通过比较蛋白质组学和关联作图鉴定出影响马铃薯块茎冷甜度自然变异的新候选基因

背景

高等植物进化出各种策略来适应寒冷的环境。在对低温的其他转录和代谢反应中，植物积累了包括糖在内的一系列溶质。成熟马铃薯块茎在低温条件下的还原糖葡萄糖和果糖的积累被称为冷致甜味(CIS)。马铃薯块茎中CIS的分子基础不仅在植物适应环境胁迫的基础研究中很有意义，而且在应用研究中也很有意义，因为大量的还原糖会对薯片等加工食品的质量产生负面影响。不同马铃薯品种对cis的耐受性差异很大。我们的目标是通过一种无偏倚的方法来确定影响马铃薯品种在冷藏前和冷藏期间块茎糖含量自然变化的基因和细胞过程。采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术比较了不同品种的块茎蛋白质组。在编码差异表达蛋白的基因组序列中检测DNA多态性与块茎淀粉含量、淀粉产量和加工质量的相关性。

结果

在40个四倍体马铃薯品种的块茎中检测到明显的自然变异。耐寒和敏感品种在冷藏前和冷藏期间蛋白表达均有显著差异。可识别的差异蛋白对应于蛋白酶抑制剂，patatin，热休克蛋白，脂氧合酶，磷脂酶A1和亮氨酸氨基肽酶(Lap)。基于单核苷酸多态性的关联图谱支持Lap在块茎淀粉和糖含量数量性状的自然变异中起作用。

结论

比较蛋白质组学和关联遗传学相结合，发现了影响马铃薯块茎数量性状自然变异的新候选基因。其中一个这样的基因是亮氨酸氨基肽酶，到目前为止还没有被认为在淀粉糖相互转化中发挥作用。通过SNP对马铃薯块茎淀粉含量、淀粉产量和薯片品质的检测，为马铃薯加工品种的选育提供了依据。

无柄高等植物进化出各种策略来适应寒冷的环境。在对低温的其他转录和代谢反应中，植物积累了一系列溶质，包括氨基酸、葡萄糖苷或糖。虽然糖的确切功能仍有待阐明，但它们的积累表明它们具有渗透调节剂、冷冻保护剂或信号分子的作用。在成熟马铃薯块茎中，冷适应过程中可溶性糖的积累被称为冷致甜化(CIS) [1- - - - - -3.］．在马铃薯块茎等光合作用不活跃的组织中积累的蔗糖、葡萄糖和果糖是从淀粉降解中吸收的[3.，4］．在马铃薯和其他植物中，参与淀粉和糖代谢的酶已在生化和分子水平上得到了深入的研究[5- - - - - -7］．然而，这一过程的调控还不完全清楚。各种酶，如淀粉酶、UDP葡萄糖焦磷酸化酶或转化酶，已被建议通过增加或抑制表达或活性来控制块茎中CIS的水平[8- - - - - -10］．蔗糖转化为葡萄糖和果糖的转化酶的活性显然受到蛋白质抑制剂的翻译后调节[11- - - - - -15］．

除了植物对低温的适应功能外，CIS也是马铃薯加工业的一个重要问题。低温下长期储存有利于减少马铃薯块茎的发芽，从而延长其适销性。然而，高浓度的还原糖葡萄糖和果糖，无论是先天的还是由CIS引起的，都会对加工食品的质量产生负面影响，如薯片和薯条[16］．

马铃薯品种在CIS能力上表现出广泛的自然变异[17，18］．块茎糖含量的多样性可能是由源(光合叶)和库组织(块茎)中碳水化合物代谢酶的丰度和/或活性的变化以及蔗糖从源到库的通量的变化所解释的。了解这一多样性的分子基础将有助于解读植物的冷适应性和开发诊断标记，用于选择低糖积累能力的品种，从而提高加工质量。

块茎淀粉和糖含量是受多种遗传和环境因素控制的数量性状。定量性状位点(quantitative trait locus, QTL)与候选基因的分子连锁定位显示，块茎淀粉和糖含量的部分QTL与碳水化合物代谢或转运功能基因共定位[17，19- - - - - -21］．最近，关联遗传学表明，编码转化酶和淀粉磷酸化酶的基因的DNA多态性与薯片颜色、淀粉含量和淀粉产量有关[22- - - - - -24］．遗传分析支持块茎淀粉和糖含量的自然变异是由淀粉和糖代谢中起作用的酶的等位变异控制的工作模型。然而，这个模型只能解释部分观察到的遗传变异。

为了确定影响块茎糖积累的新因素，需要无偏倚和综合的方法，如转录组和蛋白质组分析。利用番茄基因芯片与马铃薯RNA杂交的微阵列杂交实验，可以鉴定出在单一马铃薯基因型的块茎冷藏期间差异表达的已知基因和新基因。已知候选基因的转录水平，如转化酶，与糖积累相关[25］．分析蛋白质组既可以捕捉到生物样本中转录丰度的变化，也可以捕捉到转录后过程的变化，蛋白质的差异表达反映了在任何环境或压力下翻译的基因组[26］．比较蛋白质组分析以前已被证明成功地识别了控制块茎品质性状的新候选基因[27- - - - - -29］．

