新型油料作物高效再生转化方法的研究Lepidium campestre

背景

Lepidium campestre是一种未驯化的油籽品种，具有成为食品和工业原料生产新作物的巨大潜力。为了进一步提高枸杞的油量和油质，需要进行基因改造。对淫羊藿离体茎再生的研究非常有限，目前还没有现成的转化方案。

结果

研究了植物生长调节剂(pgr)的种类、浓度和组合对Lepidium离体芽再生的影响。结果表明，2,4- d处理对不同外植体的茎再生至关重要。2,4- d处理时间为2 ~ 4天，对芽部再生的影响无显著性差异，但2,4- d浓度对外植体类型和细胞分裂素的影响较大，如低浓度的2,4- d与TDZ联合处理可显著提高下胚轴的再生频率。子叶和下胚轴外植体对细胞分裂素的反应不同，TDZ对下胚轴再生的促进作用强于玉米素，但对子叶再生的影响较小，高浓度玉米素对子叶再生的影响较大。结果还表明，NAA对嫩枝再生效果不明显。光照条件下萌发比黑暗条件下萌发的再生频率高。通过对不同条件的优化，确定了一种高效的再生方案，再生效率为92.7%。采用该方案，实现了平均6%的变换频率。通过GUS染色、PCR和Southern blot分析证实转基因系中存在转基因基因。

结论

通过对影响离体茎再生的重要因素的系统研究，我们制定了一套高效的转基因再生转化方案Lepidium campestre。该方法也可应用于相关物种。

随着化石石油储量的减少和气候的变化，对环境友好和可再生的植物油的需求，无论是食品还是工业用途，都变得越来越迫切[1- - - - - -3.]。在现有油料作物增产潜力有限的情况下，对现有油料作物进行改良，开发产量更高、功能多样的新型油料作物变得更加具有吸引力。

Lepidium campestre油菜属十字花科植物，具有成为新型植物油作物的巨大潜力。枸杞具有较高的产量潜力(5吨/公顷，比冬季油菜平均产量高出约30%)。它具有很强的耐寒性，可以在不能种植冬季油菜的地区种植，从而大大扩大了油料作物的种植面积。它具有良好的农艺性状，例如，直立的身材，只在茎的上部分支和抗花粉甲虫[4]。由于其两年生的性质，Lepidium也是一种很好的捕获作物，对母作物大麦的种子产量有积极的影响[4，5]。这种种植制度可以减少耕作的使用，从而减少能源消耗。枸杞籽油含有一些特殊成分，如高含量的芥酸，是重要的工业原料[6，7]。此外，淫羊藿的自交性和二倍体性也是其遗传修饰的重要特征。

藜属是一种未驯化的油籽。在商业化之前，它还存在一些需要解决的问题，例如，它的含油量约为20%，而油菜籽的含油量约为45%。此外，为了满足不同行业的特殊要求，Lepidium的籽油成分还需要进一步改进。

基因工程为改善重要的农艺性状，特别是质量性状提供了更为精确和有效的方法。然而，有效的再生方案是成功进行基因改造的先决条件。对于Lepidium，关于体外再生和转化的研究非常有限。先前有报道称，将子叶作为外植体，在含有玉米素的培养基上进行2,4- d诱导后，再生率可达68.3% [8]。然而，这个效率仍然不够高，因为再生效率通常会大大降低农杆菌属感染。此外，没有任何可用于Lepidium的转换协议。在本研究中，我们系统地研究了影响淫羊藿茎部再生的一些重要因素，并成功地制定了一套高效的淫羊藿茎部再生转化方案。

植物材料

的种子l . campestre加入不。NO94-7最初在瑞典Öland收集，并在温室中进一步繁殖。

培养条件

所有离体培养体从萌发到生根均在33 μmol m的培养室内培养16 h²年代¹温度21/18°C(昼/夜)。

发芽

种子用6%次氯酸钙表面消毒20分钟，用灭菌水彻底冲洗，在含有一半MS强度的培养基上体外发芽[9]与MES, 1% (w/v)蔗糖，pH 5.8，在黑暗或光照下根据实验(详见结果部分)放置几天。

