将启动子、反向重复序列和蛋白质组学数据整合到面包小麦中与乳糜泻相关的麦胶蛋白的高沉默效率模型中

背景

小麦面筋具有独特的营养和技术特点，但也是过敏和不耐受的主要诱因。麸质引起的最严重的疾病之一是乳糜泻。由谷蛋白不完全消化而在消化道中产生的多肽会引发疾病。大多数的表位存在于谷蛋白的麦胶蛋白部分。到目前为止，通过经典育种技术或使用生物技术工具，多个醇溶蛋白基因的定位已经使它们的消除复杂化。

作为一种沉默多种麦胶蛋白基因的方法，我们生产了38个转基因面包小麦系，其中包含两个胚乳特异性启动子和三个不同的倒置重复序列的组合，通过RNA干扰沉默三个部分的麦胶蛋白。

结果

连续两年分析了RNA干扰结构对转基因株系面筋蛋白、总蛋白和淀粉含量、千粒重和面粉SDSS品质的影响。反向重复序列的特性是决定沉默效率的主要因素。所使用的启动子对沉默的影响较小，尽管当两种启动子同时使用时，可以观察到沉默效率的协同作用。基因型和环境也影响沉默效率。

结论

我们得出的结论是，要获得具有最佳毒性面筋表位减量的小麦系，需要考虑反向重复序列设计、启动子选择以及所使用的小麦背景等因素。

小麦是世界上最重要的粮食之一，被加工成面包和许多其他产品。小麦制品不仅对能量和蛋白质的膳食摄入有重大贡献，而且对人类健康也有影响，既有有益的(提供膳食纤维、矿物质、维生素、植物化学物质)，也有不利的(过敏和不耐受，这似乎越来越重要)。特别令人感兴趣的是小麦谷物的麸质部分，因为这不仅赋予了独特的技术特性，而且在不耐受和过敏中起着重要作用。面筋蛋白占面包小麦总谷物蛋白的80% (Shewry和Halford, 2002)，包括两大类:面筋蛋白和麦胶蛋白[1］．麦胶蛋白包括高分子质量(HMW)和低分子质量(LMW)，而麦胶蛋白可分为三种结构类型:α-、ω-和γ-麦胶蛋白[2］．

近年来，小麦过敏和不耐受的发病率有所增加。有0.2-0.5%的人对小麦过敏[3.而且很难管理，因为很多食品都含有小麦。小麦过敏影响成人和儿童，可引起过敏反应，并由食用麸质引发。乳糜泻(CD)，这是一种对小麦、黑麦和大麦中的麸质不耐受的疾病，在西方世界的儿童和成人中都有发生，平均频率约为1%，一些群体报告的婴儿发病率比成人高5倍[4］．谷蛋白敏感是一种新的谷蛋白不耐症[5]，排除乳糜泻和小麦过敏。目前还没有关于麸质敏感性的准确估计，但美国的初步数据(6%的人口)表明，它在普通人群中比乳糜泻更常见。乳糜泻和小麦过敏需要严格的无麸质饮食，麸质不敏感患者的目标是尽可能减少麸质摄入量。因此，开发新型无麸质小麦品种是一个重要目标。乳糜泻是研究最多的谷蛋白相关疾病。它是一种自身免疫性疾病，具有遗传和免疫成分，是摄入小麦和相关谷物中的麸质蛋白的结果。由于面筋不完全消化而在消化道产生的多肽引起小肠炎症和绒毛萎缩。自身免疫反应是由肠粘膜中的组织转谷氨酰胺酶2 (tTG2)对肽中存在的谷氨酰胺残基进行脱酰胺反应的结果。脱氨肽能够结合II类人类组织相容性白细胞抗原(HLA)分子DQ2和DQ8，刺激T细胞，导致小肠炎症反应，导致粘膜变平[6］．乳糜泻患者肠道T细胞的分离和鉴定揭示了几个不同但相似的DQ2和DQ8表位。虽然许多表位来源于谷蛋白[7]，大多数表位位于麦胶蛋白部分[8，9］．