本研究的目的是破译马铃薯优质育种材料块茎还原糖含量(RSC)和冷诱导甜化(CIS)能力自然变异的分子基础茄属植物tuberosum．利用2D-PAGE(二维聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术，对40个马铃薯品种块茎还原糖含量多样性较高的块茎蛋白质组进行了比较，并检测了不同蛋白质表达水平与RSC之间的相关性。此外，还进行了冷藏实验，以研究耐cis (CIS-t)和顺式CIS-s (CIS-s)品种在低温处理下表达差异的蛋白质。在冷藏期间的某些时间点，对cis耐受型和cis敏感型基因型池进行了比较2D-PAGE蛋白质分析，确定了至少50个差异表达蛋白。为了验证它们在控制这些性状自然变异中的潜在作用，在冷藏过程中，对两个候选基因座上的snp进行了测试，这些基因座编码的蛋白质要么与RSC相关，要么在耐cis和敏感cis品种之间差异表达。我们的方法导致了迄今为止尚未与植物碳水化合物代谢相关的新型潜在调控基因的发现。

冷处理前后块茎还原糖含量(RSC)

对预选的40个高(1 ~ 20，附加档案)品种进行了冷处理前后块茎RSC的测定1表S1)和低(编号21至40，附加文件1:表S1)芯片质量。在冷藏前，RSC的干重变化范围为0.02 ~ 3.58%1A).品种的排名与它们之前基于芯片质量的分配相对应，只有两个例外(品种2和31)。在4℃贮藏12周后，所有品种的RSC均有所增加1B)冷藏前RSC值较低的品种在冷藏过程中RSC的增加幅度高于初始RSC值较高的品种。而冷藏4周前后的RSC对品种的排序与切片质量高低的分配高度一致。综上所述，RSC是芯片质量的高度指示性，反之亦然。

未经冷处理的RSC与蛋白斑点强度的相关性

采用2D-PAGE技术分离冷处理前40个品种块茎总可溶性蛋白。每个凝胶平均检测到226个蛋白质斑点(数据未显示)。根据40个品种(包括生物重复)中超过70%的凝胶中存在的蛋白质斑点，选择了26个蛋白质斑点，并通过测量斑点强度来量化。平均RSC和斑点强度的数据在附加文件中提供2:表S2。5种蛋白的斑点强度与RSC显著相关(p < 0.05)2、表1)．发现最显著的相关性是一种被鉴定为“假定的kunitz型块茎转化酶抑制剂”的蛋白质(图2F,表1，附加文件3.:表S3)。蛋白质斑点强度降低与RSC增加相关。两种被鉴定为' miraculin '和' potato蛋白酶抑制剂class II '的蛋白质也获得了负相关系数(图2D和E，表1，附加文件3.:表S3)。另外两个蛋白点，都被鉴定为“颗粒结合淀粉合成酶”，与RSC呈正相关(图2B和C，表1，附加文件3.:表S3)。

冷处理期间的蛋白质图谱比较

根据冷处理过程中还原糖的积累(图1B)选择10个品种，每5个品种的RSC值最低(cis -耐受性，CIS-t)和最高(cis -敏感性，CIS-s)(见附加文件)1:表S1)。从CIS-t和CIS-s品种的块茎中提取总可溶性蛋白，分别在(T0)前、2周、4周和12周(2w、4w、12w)冷处理后提取。在每个时间点创建两个蛋白质池。第一个库由来自CIS-t品种的等量蛋白质组成，第二个库来自CIS-s品种。在两种不同的条件下，通过2D-PAGE分离蛋白池，以分解不同大小级别的蛋白质(图3.)．通过比较基因型池CIS-t和CIS-s的蛋白谱，发现了在一个或多个时间点上表现出定量和定性差异的蛋白斑点。50个蛋白质斑点(图3.)显示CIS-t和CIS-s基因型池之间的斑点强度至少在一个时间点上有两倍的差异(表22)．在附加文件中显示了冷处理过程中斑点强度的动力学和相应基因的基因组位置4:表S4。

50个差异蛋白点中的36个被分配到各种蛋白酶抑制剂(PI’s)、存储蛋白patatin的异型、脂氧合酶(Lox)、磷脂酶A1 (PLA1)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、几种热休克蛋白(HSP)、亮氨酸氨基肽酶(Lap)、发病相关蛋白10 (PR10)和肌动蛋白(附加文件中提供的蛋白质鉴定数据)5:表S5)。最大的一组对应于蛋白酶抑制剂。

冷处理开始前有28个蛋白斑点存在差异表达，基因型pool CIS-t中有17个蛋白斑点表达水平较高，pool CIS-s中有11个蛋白斑点表达水平较高。例如，标识为Lox的三个系列斑点(图31-35，斑点)3.A)、PLA1(36、39、40位点)和Lap(47 ~ 50位点)在CIS-t中表达高于CIS-s。相比之下，kunitz型蛋白酶抑制剂(点2、3、4和6)和HSP(点5)在CIS-s池中比CIS-t池中更丰富。