拍摄再生

除特别说明外，本研究选用光照下生长的6日龄幼苗的子叶和下胚轴作为外植体。将受伤的子叶水平放置在再生培养基上，将整个下胚轴在去除子叶、芽分生组织和根后水平放置在再生培养基上。除另有说明外，本研究中使用的所有培养基均为MS + MES, pH5.8，添加30g L¹蔗糖和2.5 g L¹Gelrite和这种培养基称为基础MS培养基。所使用的植物生长调节剂(pgr)的类型和浓度取决于实验(详见结果部分)。每3周将外植体转移到新鲜培养基上进行再生试验，每2周进行转化试验。3.5个月后记录再生结果。对于所有再生试验，每次处理的外植体数量至少为30个，所有试验至少重复两次。用再生的外植体数除以使用的外植体总数来计算再生频率。通常每个外植体只产生一个莲座，这被认为是一个芽。

卡那霉素耐药试验

以光培养6日龄幼苗的下胚轴为外植体，在添加0.5 mg L的MS基础培养基上预培养3 d¹2,4- d(2,4-二氯苯氧乙酸)，然后转移到基础MS培养基中，添加1.1 mg L¹TDZ(噻唑脲)和卡那霉素浓度分别为0、20、30和50 mg L¹．每个浓度下胚轴约100个，重复试验2次。每3周将外植体转移到新鲜培养基中，3.5个月后记录再生结果。

转换

根癌土壤杆菌菌株AGL-1进行转化。由于本研究的目的是制定一种有效的转换协议，因此我们使用二进制矢量pSCV1.6 [10只包含新霉素磷酸转移酶（nptII),β葡萄糖醛酸酶（格斯)基因。在这个向量中格斯含有内含子的基因位于35S启动子和nptII基因下号启动子。

以光照下生长6日龄幼苗的下胚轴为外植体。将外植体在预培养培养基(MS基础培养基，添加0.5 g L)上用滤纸预培养2 d¹2,4 - d)。使用滤纸的原因是为了方便外植体转移感染。将细菌在含适当抗生素的LB液体培养基中培养约18 h, 3500 rpm离心15 min后，悬浮于MS20液体培养基(MS with MES, 20 g L)中¹蔗糖，pH值为5.2)，在OD浓度为0.5左右₆₀₀．将预培养的外植体在菌悬液中彻底洗净，在滤纸上吸干，在共培养培养基上滤纸共培养，光照下培养4天。共培养培养基为MS基础培养基，添加1.1 mg L¹TDZ。共培养后，外植体用MS20液体培养基洗涤，在滤纸上干吸，置于与共培养培养基相同的选择培养基上，添加150mg L¹替卡西林和25mg L¹卡那霉素。或者在含15mg L的培养基上选择外植体¹卡那霉素进行第一次传代培养，然后用25mg L¹卡那霉素用于第二次传代培养，30mg L¹卡那霉素用于继代培养。每2周将外植体转移到新鲜选择培养基中，并在如上所述的气候室中培养。转化频率由产生转基因苗的外植体数除以用于转基因苗的外植体总数计算农杆菌属感染。通常每个外植体只产生一个芽。

芽的增殖和生根

当再生芽长到0.5 cm左右时，将其从下胚轴外植体中切除，并在Li等人描述的伸长培养基上培养。11，12]。根据Li等的研究，当芽长到2cm左右时，在生根培养基上生根。[qh]11，12]。

GUS染色

为了评估早期的转化事件，根据Jefferson等人的说法，收集推定的转基因芽的叶片进行GUS染色。[13]。

PCR和Southern blot分析

只有在选择培养基上生长良好至少两个月的植株才能进一步进行PCR和Southern blot分析。采用Aldrich和Cullis所描述的CTAB方法从体外培养的芽中提取总基因组DNA [14]。

对于PCR分析，两者都有nptII和格斯对基因进行分析以验证转基因的整合性。所使用的引物为nptII基因，5 ' -GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC-3 '和5 ' -GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA-3 '，产生411bp的产物;为格斯基因，5 ' -CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3 '和5 ' -CCCGGCAATAACATACGGCGTG-3 '，得到365个产物。PCR分析依据Zhu和Welander [15]。