小麦麦胶蛋白基因以紧密连接的簇(称为块)形式出现，位于第1组和第6组染色体的复杂位点[10］．在六倍体小麦中，编码α-麦胶蛋白的基因估计拷贝数在25 ~ 150拷贝之间[11ω-麦胶蛋白为15 ~ 18份，γ-麦胶蛋白为17 ~ 39份[12］．这种高度的复杂性[11，12]，而且麦胶蛋白基因是分段遗传的，这一事实使得传统育种方法获得t细胞刺激表位含量降低的小麦品种的可能性很小。

RNA干扰(RNAi)导致的转录后基因沉默是基于序列依赖的RNA降解，由与目标基因序列同源的双链RNA (dsRNA)的形成触发[13］．我们使用这种方法下调与乳糜泻相关的小麦麦胶蛋白t细胞表位的表达[14，15]，表明RNAi技术可以用于获得无毒性表位的小麦品种，可能适用于乳糜泻患者。使用特定的反向重复序列和优化的胚乳特异性启动子，驱动发夹结构的表达，是实现cd相关面筋蛋白有效下调和最小化脱靶效应的关键因素。

本研究连续2年对38个不同麦胶蛋白组分经RNAi下调的转基因小麦品系进行了分析，分析了沉默启动子和RNAi片段、基因型以及环境对面筋蛋白组分含量、总蛋白和淀粉含量、千粒重和面粉SDSS品质检测的影响。

在这项工作中，我们报告了在随机完全块设计(RCBD)中，使用两种不同的胚乳特异性启动子(D-hordein和γ -麦胶蛋白启动子)和两个沉默片段(针对γ -麦胶蛋白和所有麦胶蛋白组分)，对38种不同的麦胶蛋白组分被RNAi下调的转基因系进行了分析。我们使用了启动子和沉默片段的四种组合。使用了以下结构:载体pghpg8.1具有D-hordein启动子和抗γ -麦胶蛋白的沉默片段;载体pGghpg8.1具有γ -麦胶蛋白启动子和抗γ -麦胶蛋白沉默片段;pDhp-ω/α载体具有D-hordein启动子和靶向所有醇溶蛋白组分的沉默片段;pGhp-ω/α载体通过-麦胶蛋白启动子驱动沉默片段下调所有麦胶蛋白组分。在两年的时间内重复试验，评价环境相互作用和面筋蛋白组成，评价转基因和对照系的千粒重、总蛋白和淀粉含量，并进行SDSS试验。

麸质蛋白组分分析

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了38个转基因品系及其各自的野生型对照的麦胶蛋白和谷蛋白组分，其中蛋白质根据不同的表面疏水性进行洗脱。对于麦胶蛋白部分，洗脱顺序为ω-， α-和γ型，对于谷蛋白部分，洗脱顺序为HMW和LMW亚基[16，17］．数字1显示了BW208和BW2003对照和4个麦胶蛋白下调的转基因株系的模式1a和b)。对照品系BW208和BW2003的醇溶蛋白和LMW-GS组分模式不同，但HMW-GS组分相同(图1c、d).转基因株系与对照株系的色谱图进行比较，差异明显。以γ-麦胶蛋白为靶标的pghpg8.1和pGghpg8.1载体转化的A1158和22A，在这两种基因型的转基因株系中，γ-麦胶蛋白区域明显减少，而ω-和α-麦胶蛋白区域则增加了其峰值区域的面积1a和b)。在谷蛋白部分，这些转基因株系显示LMW-GS和HMW-GS含量增加(图1用pDhp-ω/α和pDhpg8.1载体转化的E33和用pDhp-ω/α和pGhp-ω/α载体转化的D874显示α-、ω-和γ-醇溶蛋白区域减少。E33和D874系均表现出HMW-GS的增加，但D874系也表现出LMW-GS的减少1d)。