在冷处理期间，18种蛋白的表达均保持显著差异。主要的兴趣点是6和19，它们以不同的pI和分子量迁移，但在搜索NCBI蛋白质数据库时被分配到相同的miraculin接入。在马铃薯基因组序列中，胰蛋白酶肽与染色体III和XII的不同位点相匹配[30.］．3号染色体上的miraculin基因在CIS-t中持续高表达，12号染色体上的miraculin基因在CIS-s中持续高表达4:表S4)。

观察到的其他表达模式是:在基因型池CIS-t(如点20)或CIS-s(如点11、14)或两个池(如点3、7、16)中进行冷处理诱导，短暂性地(如点10、11、50)或持续地(如点7、20)，或在基因型池CIS-t(如点24、38)或CIS-s(如点17)或两个池中进行冷处理抑制(如点25)。

候选基因的基因组组织及其与块茎品质性状的关系

在编码差异表达蛋白“假定的kunitz型块茎转化酶抑制剂”(AAL60242)和“叶绿体leucine氨基肽酶”(P31427)的两个位点上，检测了单核苷酸多态性(SNP)与chip - all关联定位群体中块茎品质性状的相关性[22］．

a)假定的kunitz型块茎转化酶抑制剂(KT-InvInh)

对马铃薯基因组序列[30]和GeneBank核苷酸核心集的相应核苷酸序列(AF459077)进行BLAST分析，结果显示与PGSC0003DMB000000159 (chr03:19743564..21131995)上pgsc0003dmb400010146位点的序列同源性为99.7%，与马铃薯BAC克隆BA259D20和BC135N2的序列同源性为99% [31］．这个位置KT-InvInh在蛋白酶抑制剂基因家族的混合簇中StKI马铃薯III染色体上的基因座[30,31,32]。基于PGSC0003DMG400010146基因侧边的独特序列设计位点特异性引物，用于从CHIPS-ALL群体的个体中生成扩增子并对其进行测序。14个snp和一个插入/删除(indel)多态性(附加文件6:图S1)对块茎淀粉含量(TSC)、块茎产量(TY)、块茎淀粉产量(TSY)、秋季收获后(CQA)和冷藏后(CQS)薯片质量进行了评价(表1)3.)．9个snp和indel与TSC和TSY相关。这些snp分为三个单倍型组，在CHIPS-ALL人群中分布高度相似，因此具有相似的关联。所有小频率SNP等位基因均增加平均TSC和TSY(表3.)．很少有小的关联(0.05 > p > 0.01)与TY(未显示)。

b)叶绿体亮氨酸氨基肽酶(Lap)

利用马铃薯基因组序列差异Lap蛋白对应的cDNA序列X77015进行BLAST搜索[30.]鉴定出超级支架PGSC0003DMB000000116 (chr12:910581..2552409)，其中包含一个注释为“中性Lap”的单基因模型(StLapN)．同样的超级支架包含标记位点AGPaseB-b(PGSC0003DMG400046891)和GP34［32]，将超级支架固定在马铃薯第十二染色体长臂的远端。序列X77015与两个区域明显匹配(> 95%序列相同)，表明两个区域串联重复腿上每个基因有10个外显子，位于超级支架PGSC0003DMB000000116 (chr12:910581..2552409)的17 kbp区域内。通过对番茄进行比对，确定了其基因组组织腿上序列U50151(酸性腿上，SlLapA)和AF510743(中性搭接，SlLapN)和超级脚手架。引物X77015的cDNA序列更接近SlLapA(94.6%)SlLapN(86.2%)和StLapN(87.2%)，说明注释为' chloroplastic leucine aminopeptidase '的差异蛋白对应StLapA．适合测序和SNP检测的特定扩增子只能从物理上紧密相连的扩增子中获得StLapN基因。17个SNPs和一个indel(附加文件6图S1)与CHIPS-ALL群体块茎性状的相关性进行了测试。四个SNPs与一个或多个块茎性状相关，其中两个只显示了非常小的影响(数据未显示)。单核苷酸多态性₂₇₄₆块茎淀粉含量(TSC)、块茎淀粉产量(TSY)、采收后薯片质量(CQA)和冷藏后薯片质量(CQS)均呈极显著相关。含小频率等位基因A的栽培品种₂₇₄₆的平均性状值显著增加(表3.)．此外，在冷藏期间对40个品种进行RSC评估时，SNP等位基因A₂₇₄₆在16个品种中检测到，优先在RSC低的品种中，特别是在冷藏四周后(图1)．当40个品种根据SNP等位基因A的存在和不存在进行分组时，这一观察结果得到了证实₂₇₄₆并测试RSC组均值之间的差异。在所有时间点，基因型组至少有一个剂量的A₂₇₄₆等位基因积累的还原糖量明显低于等位基因G的纯合子组₂₇₄₆(图4)．SNP的正向效应₂₇₄₆在冷藏期间增加，与CHIPS-ALL种群中获得的结果一致。

采用比较蛋白质组学与关联遗传学相结合的方法，研究了马铃薯块茎还原糖积累和cis耐受性自然变异的分子基础。我们鉴定了蛋白质，这些蛋白质的丰度与块茎糖含量相关。此外，我们还发现，在冷藏前和冷藏期间，高耐cis和低耐cis品种组之间的蛋白质表达存在差异。

