入分析确定三个ND蛋白(NDB1, NDB2和NDB4)位于线粒体内膜的外部，其中三个被定义为内部的(NDA1, NDA2和NDC1) [23］．最后一个蛋白NDB3无法克隆，被认为是一个假基因[23]，尽管最近在发芽过程中的转录组分析表明NDB3在发芽非常早的时候表达[24］．然而，随后的研究发现，拟南芥ND蛋白实际上是双靶向的，NDA1、NDA2和NDB1被发现对线粒体和过氧化物酶体具有双靶向作用[25]和NDC1，被确定为靶向线粒体和质体[25，26］．这些研究的不同结论可以很容易地得到一致，因为最初的研究只使用c端GFP标签与目标蛋白的前50到100个n端氨基酸[22］．然而，为了确保靶向信号不被删除或阻塞，N端和c端GFP标记都是必要的[9，25］．同样，对于双靶向蛋白，成熟蛋白或乘客蛋白似乎可以影响对线粒体和叶绿体的靶向[27所以应该测试完整长度的编码序列，以确定完全的靶向能力[25］．

虽然需要使用两种或两种以上的互补方法来确定亚细胞定位[28]，这对于在多种植物系统中的双靶向蛋白来说是很困难的，需要异构体特异性抗体和细胞器的高纯度。除了拟南芥的蛋白质和细胞器外，这些工具并不存在。在拟南芥中已知的双靶蛋白中，只有29%已经通过2种或2种以上的方法验证1165种蛋白质中的46种)。当我们观察蛋白质组学技术在两个靶细胞器中识别的双靶蛋白时，这个数字下降到15%1165种蛋白质中的24种)。到目前为止，发现双靶蛋白最好和最广泛使用的技术是荧光标记(92%，附加文件1165种蛋白质中的152种)。到目前为止，没有使用GFP标记的双靶向病例被证明是人工制品，尽管可能存在假阴性率，但由于上述结构的性质，假阳性迄今尚未报道。此外，在评估靶向性时，预测和系统发育比较为评估靶向性提供了额外的途径，并与GFP标记一起，可用于确定各种植物物种中蛋白质的靶向能力，在这些情况下，直接使用基因家族的生化方法是不可行的。

鉴于拟南芥中特定ND基因的失活导致表型改变[19因此，对ND蛋白在各种植物中的位置有一个更广泛的认识是很重要的，因为只有在位置已知的情况下才能正确地确定功能。为了更好地了解植物II型ND蛋白的靶向性，进行了一项研究，以确定所有ND蛋白的亚细胞定位(s)栽培稻(大米)和Physcomitrella金属盘因此，为了获得ND蛋白双靶向的系统发育视图，使用GFP融合蛋白分析亚细胞定位。

系统发育分析和亚细胞靶向预测

此前，我们已经确定了一些ND蛋白来自拟南芥双靶向于多个位置，包括:线粒体和过氧化物酶体或线粒体和质体[25］．为了更好地了解这种双重靶向能力的广泛程度，我们从许多植物物种中识别了所有的ND型蛋白质，利用各种亚细胞预测程序对每个正交序列进行预测，并根据几个预测程序识别了任何过氧化物酶体1型靶向序列(PTS1) [29，30.]和AraPerox数据库[31)(图1和额外的文件2)．系统发育分析显示，所有的ND同源动物都聚集成三个不同的分支(图1)．类型A, B和C(分别用绿色，红色和蓝色表示)。研究发现，A型ND蛋白(绿色)主要被预测靶向于线粒体，这与之前拟南芥的数据一致，NDA1和nda2都具有可切割的线粒体n端靶向信号[23］．然而，有趣的是，每个高等植物物种中至少有一个NDA同源物似乎在它们的c端有PTS1信号。使用的预测程序都没有预测过氧化物酶体靶向小立孔菌(Pp)或衣藻(Cr)的NDA蛋白。

在NDB类型的蛋白质中，预测线粒体靶向的频率较低(图1和额外的文件2)．这可能是由于NDB蛋白不包含可切割的n端线粒体靶向信号，这是所使用的预测程序的基础[23］．然而，大多数(29个中的22个)的NDB蛋白，从小立碗菌到杨树也包含预测的PTS1序列。值得注意的是，NDA和NDB蛋白的PTS1序列在所有物种中都不是保守的。事实上，不同物种的PTS1序列在组成最后一个c端三肽的氨基酸方面是完全不同的;然而，属性保持不变。这表明NDA和NDB蛋白的c端区域对催化功能不是至关重要的。NDC型蛋白质，因其与蓝藻NADH脱氢酶的相似性而得名，并且大多被预测是针对质体的[22)(图1)．没有PTS1序列被预测。这与拟南芥NDC1的定位一致，据预测NDC1是可塑性的，但实验表明它同时靶向于线粒体和质体[25，26］．