采用色谱图谱集成技术，对全部38个转基因和野生型对照系的麦胶蛋白和谷蛋白含量进行了定量分析。采用线性混合模型分析了结构对麦胶蛋白沉默的效率及其对麸质蛋白的影响，其中总蛋白含量(用凯氏定氮法测量)作为固定协变量，iTarget和基因型作为固定效应因素，年份和Block作为随机效应(模型1;表格1)．的p-value和模型中每个效应的解释方差在表中报告1．总蛋白作为协变量，对除LMW-GS含量和总谷蛋白含量外的麦胶蛋白和谷蛋白组分有显著影响，但其对总方差的贡献在固定效应中最低。除ω-麦胶蛋白含量外，iTarget对麦胶蛋白和谷蛋白组分含量均有极显著影响，且方差解释较高。基因型对ω-、α-和γ-醇溶蛋白含量及HMW-GS和LMW-GS含量均有显著影响，但对醇溶蛋白、谷蛋白总含量和Gli/Glu比值均无显著影响1)．除ω-麦胶蛋白外，iTarget与基因型(iTarget x基因型)之间的相互作用对所有的麦胶蛋白和谷蛋白组分都显著。总的来说，基因型和iTarget x基因型的解释方差低于iTarget效应。对ω-麦胶蛋白含量有显著的随机效应交互作用。年份对ω-麦胶蛋白和LMW-GS含量及Gli/Glu比值也有显著影响，对总麦胶蛋白和HMW-GS含量也有边缘性显著影响(表2)1)．除了Year对ω-麦胶蛋白含量总方差的贡献(69.77%)外，其他变量的变化主要是由于固定效应。

因子iTarget水平比较事后多重比较分析(表2a). iTarget ' g '(构造pghpg8.1和pGghpg8.1)导致γ-麦胶蛋白含量下降，hw - gs和lw - gs含量相对于对照增加(iTarget C)。然而，总prolamin含量和Gli/Glu比值未受显著影响(表1)2a). iTarget ' o '(构建pDhp-ω/α和pGhp-ω/α)降低了ω-、α-和γ-醇溶蛋白含量、总醇溶蛋白、总prolamins和Gli/Glu比值;提高HMW-GS和LMW-GS的含量。结构' g '和' o ' (' iTarget go ')的组合对麦胶蛋白含量的影响与单独结构' o '类似，但降低了所有三种麦胶蛋白组分的水平，特别是γ-麦胶蛋白组分。与单独构造' o '相比，组合构造导致HMW-GS含量的增加较低，但相对于对照，LMW-GS含量有相应的下降。总的来说，总谷蛋白含量得到了补偿(高HMW-GS和低LMW-GS)，与对照组相比没有表现出任何差异。

为了比较两种启动子沉默麦胶蛋白的效果，转基因系的值相对于野生型对照系的值在实验设计的每个Block中进行转换(例如，2010年Block 1基因型BW208转基因系的值/ 2010年Block 1基因型BW208对照系的值)。固定效应为总蛋白作为协变量、iTarget和Promoter;随机效应为Block和Year及其相互作用(模型2;表格1)．启动子对γ-麦胶蛋白、LMW-GS、谷蛋白和脯氨酸总含量均有显著影响。此外，启动子效应解释了γ-麦胶蛋白含量的高方差(与主要因素相比)，也解释了LMW-GS和总谷蛋白含量的高方差。

启动因子比较用a事后均值的多重比较(表2b).启动子因子有三个层次，由D-hordein启动子(' D ')驱动的结构，γ-麦胶蛋白启动子(' G ')以及与' G '和' D '启动子组合的结构(' GD ')。由此可见，启动子因子对γ-麦胶蛋白、LMW-GS、总谷蛋白和脯氨酸含量有影响。结合启动子(' GD ')可以看到γ-麦胶蛋白的最强下降，而D-hordein启动子的影响最小。使用D-hordein启动子时LMW-GS的含量较高，而使用D-hordein启动子时LMW-GS含量较低。此外，当两种启动子联合使用时，它们提供的总谷蛋白含量低于单独使用γ-麦胶蛋白和D-hordein启动子。使用D-hordein启动子时，prolamin含量较高，而使用两种启动子时，prolamin含量较低(' GD ')。