蛋白质水平的差异可能是导致表型的原因或结果，如块茎糖含量。控制表型变异的基因是在表型表达中具有代谢、结构或调节功能的所有基因的一个子集。因此，DNA多态性应该存在于与表型变异相关的致病基因的编码区或调控区。因此，比较蛋白质图谱和关联遗传学是放大控制复杂性状的基因的互补方法。编码差异蛋白KT-InvInh和StLapA的两个位点的DNA多态性与块茎淀粉含量、块茎淀粉产量或切片品质等块茎品质性状相关。因此，它们是块茎RSC和CIS耐受性自然变异的良好候选基因。为了对育种应用有用，用于关联分析的遗传物质应该来源于最先进的育种项目。我们的协会小组，由中欧商业育种项目的品种和先进无性系组成，符合这一标准[22］．该遗传材料中新发现的与薯片品质、块茎淀粉含量和淀粉产量相关的snp可用于标记辅助筛选优良加工品种。

为了鉴定在冷处理中上调或下调的蛋白以及影响CIS耐受性的自然变异，我们比较了冷藏期间CIS-s和CIS-t基因型库的块茎蛋白谱。大多数差异蛋白点(50个中的28个)在冷处理开始前CIS-t和CIS-s基因型池之间显示出显著差异2，附加文件4:表S4)。这些差异通常在整个冷库中保持不变。因此，我们的结果表明，这些蛋白质表达的本构性差异涉及RSC的这一部分，这与冷处理无关。

在差异点中有新的蛋白质，如亮氨酸氨基肽酶，到目前为止还没有被认为在淀粉-糖相互转化中发挥作用。其他如差异热休克蛋白证实了之前的发现[25，28］．相比之下，一些已知与块茎糖和淀粉含量有关的基因[22]未被检测为差异表达蛋白，很可能是由于2D-PAGE的分辨率和灵敏度有限。尽管如此，这项研究表明，比较蛋白质组学适用于识别新的候选基因，并产生补充基于功能和位置候选基因的关联作图的结果。

蛋白质与块茎糖含量相关

最显著的相关性是一种假定的kunitz型转化酶抑制剂(KT-InvInh)。该蛋白以前从可溶性块茎蛋白部分纯化，并被证明抑制可溶性块茎转化酶在体外［15］．转化酶在马铃薯块茎冷甜化中的作用已有研究[33- - - - - -36］．在冷藏期间，蔗糖酶活性增加，而蔗糖酶抑制活性降低，这表明蔗糖酶活性和由此减少的糖积累是由一种特定的蔗糖酶抑制剂调控的[14，33，37］．KT-InvInh蛋白丰度与块茎含糖量呈负相关，符合该模型。KT-InvInh与烟草和马铃薯的其他克隆转化酶抑制剂无序列相似性[11- - - - - -13，38，39］．

关联分析KT-InvInh发现9个SNPs和1个indel与块茎淀粉含量和淀粉产量高度显著相关，但与薯片质量无显著相关性(表1)3.)．有趣的是,国民党₃₀₇(附加文件6:图S1)与任何性状无关。单核苷酸多态性₃₀₇导致缬氨酸(G₃₀₇甲硫氨酸(A₃₀₇)，这是KT-InvInh蛋白的特征[15］．等位基因一个₃₀₇在CHIPS-ALL人群中频率为93%，因此几乎是固定的。这可能解释了与芯片质量缺乏关联的原因。观察到的关联KT-InvInh位点也可能是由于与其他物理连接的差异表达的kunitz型抑制剂的连接不平衡造成的KT-InvInh(见附加文件)4:表S4及下)。或者，KT-InvInh可能会瞄准在活的有机体内一种调节淀粉降解的蛋白质。在这种情况下，KT-InvInh等位变异可能对块茎淀粉含量和淀粉产量有因果影响。

另外两种与RSC呈负相关的抑制剂是miracle - ulin和potato inhibitor 2 (PIN2)。与奇迹蛋白类似，PIN2s也未被认为是淀粉-糖互转化的候选基因。由于两个变量之间的相关性并不能为它们之间的因果关系提供结论性证据，蛋白酶抑制剂对糖积累的影响可能是直接或间接的。

基因型池CIS-t和CIS-s之间蛋白表达差异

在低温处理前后，50个蛋白斑点在低还原糖(CIS-t)或高还原糖(CIS-s)积累的10个基因型之间存在定性或定量差异。由于一些基因家族成员之间的高度序列相似性，不能将一个明确的位点分配到所有的蛋白质点。与同一蛋白质接入相匹配的不同位点可能是同一基因的等位变异。另外，由于蛋白质数据库的分辨率有限，来自不同基因的点可以匹配到相同的蛋白质接入。在注释点中有块茎蛋白patatin和蛋白酶抑制剂(PI)的异构体[27，40- - - - - -42］．13个差异表达蛋白为kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI)或马铃薯抑制剂2 (PIN2)。KPIs和pin2由多基因家族编码，在dna位点上以混合簇的形式组织StKI马铃薯第三染色体上的基因座[31，43］．一些研究表明，马铃薯蛋白酶抑制剂之间存在高度的序列变异性和基因型特异性变异[29，41- - - - - -45］．结构变异可能表明功能变异。除蛋白酶外，转化酶和淀粉酶等酶也受到pi的抑制[15，42，46- - - - - -48］．基因型依赖，在某些情况下冷诱导或抑制表达表明几个pi在淀粉-糖相互转化中起调节作用。