NDA蛋白的亚细胞靶向

此前，通过gfp标记和western blot分析表明，拟南芥中的两种NDA蛋白(AtNDA1和AtNDA2)对线粒体和过氧化物酶体具有双重靶向作用[25］．为了证明含有n端线粒体靶向信号和c端PTS1序列的双靶向蛋白所预期的荧光模式，我们在水稻和小立碗菌NDA同源物的分析中包含了拟南芥蛋白。当GFP被放置在AtNDA1和atnda2的c端时，嵌合蛋白在拟南芥细胞悬液和洋葱表皮细胞中都靶向于线粒体(图2)，通过GFP与来自线粒体对照的RFP信号的重叠可见。在大多数情况下，GFP信号在线粒体周围呈光晕状。据推测，这是GFP没有完全被拉入线粒体时的结果，此前也曾观察到AtNDA和AtNDB蛋白[25]，也可通过线粒体外膜蛋白的GFP标记观察到[36］．然而，在本例中，由于已知NDA蛋白位于细胞膜内，因此有可能NDA蛋白的c端位于膜间空间(IMS)，并可能产生类似的结果[4］．与完整的c端融合相比，AtNDA1和AtNDA2被截断到GFP c端融合的最后10个氨基酸(选择10个氨基酸与之前拟南芥ND靶向研究一致，也与之前的过氧化物酶体蛋白靶向研究一致，也使用了最后10个氨基酸)，被发现仅靶向过氧化物酶体(图)2)．在两种测试的组织类型中都观察到这种共定位。

当用同样的方法分析水稻的两种NDA蛋白(OsNDA1和2)时，得到的结果略有不同。当GFP融合到其c端时，OsNDA1被观察到靶向于线粒体(图2)，然而当最后10个氨基酸融合到GFP的c端时，没有观察到任何不同的细胞器(图2)，与OsNDA1不包含预期的PTS1信号的事实一致。当对OsNDA2的靶向性进行测试时，可以看到它同时靶向于被测试组织中的线粒体和过氧化物酶体(图2)．因此，至少有一个水稻NDA蛋白显示出双重靶向能力。为了确定Physcomitrella NDA1和NDA2是否也具有明显的双靶向能力，我们进行了相同的一组实验。在洋葱表皮细胞和拟南芥细胞悬液中，小立孔菌NDA蛋白(PpNDA1和PpNDA2)都显示出对线粒体和过氧化物酶体的双重靶向能力(图)3.)和AtNDA1、AtNDA2和OsNDA2一样。然而，基于生物信息学分析，PpNDA1和PpNDA2靶向过氧化物酶体是令人惊讶的，因为它们不包含任何PTS1信号，也不预测它们是过氧化物酶体(图1)．为了测试这种过氧化物酶体靶向是否为伪产物，我们在小立孔菌的组织中表达了小立孔菌的NDA融合，从而消除了跨物种干扰引起的任何错误靶向。同样，PpNDA1和PpNDA2都对线粒体和过氧化物酶体具有双重靶向作用(图3.)，表明NDA型蛋白的双重靶向作用在陆生植物进化的早期就出现了。

NDB蛋白的亚细胞靶向研究

三种拟南芥NDB蛋白(AtNDB1、AtNDB2和AtNDB4)此前已被确定为线粒体蛋白[22，25]，这在本研究中得到了证实(图4)．然而，AtNDB1的最后10个氨基酸融合到靶向过氧化物酶体的GFP的c端，而AtNDB2和AtNDB4的最后10个氨基酸没有靶向任何不同的细胞器，呈现胞浆状，表明没有靶向性(图4)．这证实了AtNDB1对线粒体和过氧化物酶体具有双重靶向作用，而AtNDB2和AtNDB4只能靶向线粒体。为了确定NDB蛋白的双靶向是否也发生在水稻中，还分析了两个水稻同源基因(OsNDB1和OsNDB2)。观察到OsNDB1和OsNDB2都能将GFP靶向到线粒体，并且在所有测试的组织中，最后10个氨基酸都能将GFP靶向到过氧化物酶体(图4)．这表明在水稻和拟南芥中，NDB蛋白的双重靶向性是保守的。