用Southern blot分析证实了转化事件，并检测了转基因的拷贝数。约20个基因组DNA被酶切生态仅在pSCV1.6载体的T-DNA上切割一次的RI，而不切割nptII基因。Southern blot杂交基于Roche (Van Miltenburg[]的非放射性DIG系统。16])和nptII根据Zhu等人的方法，用与PCR相同的引物组合合成探针。[17]。

统计分析

所有再生试验的数据采用方差分析，采用土耳其程序，使用Statgraphics Plus 5.1程序进行统计分析。

PGR组合对茎部再生的影响

成熟组织的体外器官发生通常需要培养细胞去分化。据报道，生长素通过启动细胞去分化过程诱导愈伤组织形成，而细胞分裂素通过促进细胞分裂和分化来刺激器官再生[18]。这两种pgr的比例在茎部再生中起着重要的作用[19]。由于PGR及其比例的影响往往与物种有关，因此本研究进行了大量试验，以优化Lepidium芽再生的PGR条件。

以往对其他植物物种的研究表明，细胞分裂素(主要是BAP(6-苄基氨基嘌呤)、TDZ和玉米素)和生长素(主要是2,4- d、NAA(1-萘乙酸)和IAA(吲哚-3-乙酸)的组合通常能产生合理的芽再生频率[11，15，20.- - - - - -23]。在这项研究中，我们初步测试了细胞分裂素和生长素的一些浓度和组合。结果表明，除TDZ 0.44 mg L的组合外，大多数组合对枸杞均无再生效果¹NAA 0.2 mg L^{- l}其中只有10%的再生频率达到(表1)。然而，2,4 - d与玉米素或TDZ组合的结果很有希望，例如，以下胚轴为外植体时，2,4 - d与TDZ组合的再生率达到76.5%，这表明2,4 - d是一种合适的生长素类型，而NAA似乎没有效果在体外钩藤茎部再生。这一结果与Eriksson和Merker [8]，其中2,4 - d被证明对茎部再生至关重要l . campestre．

2,4- d暴露时间对芽再生的影响

2,4- d对各种植物离体再生的影响已被广泛报道[24- - - - - -27]。由于长时间暴露于2,4- d会抑制鳞茎的形成，甚至导致突变，因此我们研究了2,4- d处理对鳞茎再生的影响。结果表明，2,4- d处理2、3和4 d对下胚轴的再生频率无显著影响，但对子叶而言，2,4- d处理1 d的再生频率低于3 d(表1)2)。一个有趣的发现是，当使用低浓度的玉米素(0.5 mg L¹)，子叶可以再生嫩芽，但再生效率很低，而下胚轴则没有再生。这一结果在本研究的后续实验中得到了进一步的证实。

2,4- d浓度对芽部再生的影响

为了评价2,4- d浓度对芽再生的影响，对预培养液中2种浓度的2,4- d进行了试验。结果表明，当使用1.0 mg L¹2,4- d，无论使用哪种外植体或细胞分裂素，所有处理均导致较差或无再生(再生频率最高为27.5%)。然而，当2,4- d浓度降至0.5 mg L时¹，处理1.1 mg L¹TDZ处理下胚轴的再生频率为92.7%，是本研究所有处理中最高的，但TDZ处理和玉米素处理子叶以及玉米素处理下胚轴均未发生再生(表2)3.)。上述结果表明，2,4- d浓度对植株再生的影响不仅与外植体类型有关，还与使用的细胞分裂素类型有关。埃里克森和默克[8]报道子叶再生率最高，为68.3%，但1.0 mg L的下胚轴没有再生¹2,4- d和0.5 mg L¹玉米素。在这种情况下，下胚轴的再生失败可能是由于较高水平的2,4- d (1.0 mg L)¹)与玉米素结合使用。有研究表明，在不同物种的组织培养中，细胞内2,4- d的阈值可能在形态发生的每个阶段都需要，例如，愈伤组织的形成需要相对较高的2,4- d水平，只有当愈伤组织中的2,4- d下降到一定水平时才会发生根的形成，而芽的形成则在不可检测的2,4- d浓度下[24，26]。这些形态发生事件是通过细胞分裂和愈伤组织生长过程中2,4- d的逐渐摄取和代谢以及由于解毒或降解导致2,4- d水平的持续下降而实现的[28- - - - - -30.]。本研究结果表明，这个阈值也与外植体的类型和使用的细胞分裂素有关。此外，我们的研究结果表明，TDZ是一种更好的细胞分裂素，用于下胚轴的芽再生，而玉米素可能更好地用于Lepidium子叶的芽再生，这与Eriksson和Merker先前报道的玉米素对子叶的研究一致[8]。