Line效应也通过上述混合模型(模型3)进行了评价。Line因子对所有麦胶蛋白和谷蛋白的含量均有显著影响。为了检验转基因株系和对照株系(每个转基因株系对照其对照基因型)之间的差异，进行了多重比较(表2)3.)．根据每种情况(' g '， ' o '或' go ')中使用的iTarget沉默结构，行间均值的比较显示了预期的行为(另见表)2b) ω-、α-和γ-醇溶蛋白含量、总醇溶蛋白、总脯氨酸和Gli/Glu比值。此外，这些品系的谷蛋白含量(HMW-GS, LMW-GS和总谷蛋白含量)具有更高的可变性，并且这些并不遵循上述每种沉默结构的相同模式。因此，我们发现带有“g”、“o”和“go”的沉默结构的线，hw - gs含量与它们的对照相同，与具有相同iTarget的线一起分析时所看到的情况形成对比。对LMW-GS和总谷蛋白的含量进行了类似的观察。

千粒重、总蛋白、总淀粉、SDSS测定分析

SDSS试验结果、千粒重、总蛋白和总淀粉含量也采用上述混合模型进行分析(模型1、2和3;表格1)．总蛋白含量作为因变量进行分析，使用相同的模型，没有协变量(表1)．在模型1中，iTarget对四个因变量有显著的影响，并且具有较高的解释方差。总淀粉和千粒重的协变量效应有显著差异。基因型对千粒重和总淀粉有显著影响。iTarget与基因型互作导致SDSS值存在显著差异。对于前面(上面)分析的变量，主要影响是iTarget，所有变量的解释方差都较高。然而，对于总淀粉，基因型和总蛋白质一起解释几乎相同的方差iTarget。更显著的随机效应是SDSS的基因型x年和千粒重的年份。对这些变量进行了iTarget水平的调整均值的多重比较(表2)2a).用iTarget ' go '转化的转基因植物总蛋白含量显著提高。含有iTarget ' o '和' go '片段的转基因植株总淀粉含量和千粒重均低于iTarget ' g '和对照系。在SDSS分析中，与对照相比，含有iTarget ' g '的转基因株系的SDSS值有所增加，而含有iTarget ' go '的株系的SDSS值有所下降，而含有iTarget ' o '的株系的SDSS值略有下降(p-value = 0.0557)。

用对照转化的数据评价启动子效果的模型(模型2)表明，启动子对SDSS和千粒重有显著影响，但对总淀粉和总蛋白质含量无显著影响(表2)1)．没有随机因素对变量有重要影响。对这些变量进行了启动子水平调整均值的多重比较(表1)2b).对于SDSS变量，两个启动子的组合与其他两个启动子的组合不同，没有差异(启动子' D '和' G ')。在千粒重上，启动子“G”与启动子“D”和“GD”不同。

多变量方差分析(MANOVA)和NMDS

为了将数据作为一个整体进行分析，并确定哪些因素在该数据集中具有更大的权重，我们进行了非参数多变量方差分析(MANOVA)。对数据进行归一化分析，检验两种启动子之间的差异。MANOVA结果(表4)表明，iTarget、Year、协变量Total protein以及Block x Year和Year x iTarget的相互作用对整个数据有显著影响(表2 - 4)4；模型M1)。iTarget因素是主要影响因素，解释了42.4%的数据变异性。交互作用Block x Year(5.9%)、Year(5.7%)、Year x iTarget(3.7%)和协变量Total protein(1.6%)对数据变异性的影响较小。

经归一化数据的多方差分析显示，在这些公共因素和协变量中，结果与之前的Promoter模型(模型2)相似。在该模型中引入的Promoter因子对数据集有显著影响(表2)4；模型M2)。在解释方差方面，启动子的影响是所有显著因素中最小的。除了iTarget x基因型相互作用外，两个MANOVA模型的结果与混合单变量模型的结果相似。这种相互作用在MANOVA分析中没有显示出显著的影响，但在混合模型中是显著的。