与水稻和拟南芥不同，小Physcomitrella含有三个NDB同系物(PpNDB1、PpNDB2和PpNDB3)，当GFP融合到它们的c端时，GFP在拟南芥细胞悬液中以独特的光晕样荧光定位于线粒体(图5)．然而，当同样的结构在洋葱表皮细胞中表达时，PpNDB1和PpNDB2出现了完全不同的情况。PpNDB1和PpNDB2不仅可以靶向线粒体，还可以靶向GFP到质体(图5)．对于PpNDB3，仅观察到线粒体靶向(图5)．当PpNDB1、PpNDB2和PpNDB3的最后10个氨基酸融合到GFP的c端时，PpNDB1和PpNDB2都能将GFP靶向到过氧化物酶体上，PpNDB3表现出将GFP靶向到细胞质上(图5)．用小立碗菌组织重复GFP测定(图6)，正如在洋葱表皮细胞和拟南芥细胞悬液中所见，PpNDB1和PpNDB2都能够将GFP靶向于线粒体、质体和过氧化物酶体(图6)．PpNDB3仅被观察到将GFP靶向于线粒体，即使是在同源系统中(图6)．PpNDB3的c端缺乏过氧化物酶体靶向性并不奇怪，因为没有预测到PTS1序列(图1)．然而，PpNDB1和PpNDB2靶向质体是出乎意料的。然而，它们与衣藻NDA2蛋白密切相关(图1)，它已被证明是一种单一的可塑性蛋白质[32，33］．值得注意的是，与拟南芥相比，physcomitrela的NDB蛋白在n端也相当长3.)，这意味着附加的目标信息，并且由于模糊目标预测器(ATP)预测PpNDB1和PpNDB2都是双重目标(图1和额外的文件2)．

NDC蛋白的亚细胞靶向

系统发育分析表明，在NDA、NDB和NDC蛋白组成的三个分支中，NDC是最古老的类群，在进化早期就出现了分支。关于NDC蛋白的靶向能力，在拟南芥、水稻和小立碗菌中仅发现一个同源物。当拟南芥NDC1 (AtNDC1)与GFP融合表达时，出现了两种不同的模式。在拟南芥细胞悬浮液中可以观察到一个清晰的塑料定位，然而，在洋葱表皮细胞中可以观察到明确的靶向线粒体和质体(图7)．由于AtNDC1先前被证明可导入分离的拟南芥线粒体中[23，25，26可以得出结论，AtNDC1对线粒体和质体具有双重靶向作用[25，26］．

为了确定NDC1的双重靶向何时出现，我们分析了水稻(OsNDC1)和小立碗菌(PpNDC1)的靶向能力。对于OsNDC1，我们看到了与AtNDC1相似的模式，即在拟南芥细胞悬浮液中观察到质体靶向性，并且在洋葱表皮细胞中双靶向于线粒体和质体(图7)．对于PpNDC1，在拟南芥悬液和洋葱表皮细胞中只观察到质体靶向(图7)．GFP标记小立碗菌组织中的PpNDC1仅导致质体靶向(图7)．这些结果表明，在小Physcomitrella等低等植物中，NDC1蛋白仅靶向于质体，而在拟南芥和水稻等高等植物中，NDC1蛋白在植物进化过程中获得了靶向于线粒体的能力。

本研究的目的是确定植物ND蛋白在陆生植物中的靶向能力。水生绿藻和陆生植物在10亿多年前就分化了[37］．对衣藻ND蛋白编码基因的检测发现了5个基因。衣藻和高等植物NDA蛋白最接近的同源蛋白是CrNDA1(图1)．CrNDA1已被确定为线粒体内蛋白，在缺乏复合体I的情况下参与线粒体基质NADH的氧化[34］．在本研究中，我们观察到PpNDA1和PpNDA2都是双靶向于线粒体和过氧化物酶体(图3.)，表明NDA的双重靶向作用在陆生植物进化的早期就出现了。虽然PpNDA1和PpNDA2中的三肽SRF预计不会直接过氧化物酶体导入(附加文件2)，已被实验证实为植物PTS1三肽[30.，38］．预测和实验数据之间的靶向性矛盾可能是由于对于非规范的PTS1三肽的靶向能力很大程度上取决于上游序列[39］．非规范PTS1蛋白预测不准确的原因是含有规范PTS1三肽的蛋白在数据集中占主导地位，其中大多数缺乏上游增强序列用于靶向[30.，39］．在拟南芥和水稻等被子植物中，NDA蛋白的双靶向作用不仅是保守的，而且过氧化物酶体靶向作用通过获得规范的PTS1靶向信号而“加强”。AtNDA1、AtNDA2和OsNDA2中均含有PTS1三肽SRI;许多已知的以过氧化物酶体为靶点的蛋白质的一个特征[38］．综上所述，虽然不能精确地确定陆生植物获得双目标能力的时间，但它发生得较早，且具有保守性。