TDZ对芽部再生的影响

TDZ对茎部再生的影响已有文献记载[31]。我们的研究结果表明，与2,4- d和玉米素组合相比，2,4- d和TDZ的再生频率更高。为了确定TDZ对枸杞再生的适宜水平，研究了不同浓度TDZ与2,4- d结合处理与玉米素处理的比较。结果表明，以下胚轴为外植体，预培养量为0.5 mg L，是植株再生的最佳组合¹2,4- d持续2天，然后转移到1.1 mg L¹TDZ(表4)。这样的组合就被选作后续的转化实验。值得注意的是，在本研究中，去除2,4- d后的培养基中没有添加生长素，但生长素通常是器官发生或体细胞胚胎发生所必需的。这种现象的解释可能是由于2,4- d的后效作用，也可能是由于TDZ在器官发生中具有双重作用，即既促进细胞分裂和分化，又诱导细胞去分化[32]。许多研究表明，TDZ参与调节内源性植物激素，特别是生长素和细胞分裂素[33- - - - - -37]。

细胞分裂素浓度逐步增加对芽再生的影响

众所周知，高浓度的生长素刺激愈伤组织的形成，但抑制茎的再生。在大多数研究中，通常采用高生长素/细胞分裂素比例诱导愈伤组织形成。此后，必须降低生长素水平，同时提高细胞分裂素水平，以刺激芽的形成。基于这一理论，研究了2,4- d预培养后细胞分裂素浓度的逐步增加，以评估这种处理对芽再生的影响。考虑到TDZ在器官发生中具有双重作用，我们只对玉米蛋白与2,4- d预培养不同时间的组合进行了试验。下胚轴在0.5 mg L和1.0 mg L的预培养液上培养，再生率分别为67.0%和29.8%¹2,4- d持续2天，然后转移到1.0 mg L¹在转移到2.0 mg L之前，将玉米素浸泡6周¹而1.0 mg L玉米素处理的再生频率低或极低¹玉米素只维持2周，然后转移到2.0 mg L¹玉米素(表5)。结果表明，2,4- d处理后，细胞分裂素浓度较低(1.0 mg L)，时间较长¹)可能是开始细胞去分化和愈伤组织形成所必需的，之后需要高浓度的细胞分裂素(2.0 mg L¹)用于器官分化和下胚轴外植体的新梢形成。

暗处理对茎部再生的影响

母株或外植体的暗处理可促进某些物种的芽再生[15，20.，38]。在本研究中，我们比较了不同植物生长调节剂组合对种子在黑暗和光照下萌发对茎再生的影响。结果表明，光照条件下萌发的再生频率更高，如TDZ与光照处理的组合可使下胚轴再生30%，而暗处理的再生频率为零或低得多(表2)6)。此外，暗生幼苗的下胚轴非常脆弱，难以处理。我们的研究结果还表明，低浓度的玉米素有利于子叶的新梢再生，而TDZ促进下胚轴的新梢再生(表1)6)，表中显示了类似的趋势2和3.．

卡那霉素耐药试验

在本研究中，卡那霉素试验清楚地表明，随着卡那霉素浓度的增加，再生频率在10-30 mg L之间显著降低¹．当卡那霉素浓度达到30 mg L时¹当卡那霉素浓度达到50 mg L时，再生率降至13%，再生率极低¹．当卡那霉素浓度为10 mg L时，培养物在6周后变黄¹，但在4周后，20-50毫克升¹治疗(表7)。因此，我们选择卡那霉素的浓度高达30mg L¹在随后的转化实验中。