NMDS排序图总结了本文报道的结果(图2)．个体根据用于麦胶蛋白沉默的反向重复序列进行符号化和着色(' g '，靶向γ-麦胶蛋白片段，' o '嵌合片段靶向所有三种麦胶蛋白片段，' go '，以不同结构的片段' o '和' g '组合)。每个个体都被椭圆包围，以显示每个iTarget内部的分散情况。此外，还绘制了各层次因子Year和Promoter的质心。该图最显著的特征是根据所使用的沉默片段对单个样本进行聚类。将控制样本组合在一起的椭圆(iTarget C)与其余部分明显分开。对靶向γ-麦胶蛋白片段(iTarget g)的样本也观察到了同样的结果。使用沉默片段' o '和' go '组合进行转化的个体之间重叠，但与对照组和' g '沉默的个体之间没有重叠。“g”沉默个体γ-麦胶蛋白含量较低，α-麦胶蛋白、ω-麦胶蛋白、总麦胶蛋白、LMW-GS、HMW-GS、总麦胶蛋白含量较高，SDSS值和千粒重均高于对照。用' o '片段沉默的个体，ω-麦胶蛋白、α-麦胶蛋白、总麦胶蛋白、总prolamins含量较低，Gli/Glu比值较低，但与' g '个体一样，γ-麦胶蛋白含量也较低。此外，这些品系(' o ')显示LMW-GS、HMW-GS和总谷蛋白含量增加。 Finally, individuals with silencing combination ‘go’ were very similar to those with only ‘o’, but the former had a lower overall glutenin content and a lower content of total prolamins. The Year and Promoter centroids did not show much variability, focusing around the center of the plot. However, the year 2010 showed a lower content of ω-gliadins, α-gliadins, total gliadins and total prolamins than year 2011. The Promoter factor levels showed little variation, with the Promoter ‘D’ being the most different from the other two levels (‘G’ y ‘GD’). The control samples and the silenced ‘g’ showed greater variability (greater dispersion of individuals samples) for content of ω-gliadins, α-gliadins and total gliadins.

因素相互作用分析

在上面报告的混合模型中的重要相互作用如图所示(模型1和模型2)3.和附加文件1为iTarget x Year与iTarget x Genotype之间存在显著交互作用的变量。

在iTarget x基因型相互作用中，最有趣的是SDSS测试(图3.a)和LMW-GS含量(图3.b).在SDSS测试中，基因型BW2003含有' g '片段的沉默品系的SDSS值高于对照品系，而基因型BW208的SDSS值与对照品系相同。对于这两种基因型，组合了“go”结构的转基因系与对照“C”和“g”系相比，SDSS值显著降低。然而，当使用“o”单片段时，基因型BW208的SDSS值下降并不明显。

基因型互作对LMW-GS含量的影响在基因型BW2003沉默' o '时降低，而在基因型BW208沉默' o '时增加。需要强调的是，lml - gs含量的iTarget x基因型相互作用与SDSS、总Prolamin和总谷蛋白具有相同的模式(图3.a，附加文件1然而，iTarget x基因型对hw - gs含量的相互作用在基因型和iTarget中都有所增加(附加文件)1j)。

结果表明，2010年转基因株系中ω-麦胶蛋白、α-麦胶蛋白、总麦胶蛋白和总脯氨酸含量较高，非谷蛋白含量不高。今年，“g”不发声的线条效果更为突出1f)。

在这篇论文中，我们报道了38个转基因系，来自两个基因型，不同的醇溶蛋白组分被RNAi沉默，使用三种不同的启动子组合和三种不同的沉默结构组合。在连续两年的时间里，对这些品系进行了测试，以评估启动子、沉默片段和环境对小麦麦胶蛋白下调的影响，以及沉默对其他贮藏蛋白和优质谷物成分的影响。