衣藻和高等植物NDB蛋白之间最接近的同源NDB是CrNDA2(我们保留了以前的出版物中的名称，但它与NDB家族聚集在一起(图1))。已有研究表明，CrNDA2位于质体的类囊体膜内，对衣藻非光化学质体醌还原和相关过程至关重要[32，33］．质体定位是有趣的，因为小立孔菌NDB蛋白(PpNDB1和2)也靶向质体(图5而且6)，除了线粒体和过氧化物酶体。据推测，与拟南芥和水稻NDB蛋白相比，衣藻单胞菌和小立孔菌蛋白质能够靶向质体，因为它们包含一个n端延伸3.)．这个扩展范围从衣藻中的26个氨基酸到PpNDB1和PpNDB2中的60个氨基酸;它可能为质体携带额外的靶向信号。关于植物NDB蛋白的过氧化物酶体靶向作用，我们也可以假设这种靶向能力在植物进化的很早就出现了。分析CrNDA2的c端端，虽然预测不出它是过氧化物酶体，但它确实包含三肽SRV，之前已经证明它可以靶向过氧化物酶体[38］．然而，以往的研究只对分离的质体和线粒体进行western blot，没有进行过氧化物酶体的检测[32，33］．有可能即使在衣藻中，NDB型蛋白也具有过氧化物酶体靶向能力。在质体靶向方面，这种能力在拟南芥和水稻的高等植物中已经丧失，可能是由于衣藻单胞菌和小立孔菌序列中n端延伸缺失所致。质体靶向性缺失的一个可能原因是，在高等植物中，质体含有一种I型ND，它在非光化学质体醌还原中起作用，然而，这类基因在许多绿藻基因组中是不存在的，包括衣藻[40］．小立菌属的情况可能是中间形式，因为小立菌属同时包含I型和II型ND蛋白。这与植物从质体中只有II型ND蛋白开始，然后获得I型ND蛋白，这将促进II型ND蛋白的损失是一致的。因此，NDB样蛋白在高等植物质体中的作用就显得多余了。

NDC型蛋白质的进化史似乎更简单，因为每个植物基因组只编码该基因的一个副本。然而，这些蛋白在不同模式植物中的靶向能力是不一样的。目前，尚没有针对高等植物中与NDC蛋白最接近的同源物衣藻CrNDA5的靶向研究数据。最近，人们对AtNDC1在质体中的作用进行了分析。AtNDC1被发现参与了质体醌类似物的还原在体外并影响整个塑醌池的氧化还原状态在活的有机体内［26］．AtNDC1也被证明是正常铂色-8积累所必需的，并且是维生素K(1)产生所必需的[26］．AtNDC1也被发现与质体内的质体球蛋白有关[41，42］．人们很容易推测，NDC1蛋白在所有植物物种中都具有相同的功能，但目前还没有关于NDC1蛋白在拟南芥以外的功能数据。然而，事实是，在所有被分析的物种中都发现了一种NDC1蛋白1)表明它在植物中确实具有必要的功能。看来，NDC1蛋白的靶向能力和AtNDC1的功能数据支持了NDC1蛋白的线粒体靶向是一种新获得的现象的假设。然而，NDC1蛋白在线粒体内膜中的确切作用尚未确定。

植物ND蛋白对线粒体(和叶绿体)和过氧化物酶体的双重靶向作用似乎在植物进化的早期就出现了。我们目前还不能准确地确定这一日期，因为我们不能排除NDA和NDB类型蛋白质的可能性衣藻reinhardtii靶向过氧化物酶体。根据小立碗菌中ND蛋白靶向过氧化物酶体的结果，缺乏预测的PTS1序列不足以可靠地说ND蛋白不靶向过氧化物酶体。因此ND蛋白来自衣藻reinhardtii也可能靶向过氧化物酶体。