patatin和phospholipase A1 (PLA1)亚型在CIS-t和CIS-s基因型之间存在显著差异。patatin在马铃薯块茎中的作用被描述为作为发芽和早期植物生长的氮源的存储蛋白质。的在体外patatin的脂酰水解酶(LAH)和磷脂酶活性以及其他植物的相关蛋白的活性表明了额外的功能[49- - - - - -51］．磷脂酶参与磷脂和半乳糖的降解，从而在冷驯化过程中改变膜的组成和性质[52，53］．增加膜流动性将降低膜损伤的阈值温度，并将维持膜相关蛋白的活性。patatin和磷脂酶A1在改变膜脂组成中的作用可以解释冷驯化应答强(CIS-s)和弱(CIS-t)基因型之间的差异。

脂氧合酶(Lox)是一种双加氧酶，能催化多不饱和脂肪酸的氢过氧化反应。在CIS-t和CIS-s基因型池中差异表达的Lox对应一个9-Lox。9- lox优先将亚油酸氧化为9(S)-过氧化氢亚油酸，这是马铃薯块茎中主要的过氧化氢异构体[54，55］．9-Lox产生的代谢产物参与块茎发育。块茎中9-Lox活性的抑制与块茎产量降低、块茎大小减小和块茎形成中断相关[56］．9-Lox在休眠马铃薯块茎中的作用尚不清楚。几项研究调查了冷甜过程中马铃薯块茎中的Lox活性[54，57］．Lox被认为是导致冷藏过程中发生过氧化损伤的原因。然而，冷甜与膜通透性或脂质饱和度之间并无明显相关性[54］．此外，冷甜化是一个可逆过程，因为当块茎被转移回更高的温度时，糖含量会降低，这与膜的不可逆过氧化不一致[3.］．虽然在这一点上是推测性的，但我们提出，patatin、PLA1和Lox亚型以品种特有的方式调节膜的特性，这导致了冷驯化和甜化的基因型差异，机制尚不清楚。

块茎对低温的适应除了淀粉-糖相互转化和膜成分外，还可能包括其他途径。在这方面有趣的候选基因是一种叶绿体(可塑性)亮氨酸氨基肽酶(LapA)的异构体，它在CIS-t基因型中比在CIS-s基因型中更丰富。第十二染色体上相应的位点由重复的、物理上紧密相连的位点组成腿上与块茎淀粉和糖含量的QTL有关。植物亮氨酸氨基肽酶参与多种生理过程[58］．LapA最早在马铃薯中被发现，是对伤害的反应，并被认为是茄科植物所特有的[59］．LapA是由水分亏缺、盐度、病原菌侵袭以及茉莉素和脱落酸诱导的[58，60，61］．中性腿上（LapN)在各种植物物种中都有组成性表达，并被认为在一般细胞维持中起作用，而酸性腿上（拉帕的)更具体[62］．我们的研究结果表明LapA在淀粉-糖相互转化中具有新的调节功能。StLapA可能位于淀粉体中，通过活性酶的蛋白水解抑制淀粉降解，从而间接抑制糖的积累。

关联分析识别SNP₂₇₄₆在StLapN该基因与冷藏和不冷藏薯片品质、块茎淀粉含量和淀粉产量密切相关。尝试直接在差异表达中对snp进行评分StLapA高度杂合的四倍体个体的扩增子存在插入-缺失多态性，导致基因失败。自StLapN从StLapA由于马铃薯的连锁不平衡(LD)可以扩展到几百个碱基对以上[63，即SNP的关联₂₇₄₆块茎性状可能与LD有关StLapA．具有SNP等位基因的品种的平均RSC一个₂₇₄₆明显低于整个冷藏过程中缺乏该等位基因品种的平均水平(图4)，这使得该SNP成为育种应用的一个有吸引力的标记。

不同的斑点也被分配给糖酵解或应激反应等代谢过程中的蛋白质。参与应激反应的热休克蛋白在CIS-s基因型中更为丰富。热休克蛋白是普遍存在的分子伴侣，可以保护其他蛋白质在温度胁迫后不发生错误折叠。在冷胁迫下HSPs的积累已被报道[25，64，65］．因此，热休克蛋白的基因型变异可以对马铃薯块茎中的几个代谢过程产生影响，包括冷甜味。