RNAi下调α-、γ-和ω-麦胶蛋白是降低cd相关麦胶蛋白t细胞表位表达的有效途径[15]，这可能是开发不仅适用于乳糜泻患者，也适用于其他麸质不耐受患者的产品的基础。然而，由于这种沉默的结果，prolamin的分布重新平衡，导致某些特定品系总蛋白质含量的增加[15，18]，但并不是普遍效应。在大多数研究文章中，谷物储存蛋白通过RNAi或突变沉默，作者报告总蛋白含量降低或没有变化[19- - - - - -24]报告了用“g”反义片段转化的系中总蛋白的总体增加，这与本工作中报道的数据一致。虽然总蛋白质也在沉默片段“go”转化的株系中增加，但应谨慎解释，因为总蛋白质的增加与千粒重的减少有关。据了解，未完全灌浆的籽粒蛋白质含量较高，胚与胚乳蛋白质比例较高。因此，“go”系中总蛋白质的增加可能不仅来自非面筋蛋白(白蛋白和球蛋白)，而且还来自胚胎蛋白质的更高比例。

用沉默片段' g '转化的细胞株γ-麦胶蛋白的表达明显减少，α-麦胶蛋白、ω-麦胶蛋白、HMW-GS和LMW-GS的表达增加对γ-麦胶蛋白表达的过度补偿[24］．术语过度补偿是适当的，因为γ-麦胶蛋白的减少导致总蛋白含量较高，而不是保持对照线的水平。所有麦胶蛋白的减少，伴随着沉默片段“o”或组合“go”，伴随着HMW-GS的增加和LMW ' gs的减少，除了沉默' o '的BW2003, LMW- gs也增加了。增加的HMW-GS不足以抵消麦胶蛋白的缺乏，导致总蛋白含量的降低，尽管总蛋白保持不变，甚至在“go”片段沉默的情况下有所增加。因此，总蛋白的过度补偿必须来自于非面筋蛋白，如白蛋白和球蛋白，如前所述[18](如本文对非面筋蛋白的计算所示)。这种补偿效应已经在玉米和水稻中报道过，其中一组存储蛋白质的沉默导致其他存储蛋白质的重排。在玉米中，RNAi降低的22-kDa α-zeins水平被增加的19-kDa α-zeins水平所补偿，反之亦然[25］．在水稻突变系低谷蛋白含量-1 (LGC-1)中，谷蛋白含量降低，其他种子贮藏蛋白，包括脯氨酸含量增加[26］．这种上调并不是LGC-1突变体特有的，它被认为是对谷蛋白蛋白减少的非特异性补偿。另一方面，RNAi对谷氨酸和富硫10-kDa脯胺水平的降低分别被低硫和其他富硫脯胺水平的增加优先补偿，表明含硫氨基酸可能参与了调节种子贮藏蛋白质组成。可以建议，储存蛋白质减少的转基因系，首先尝试用相关蛋白质来补偿总蛋白质含量，如果必要的话，再用不相关的蛋白质来补偿。因此，蛋白质补偿可能是一个选择性过程，因为它不使用任何种类的蛋白质来补偿。如果补偿是由氨基酸的可用性决定的，那么补偿过程可以选择性地由蛋白质氨基酸组成的相似性决定。

本文中提供的数据允许检测用于麦胶蛋白沉默的两种启动子之间的差异。虽然启动子因子只解释了部分变异，但很明显，γ-麦胶蛋白启动子具有更高的效率，这证明了γ-麦胶蛋白的沉默效果更好，但当两种启动子联合使用时，效率进一步提高。γ-麦胶蛋白启动子和联合启动子均可导致LMW-GS含量降低。驱动沉默片段的启动子对有效性的贡献由它们在目标表达期间的表达水平决定[27，28］．报告结果由[29，30.]得出结论，D-hordein和γ-麦胶蛋白启动子在小麦胚乳中均有较高的表达量，但表达谱不同。D-hordein启动子比γ-麦胶蛋白启动子在籽粒发育后期表达。γ-麦胶蛋白启动子的高效可能是由于其较高的表达水平和/或与靶基因更好的调节。然而，很明显，不仅表达水平很重要，广泛的表达谱也很重要，它允许靶基因在整个谷物发育过程中的表达。这可能是当使用两种互补启动子组合时发生的情况，从而导致更大的有效性。