许多研究试图确定II型ND蛋白在高等植物中的细胞作用。通过利用不同ND蛋白的过表达和失活，已经证明ND蛋白在NAD(P)H氧化能力中发挥作用(nda1)[21]，调节叶片NADPH/NADP +总比值(NDB1过表达子)[43]、活性氧形成及耐盐性(ndb4)[19］．ND蛋白的功能被假设为一个专属的线粒体定位。然而，正如本研究和其他研究所显示的[1，44，45]，蛋白质的靶向能力取决于测试组织和所使用的结构，不能排除细胞特异性，即在特定类型的细胞中可能发生双重靶向。先前的研究分析了NDB1在马铃薯块茎中的位置，结论是过氧化物酶体中没有NDB1 [46，47］．这项研究的差异可能是由于几个原因，首先，在靶向和积累之间存在差异，马铃薯块茎的专门存储组织可能不是研究酶的位置的理想组织，特别是在茎/芽表型被检测的情况下。其次，所使用的方法存在一些技术问题。用于从线粒体中纯化过氧化物酶体的方法[48]，声称可以产生纯细胞器，交叉污染只有2%或更少。然而，在这两种情况下，只使用过氧化氢酶活性来验证细胞器纯度[46，47］．随后在酵母、哺乳动物和植物系统中的蛋白质组学研究表明，线粒体污染是过氧化物酶体最丰富的污染物，反之亦然[49］．过氧化氢酶甚至存在于高度纯化的线粒体中[50］．这表明以往研究中使用的免疫方法定量和灵敏度不够[46，47］．

虽然如上所述，ND蛋白在线粒体和质体中的各种作用已经被归因于，但在过氧化物体中没有描述功能。II型ND蛋白能够氧化NADH和NADPH，两者都是通过异柠檬酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在过氧化物酶体中产生的。在植物过氧化物酶体中，苹果酸脱氢酶和羟酰基辅酶a脱氢酶也能产生NADH [51］．虽然其他酶可以氧化过氧化物酶体中的NADH和NADPH，但这也适用于线粒体和质体，它们有多个氧化NADH或NAD(P)H的系统[52，53］．

植物ND蛋白的过氧化物酶体和线粒体双靶向获得的性质尚不清楚，但由于它只需要蛋白质末端3个氨基酸的修饰，因此可以很容易地设想它是可以发生的。还可以看到，不同物种的不同ND蛋白中，并非所有的PTS1序列都是相同的(图1)1)．这表明后三个氨基酸由于功能限制而不保守。这是由酵母II型ND蛋白Ndi1的晶体结构支持的，说明酶活性不需要c端区域[54，55］．相反，将Ndi1连接到线粒体内膜需要c端区域。这可能意味着II型NDs的c端区域可能容易发生突变，而不影响蛋白质的催化活性。但可能会改变功能，因为蛋白质现在被定位到一个额外的位置，在那里它可以执行一个新的功能。

植物中ND蛋白对线粒体和过氧化物酶体的双重靶向是有趣的，因为它涉及蛋白质两端不同的两个靶向信号。此前已有报道称，这种情况在拟南芥酰基激活酶中自然发生，它们显示出相同的靶向信号排列，只是线粒体信号被叶绿体信号取代[56]，一种人工合成的蛋白质含有叶绿体靶向信号的小亚单位的rubisco (SSU)连接到RFP和GFP和PTS1信号，实际上可以靶向叶绿体和过氧化物酶体在活的有机体内［57］．这表明两种信号都可以在细胞环境中被识别，即使n端信号会在c端之前从核糖体中出现，这与之前对双靶向蛋白靶向信号的研究略有不同[58，59］．但这些研究主要集中在线粒体和叶绿体之间的双重靶向，其中靶向信号都位于n端。因此，可能会发生输入或结合因子的调节，以分配双靶向蛋白。

总之，本研究表明ND蛋白靶向于陆地植物的多个细胞器(图8)．我们从三个主要的植物类群中评估了目标，Dicots =拟南芥，Moss = Physcomitrella, Monocot =水稻，其中我们使用葱(洋葱)。因此，针对属于该主要植物群的所有三种植物进行了评估。这种多重定位能力在陆生植物进化的早期就出现了。重要的是，对蛋白质位置的了解要尽可能从各种各样的来源获得。虽然像拟南芥这样的模型提供了很多信息，但不应该假设所有植物在同源蛋白的位置方面都是一样的。蛋白质的靶向信号比蛋白质的活性位点受特定序列要求的约束更小，因此可能随着时间的推移而获得和/或改变。虽然不可能像在拟南芥中那样对多种植物的亚细胞蛋白质组进行同样程度的研究，但如果不考虑进化差异，就意味着所有植物都应该是相同的，而从定义上看，事实并非如此。