减少糖含量和块茎瘀伤

在高还原糖水平和低还原糖水平基因型中差异表达的蛋白质类型(本研究)和高和低块茎挫伤易感性基因型之间观察到有趣的重叠[27］．瘀伤描述了内部块茎组织在机械损伤时的酶促变色，在生物化学上似乎与淀粉-糖相互转化无关。然而，在这两项研究中，蛋白酶抑制剂、patatin、脂氧合酶和磷脂酶A1(与脂肪酶III类相同)被独立鉴定为基因型依赖的差异蛋白。在kunitz型酶抑制剂S9C11, Lox和PLA1的情况下，胰蛋白酶肽与相同的位点(PGSC0003DMG400010147, PGSC0003DMG400020999和PGSC0003DMG401031759)匹配，表明差异蛋白是相同基因的产物，尽管与RSC和擦伤易感性相关的等位基因可能不相同。易受挫伤与块茎淀粉含量高密切相关，膜稳定性也可能起作用[66］．这表明块茎淀粉含量和/或膜结构是糖水平和瘀伤的共同分母，影响RSC和瘀伤敏感性。pi与脂质代谢和/或信号传导成分一起可能通过调节块茎淀粉含量或膜成分直接或间接地调节这两种性状。

本文中描述的蛋白质组学和关联遗传学的结合为更好地理解分子水平上的复杂植物性状提供了一种创新途径，特别是在马铃薯等非模式植物中。在多样性小组中比较蛋白质组学能够识别在经典功能方法中没有注意到的不明显的候选基因，在经典功能方法中，蛋白质的丰度或活性对环境变化的响应是在单一基因型中进行研究的。在编码差异表达蛋白的位点中DNA多态性的关联验证了亮氨酸氨基肽酶在块茎淀粉含量、淀粉产量和薯片质量中的作用。到目前为止，还没有考虑Lap在碳水化合物代谢或冷致甜味中的作用。该SNP与块茎品质相关，可用于抗CIS品种的标记辅助选择。

植物材料和组织取样

39个栽培品种和1个育种无性系的田间种植块茎(附加文件)1:表S1)由Böhm-Nordkartoffel agrarproduction OHG (BNA, Ebstorf，德国)提供。其中加工质量较好的品种有20个，加工质量较差的品种有20个。交付后，块茎在4°C黑暗中保存12周。在冷藏1周、2周、4周和12周后，每个品种和时间点的3个去皮块茎组织分别在液氮中快速冷冻。为了提取蛋白质，冷冻块茎组织在珠磨机(Retsch, Haan, Germany)中被研磨成细粉，并在-80°C保存直到使用。组织等分冷冻干燥，用于糖提取。相关性分析采用2D-SDS-PAGE分离40个未冷藏品种的块茎总蛋白。为了进行冷藏期间的蛋白质组比较分析，将栽培品种“威尔第”、“克莱尔夫人”、“欧米茄”、“Eurobeta”和育种无性系18(耐cis”，“CIS-t”)，以及“Elfe”、“Marabel”、“Solara”、“Melba”和“Allians”(“CIS-s”，“CIS-s”)的蛋白质提取物进行汇总和分析。使用由207个四倍体基因型组成的“chip - all”群体进行关联作图，其中包括33个标准品种和76个、91个和7个育种无性系，分别来自Böhm-Nordkartoffel agrarproduction OHG (BNA, Ebstorf, Germany)、Saka Pflanzenzucht GbR (Windeby, Germany)和nording - kartoffelzucht -und Vermehrungs-GmbH (NORIKA, Groß Lüsewitz, Germany)。已在重复的田间试验中评估了该种群在秋季收获后(无冷藏，CQA)和在4°C (CQS)储存三个月后的薯片颜色，以及块茎产量(TY)、淀粉含量(TSC)和淀粉产量(TSY) [22］．

葡萄糖，果糖和蔗糖的测量

葡萄糖、果糖和蔗糖的估计方法如所述[17稍加修改。100 mg干粉用1 ml 80%乙醇冰水提取，80°C孵育1 h。提取液用真空浓缩器(SpeedVac®，Thermo Fisher Scientific, MA, USA)浓缩至100 μl。900 μl dH₂添加O，混合样品，直到沉淀溶解。蔗糖、葡萄糖和果糖采用偶联酶法(“D-Glucose, D-Fructose, Saccharose”，R-Biopharm, Darmstadt, Germany)按照供应商说明进行测定。糖含量以块茎干重百分比(μg*100 μg)计算^－1干重)。块茎还原糖含量(RSC)由葡萄糖和果糖含量之和决定。在每个品种的3个块茎中测量RSC(生物重复)，并估计平均值和标准误差。

蛋白质的提取

总蛋白从300mg冰冻的块状组织中提取，如所述[29］．蛋白球在尿素缓冲液(8 M尿素，2 M硫脲)中重新悬浮。蛋白质丰度使用Qubit®蛋白质检测试剂盒(Invitrogen, CA, USA)进行评估。将得到的蛋白质提取物冷冻在氮液中₂在-80°C保存直到使用。