在醇溶蛋白组分中，ω-醇溶蛋白含量变异最大，且环境依赖性强(年份因子解释了69%的变异)。事实上，据报道ω-麦胶蛋白在S缺乏时改变其表达(低S时增加其表达)[31- - - - - -35]和施氮(施氮量越大，ω-麦胶蛋白积累量越大)[36- - - - - -38］．在灌浆过程中，ω-醇溶蛋白在高温下的比例增加[36，39］．此外，ω-麦胶蛋白含量的高环境依赖性也可能是由于它是低效率沉默的基团。因此，与环境因素相比，iTarget因素对ω-麦胶蛋白含量的影响较小。

iTarget与基因型之间的相互作用表明，转基因品系的SDSS值在iTarget ' g '中有所增加，但仅对基因型BW2003有效，而在iTarget品系' o '中，基因型BW2003的SDSS值与基因型BW208相比下降更为明显。虽然在这项工作中首次分析了iTarget系' o '中SDSS的iTarget x基因型相互作用，但已经报道了基因型与SDSS的不同行为[24］．后一种相互作用依次与LMW-GS基因型x iTarget的相互作用相关。事实上，在SDSS值降低的BW2003系中，这与LMW-GS的降低有关。NMDS排序图显示LMW-GS含量与SDSS值高度相关。质量参数与LMW-GS含量之间也有类似的关联，[24]，部分混合参数与SDSS试验呈正相关，具有单个LMW-GS峰值和LMW-GS总含量。

在所分析的转基因和对照系中，iTarget是影响所测性状的主要因素。在本研究中，沉默是一种稳定的植物世代效应，并产生有效而持久的不同醇溶蛋白组分的减少。虽然，麦胶蛋白的沉默效率主要由iTarget因素决定，但启动子、基因型和环境因素也会影响麦胶蛋白的沉默，为了尽可能高的实现麦胶蛋白的沉默，应该考虑这些因素。

ω-麦胶蛋白是变异性最大的脯氨酸蛋白，而且它们的沉默效率较低。未来的工作应针对该蛋白质部分的操作，以获得更大和更稳健的减少其含量。γ-麦胶蛋白的沉默被α-和ω-麦胶蛋白的增加所补偿，而在较小程度上被麦胶蛋白所补偿。所有麦胶蛋白的沉默由谷蛋白含量的增加和非谷蛋白的增加来补偿。

单独使用不同的启动子具有相似的效率，但将两种不同表达模式的启动子组合使用，可以覆盖更广泛的籽粒发育阶段，从而提高沉默效率。这可能是一种有效沉默基因家族的一般策略，如麦胶蛋白，在两个不同表达谱的启动子下构建，尽可能地覆盖籽粒灌浆所有阶段的靶基因表达。

所提出的结果将支持未来策略的发展，以实现与减少麸质不耐受病理相关的更精确和有效的有毒肽沉默。

植物材料

22个转基因系t . aestivumcv ' Bobwhite 208 ' (BW208)和16个转基因株系t . aestivumcv ' Bobwhite 2003 ' (BW2003)及其对应的野生型株系用于本研究。BW2003线承载易位T1BL。1RS黑麦。使用四种发夹RNA (hpRNA)载体下调γ-、α-和ω-醇溶蛋白:pghpg8.1和pGghpg8.1载体下调γ-醇溶蛋白;pDhp- ω/α和pGhp- ω/α载体下调所有醇溶蛋白组分[15］．所述组合物pghpg8.1和pDhp- ω/α包含D-hordein启动子，而所述组合物pGghpg8.1和pGhp- ω/α包含γ-麦胶蛋白启动子[29，30.］．转基因系A1152、A1158、A1406、C655、C657、D445、D623、C217和D598含有pghpg8.1载体;行D577、D682、D715、D716、D815、22A、22C、24A和24C包含pGhpg8.1矢量;行28A, 28B, D783, E140和E146包含pDhp- ω/α向量;D770, D793和D894包含pGhp- ω/α载体;系D874和系D876含有pDhp- ω/α和pGhp- ω/α载体;E33、E35、E39、E42、E76、E82、E83和E122同时包含pghpg8.1和pDhp- ω/α载体;行E93和E96包含pghpg8.1和pGhp- ω/α向量(表2)3.)．所有转基因系均已报道或获得，如[15，24]并自花授粉四代以获得纯合子系。第二年(2011年)试验使用的种子来自第一次试验(2010年)的自花授粉植物。