生物信息学分析

所有拟南芥II型NAD(P)H脱氢酶蛋白序列均从TAIR网站(http://www.arabidopsis.org) (NDA1;At1g07180 NDA2;At2g29990。NDB1;At4g28220 NDB2;At4g05020 NDB3;At4g21490 NDB4;At2g20800 NDC1;At5g08740)，并用于BlastP [60]搜索对卡特团藻，莱茵衣藻(衣藻),Physcomitrella金属盘，卷柏moellendorffii，栽培稻，玉米，葡萄，大豆,杨树trichocarpa蛋白质数据库使用Phytozome网站(http://www.phytozome.net)．Blastx搜索用于识别蛋白质云杉glauca在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)[60］．已知的序列大肠杆菌，酿酒酵母,聚囊藻属PCC 6803NADH脱氢酶从NCBI网站下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)．亚细胞定位预测使用Predotar [61], TargetP [62和Wolfpsort [63］．ATP预测因子[64]也被用来预测一个给定的蛋白质被线粒体和质体双重靶向的概率。使用PTS1预测器预测过氧化物酶体靶向[29], PredPlantPTS1 [30.]，并将最后3个c端氨基酸与AraPerox数据库中已知的PTS1序列进行比较[31］．系统发育分析首先使用MAFFT对所有蛋白质进行多重序列比对[65］．系统发育树的计算采用MEGA 5 [66]采用邻连统计方法，自举复制数为1000。

载体的克隆与构建

RNA提取的拟南芥，栽培稻而且Physcomitrella金属盘根据制造商的说明使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Melbourne)进行。使用SuperScript™III第一链合成系统(Invitrogen，悉尼)进行反转录。部分基因的cDNA克隆从基于知识的水稻分子生物学百科全书(KOME)中获得[67]或理研生物资源中心[68］．用cDNA或cDNA克隆体作为模板，扩增全长cDNA或终止密码子前最后的c端10个氨基酸，克隆成N端和c端GFP载体[3.，25)使用重组网关技术(Invitrogen，悉尼)。的目标信号Pisum一1,5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(SSU)的小亚基Cucubita sp．苹果酸合酶与RFP融合，分别作为质体和过氧化物酶体标记[3.，69］．线粒体对照使用了三种不同的结构。拟南芥悬浮细胞的靶向信号大豆使用替代氧化酶(AOX) [3.］．对于洋葱细胞，细胞色素c氧化酶IV靶向信号来自酿酒酵母熔合到mCherry被利用[70］．最后，融合在mCherry上的小立碗菌替代氧化酶(Pp1s183_11V6)的全长编码序列被用于小立碗菌的组织[45］．

Subcellullar本地化

如前所述，GFP和RFP/mCherry融合载体在拟南芥细胞悬液和洋葱表皮细胞上进行生物协同转化[3.］．简单地说，使用PDS-1000/He生物转化系统(Bio-Rad, Sydney)将每个GFP和RFP质粒各5 μg共沉淀到金颗粒上，并轰发于4天大的拟南芥细胞悬液和新鲜剥皮的洋葱表皮细胞上。对于假定的小立孔菌蛋白，也在7天大的原质组织上进行转化。在22°C (Physcomitrella为25°C)黑暗条件下孵育12-24小时后，使用BX61 Olympus显微镜(Olympus, Melbourne)在100倍放大下观察GFP和RFP的表达，激发波长为460/480 nm (GFP)和535/555 nm (RFP)，发射波长为495-540 nm (GFP)和570-625 nm (RFP)。图像是使用Cell捕获的^R成像软件(Olympus, Melbourne)如前所述[3.］．

这项工作得到了LX的WA州政府研究生奖学金和JW的澳大利亚研究委员会发现补助金DP0664692的支持。CC由亚历山大·冯·洪堡基金会的洪堡博士后研究员奖学金支持。

从属关系

1. 澳大利亚科学院植物能量生物学卓越中心，西澳大学贝利斯楼M316，斯特林高速35号，西澳，6009

   徐琳，罗瑞敏，莫尼卡·W·默查和詹姆斯·惠兰

2. 生物I系，植物，ludwig - maximilian Universität München, Großhaderner Strasse 2-4, Planegg-Martinsried, D-82152

   克里斯·凯莉

相应的作者

对应到克里斯·凯莉．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

LX在SRL和MM的协助下完成了实验工作，CC和JW监督了研究的分析、设计和实施。CC和JW起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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