2D-PAGE，图像采集和数据分析

在40个品种中RSC与蛋白质表达水平的相关性分析中，采用2D-PAGE分析技术对每个品种3个块茎的蛋白质进行分离。150 μg块茎总蛋白根据制造商的说明，使用Protean IEF系统(BIORAD, CA, USA)进行等电聚焦(IEF) (Zoom®条带pH3-7NL, Invitrogen, CA, USA)。IPG(等电聚焦凝胶)条在7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)、0.5% IPG缓冲液pH 3- 10 (Invitrogen, CA, USA)、25 mM DTT(二硫苏糖醇)和微量溴酚蓝中再水合12小时。在SDS- page之前，ipg -条在室温下在6 M尿素，0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 2% SDS, 20%甘油，2% DTT中平衡10分钟，然后在相同的缓冲液中进行第二次平衡，除了DTT被2.5%碘乙酰胺取代。SDS-PAGE使用12% NuPAGE®Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen, CA, USA)在MES-SDS缓冲体系中200 V运行。凝胶在50%甲醇、10%醋酸中室温固定1小时，然后用h洗涤三次₂根据制造商的说明，用PageBlue™染色液(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)对凝胶进行染色。蛋白质凝胶使用集成在Proteineer spII斑点系统(Bruker Daltonics，不来梅，德国)中的日光扫描仪进行数字化。分析了每个品种3个生物重复的凝胶。使用Proteome Weaver 2-DE分析软件包(BIORAD, CA, USA)中的默认斑点检测设置在扫描凝胶上检测蛋白质斑点。利用软件中实现的基于配对匹配的归一化算法对斑点进行归一化后计算斑点强度。计算了26个选定斑点的平均斑点强度和标准误差，这些斑点在所有品种和重复的凝胶中可检测到的比例超过70%。对于相关性分析，平均光斑强度和RSC的残差被检验为正态分布，并转化为对数值。多个R²采用对数RSC值，分别对斑点强度和基因型进行回归分析。使用SPSS软件包(IBM, NY, USA)计算Pearson积矩相关系数和显著性。从2d -凝胶中分离出相关性显著(p < 0.05)的斑点，用胰蛋白酶消化。通过质谱(MS)和蛋白质序列数据库比较(见下文)鉴定了胰蛋白酶肽。为了在冷藏期间进行蛋白质组比较分析，使用了栽培品种“威尔第”、“克莱尔夫人”、“欧米茄”、“Eurobeta”和育种无性系18(顺式耐受，CIS-t)以及“Elfe”、“Marabel”、“Solara”、“Melba”和“Allians”(顺式敏感，CIS-s)的块茎蛋白质提取物。在4°C贮藏2周、4周和12周前后，从每个品种和时间点的3个块茎中提取总蛋白。将来自CIS-t和CIS-s基因型的单个块茎的等量蛋白质组合在一起，每个时间点产生三个汇集样本(生物重复)。采用IEF和SDS-PAGE两种不同条件，通过2D-PAGE分离300 μg池蛋白。根据制造商指南(GE Healthcare, WI, USA)，使用24 cm IPG带进行IEF，固定pH梯度为pH4-7和pH 3-10。平衡ipg条带(见上文)，并使用Tris-tricine缓冲系统进行16% SDS-PAGE (24 x 20 cm, 1 mm厚度)[67]或10% SDS-PAGE (24 × 20 cm, 1.5 mm厚)使用tris -甘氨酸缓冲系统[68］．电泳在etan™DALTsix电泳装置(GE Healthcare, WI, USA)中进行，在30v下进行1小时，然后在270ma恒流下进行;或者使用PROTEAN Plus Dodeca Cell (BIORAD, CA, USA)在30v下进行1小时，然后在200ma恒流下进行。电泳16小时，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。凝胶在50%甲醇/10%醋酸中室温固定2小时，并用PageBlue™染色液染色。凝胶图像的获取如上所述。使用Delta2D分析软件(DECODON GmbH, Greifswald, Germany)中的默认斑点检测设置进行斑点检测。24张凝胶图片(在4个时间点汇集CIS-t和CIS-s基因型的3个生物重复)被纳入分析。四个分析集由(T0)前和冷藏2周、4周和12周后生成的凝胶组成。使用Delta2D分析软件对一个分析集的凝胶进行融合图像，以识别CIS-t和CIS-s基因型的定性和定量差异。采用Delta2D软件中实现的垂直归一化算法对同一分析集点强度进行归一化。 The algorithm is based on the division of the spot intensity by the sum of all spot intensities on the respective gel. Significant differences in spot intensities between CIS-t and CIS-s were evaluated by statistical analysis implemented in the Delta2D software using the “between samples” T-Test assuming different group variances (Welch approximation) and without correction for multiple testing. Differentially expressed proteins were identified as described below.

MS分析，MALDI数据采集，数据库检索

从考马斯氏染色凝胶中选择斑点，用Proteineer用胰蛋白酶消化spII而且dp系统(Bruker Daltonics，不来梅，德国)。样品消化被标记在用α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)薄层基质制备的Anchorchip钢靶上(Bruker Daltonics, Bremen, Germany) [69］．肽质量指纹(PMF)数据在UltraflexIII MALDI ToF/ToF质谱仪(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上收集，并使用MASCOT 2.3 (http://www.matrixscience.com)与NCBI nr核心收集和马铃薯基因组测序联盟(PGSC)茄属植物tuberosum组Phureja DM蛋白数据库。PMF搜索最初在质量公差设置为50ppm的情况下进行，当基于胰蛋白酶自消化肽的后期校准失败时，以150ppm的公差重新进行。

在样品再结晶之后，根据峰值强度和相对隔离，收集了从PMF中选择的最多5种前驱体的LIFT MS/MS谱[70］．使用MS/MS数据搜索两个数据库，对MS/MS搜索的母体质量和片段质量的质量公差均为0.4 Da。对于MS和MS/MS, MASCOT得分低于各自数据库的95%确定性标准不被认为是显著性的。