转化效率

通过采用本研究获得的最佳再生方案，即将6日龄光生苗的下胚轴预先培养在MS基础培养基上，并添加0.5 mg L¹2,4- d持续2天，然后转移到1.1 mg L¹TDZ，我们进行了一些Lepidium转换。卡那霉素的选择在25 mg L的恒定浓度下进行¹或15毫克升¹持续2周，然后逐步增加至30mg L¹每个亚文化。8个独立转化，每个转化200个外植体，转化效率在2.9 ~ 10.7之间，平均约6%，标准差为2.87。与我们的结果相比，失败在农杆菌属由Eriksson和Merker报道的[8似乎是非优化条件，包括外植体的类型，农杆菌属菌株和PGR以及2,4- d的浓度进行再生和转化。

转基因系的恢复、茎部增殖和生根

4 - 6周后开始再生农杆菌属感染。在8 ~ 10周内再生最多，3 ~ 4个月后再生也最多。转基因苗在产苗培养基上增殖良好。转基因品系在生根培养基上的生根率接近100%，在温室中成苗率为100%(图2)1)。在某些情况下，转基因系可以在增殖培养基上自动生根。

GUS染色

在获得足够数量的植物材料进行PCR和Southern blot分析之前，首先用GUS染色法对推定的转基因系进行验证。在推定转基因株系的叶片和茎中观察到强烈的GUS表达，而在非转基因对照中未观察到蓝色(图2)2)。

PCR和Southern分析

转基因株系基因组DNA的PCR结果表明，二者融合nptII和格斯基因(图3.)。由于所有测试的无性系均为PCR阳性，因此将在选择培养基上生长良好超过两个月的植株视为转基因系，用于计算转化效率。Southern blot分析显示，杂交后显示出清晰的条带nptII探针，表明T-DNA稳定整合到Lepidium基因组中(图2)4)。图中的波段模式4显示了副本的编号nptII基因数量从1个到至少5个不等，但大多数转基因品系都只有一个基因拷贝。

淫羊藿是一种很有前途的新型油籽植物，不仅可以作为一种捕获性作物，还可以作为一种食品和工业用植物油。该品种具有高产潜力、耐寒性和直立生长习性等重要农艺性状，但也存在一些有待进一步改进的问题。没有有效的再生和转化方案可用于该物种。通过对影响淫羊藿离体茎再生的重要因素的系统研究，我们制定了一套高效的淫羊藿再生转化方案，为今后通过基因改造提高淫羊藿油的数量和质量提供了依据。

2：

4-D: 2,4-二氯苯氧乙酸

格斯:

β葡萄糖醛酸酶

乙酰天冬氨酸:

α-naphthaleneacetic酸

NptII:

Neymycin磷酸转移酶

TDZ:

的物质。

我们希望提出这篇文章，以纪念已故的阿努夫·默克教授的开创性工作Lepidium campestre．我们感谢Sten Stymne教授对这项研究的全力支持。我们感谢Mirela Beganovic, hel Lindgren和Pia Ohlsson对实验的大力帮助和支持。感谢SLU校长战略基金的财政支持。这项工作是mistral - biotech项目的一部分(http://www.slu.se/en/collaborative-centres-and-projects/mistra-biotech)，由战略环境研究基金会(MISTRA)和SLU资助。我们感谢Einar和Inga Nilsson基金会对这项研究的部分财政支持。

从属关系

1. 瑞典农业科学大学植物育种系，101,Alnarp, SE, 23053，瑞典

   Emelie Ivarson, Annelie Ahlman，李雪媛，朱丽华

相应的作者

对应到李华朱．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

EI进行了实验工作、分子分析并参与了论文的撰写。AA进行了实验工作和一些分子分析。XL进行了统计分析，参与了稿件的设计和撰写。LZ主导项目，设计和协调实验工作，设计稿件初稿，撰写稿件定稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。

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