通过对马铃薯原细胞和原细胞的搜索，确定了所鉴定蛋白质对应的基因的基因组位置[30.]和番茄[71]基因组序列(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/integrated_searches.shtml，http://solgenomics.net/tools/blast/index.pl)．

SNP标记的产生

以CHIPS-ALL人群个体的基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链反应)生成位点特异性扩增子。在55°C退火温度下，用正向引物(5´-TCAATAGAATTCCTTACCCG-3´)和反向引物(5´-CAATAACGATATCTAGACCTGATTAAC-3´)扩增包含“推测的kunitzz型块茎转化酶抑制剂”(KT-InvInh, PGSC0003DMG400010146)的1150 bp DNA片段。一个850 bp的中性亮氨酸氨基肽酶DNA片段(LapN在60°C退火温度下，使用正向(5´-GCTTCCTGGTCTTGGCTCA-3´)和反向(5´-GCAGCCAGGTCAGAAATCAA-3´)引物扩增了PGSC0003DMB000000116-chr12:910581..2552409)。标准PCR条件为:25 μL含有50 ng基因组DNA的反应混合物，1×铵式PCR缓冲液(Ampliqon, Scovlunde, Denmark)， 2.5 mM MgCl₂dNTP各0.2 mM，正向和反向引物各5 μM, Taq聚合酶1u (Ampliqon, Scovlunde, Denmark);94℃初始变性4 min;94℃45秒变性，55℃30秒退火，72℃75秒延伸34次循环;扩增子在马克斯-普朗克基因组中心科隆使用双脱氧链终止测序方法、ABI PRISM染料终止循环测序就绪反应试剂盒和ABI PRISM 3730自动DNA测序仪(应用生物系统公司，Weiterstadt，德国)定制测序。KT-InvInh扩增子用内部反向引物5´-CTACGCCTTGATGAACACAAATG-3 '测序，LapN扩增子用正向引物测序。在扩增子序列中检测单核苷酸多态性(SNP)并按所述进行评分[72］．

关联分析

用于关联分析的CHIPS-ALL总体已被描述[22］．本研究选用来自3个商业马铃薯育种项目的209个四倍体品种和34个标准品种，通过田间重复试验，对马铃薯块茎淀粉含量(TSC)、块茎产量(TY)、淀粉产量(TSY)、冷藏前秋季薯片质量(CQA)和冷藏后3-4个月薯片质量(CQS)进行了表型分析。在CHIPS-ALL群体中未检测到显著的群体子结构。主要标记-特质关联(p < 0.001)在不同的关联分析模型中是一致的[22］．新的SNP标记与TSC, TY, TSY, CQA和CQS的相关性测试基于与之前使用的相同的模型[22在SPSS (SPSS GmbH Software, München，德国)中使用GLM程序:

Y *表示调整后的性状均值。“起源”是一个固定的因素，分为四个类别，对应于三个育种计划或标准中的一个品种的起源。“标记”是一个固定因子，有五个水平，对应于双等位基因SNP的五个标记基因型类别(一个₁一个₁一个₁一个₁,一个₁一个₁一个₁一个₂,一个₁一个₁一个₂一个₂,一个₁一个₂一个₂一个₂和一个₂一个₂一个₂一个₂)．

采用方差分析(ANOVA)检测各基因型组与SNP等位基因间RSC均数的显著性差异StLapN-SNP₂₇₄₆在40个栽培品种中存在或不存在。

顺式:

低温诱发甜味

RSC:

还原糖含量

QTL:

数量性状位点

CQA:

收获后切片质量

CQS:

芯片冷藏后的质量

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

泰:

块茎产量

TSC:

块茎淀粉含量

SNP:

单核苷酸多态性。

这项工作是在Maarten Koornneef领导的植物育种和遗传学部门进行的。由马克斯-普朗克学会与Fraunhofer学会合作，在BIOSOL项目(茄属生物多样性的分子分析和可持续利用)中提供资金。

从属关系

1. 植物育种与遗传学系，马普植物育种研究所，德国科隆

   Matthias Fischer, Lena Schreiber, Markus Kuckenberg和Christiane Gebhardt

2. 马克斯-普朗克植物育种研究所，质谱组，德国科隆

   Thomas Colby & Jürgen Schmidt

3. BIOPLANT，生物技术制造有限公司，德国科隆

   埃克哈特·Tacke

4. Böhm-Nordkartoffel农业生产OHG, Ebstorf，德国

   Hans-Reinhard Hofferbert

相应的作者

对应到马蒂亚斯•菲舍尔．

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

MF进行了蛋白提取、2D-PAGE、图像采集、数据分析并撰写稿件。LS分析了Lap和KT-InvInh的基因组组织，生成SNP标记，并与块茎品质性状进行关联分析。TC和JS分别进行MS分析、MALDI数据采集和数据库搜索。MK参与了蛋白质提取、块茎糖浓度估计、2D-PAGE和图像采集。ET和HRH提供了植物材料并参与了本研究的设计。CG构思了这项研究，参与了设计和协调，进行了统计分析并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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