反相高效液相色谱(RP-HPLC)

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)提取麦胶蛋白和谷蛋白，并按照[24］．

千粒重、总蛋白和淀粉、十二烷基硫酸钠沉降(SDSS)测定、非面筋蛋白含量计算

千粒重(g)为每个样品1000粒。每个样品进行两次测量。

全面粉的蛋白质含量由凯氏定氮含量(%N × 5.7)根据ICC标准方法no。105/2 [40］．淀粉含量按标准ICC方法no。123/1 (41］．这两个参数均以干物质为基础表示。

SDS沉降量的测定由[42］．每个试验单元设3个重复。

非面筋蛋白以μg/mg为单位计算:[总蛋白(%)*((100 -含水率%)/100)- (Prolamins含量μg/mg/10)] * 10。

实验设计和统计分析

所有分析和绘图均采用R版本2.14.1统计软件[43］．试验设计为RCBD，每株系重复3次，每小区5株。该实验设计连续重复了两年(2010年和2011年)。随机块设计由agricolae包生成[44］．变量被提交到一个线性混合模型，由限制极大似然(REML)拟合，使用函数lmer [45］．使用“年”、“块”、“基因型”、“iTarget”、“启动子”和“线”以及共变量“总蛋白”对模型进行了调整，其中“年”是进行试验的年份(2010年和2011年)，“块”是每个RCBD的三个块，“基因型”是转基因和野生型品系(BW208和BW2003)的基因型，“iTarget”是用于沉默麦胶蛋白的沉默片段(“C”是对照组，“g”是沉默γ-麦胶蛋白的结构，“o”是沉默所有麦胶蛋白的结构，“go”是两种结构结合使用时的结构)，“Promoter”是用于驱动沉默片段的启动子(“D”是D-hordein启动子，“G”是γ-麦胶蛋白启动子)，“Line”代表使用的不同转基因和对照系。“Year”和“Block”被认为是随机效应，而“iTarget”、“Promoter”和“Line”被认为是固定效应。由于籽粒蛋白质含量受环境影响较大，且对贮藏蛋白有较大影响，故采用总蛋白作为固定协变量。用于测试“Year”、“Total protein”、“Genotype”和“iTarget”效果的lmer模型是:“变量~ Total protein + (1|Year) + (1|Block:Year) + (1|iTarget:Year) + (1|Genotype:Year) + iTarget*Genotype”(模型1)。在测试两个启动子(“D”和“G”)驱动沉默片段表达的效果之前，将数据与各自的对照进行归一化。为了检验“启动子”因子的影响，使用以下lmer模型对数据进行归一化:“变量~总蛋白+(1|年)+(1|块:年)+ (1|iTarget:年)+(1|启动子:年)+ iTarget +启动子”(模型2)。使用以下混合效应模型评估对照和转基因系之间的差异:'变量~总蛋白+(1|年)+(1|块:年)+线'(模型3)。使用函数mcp生成的模型批评图检验残差是否为正态分布和方差的齐性。fnc(包LMERConvenienceFunctions) [46］．在不满足正态性和方差齐性条件的情况下，应用Box-Cox变换(函数powerTransform，包车;［47])。用函数pamer计算混合模型各固定效应的方差(或偏差)分析的p值以及被解释的偏差量(%)。fnc(包LMERConvenienceFunctions)。使用函数light (package multicomp;［48])。

为了确定总数据集中每个因素的相对重要性，我们使用函数adonis (package Vegan;［49])。非参数MANOVA模型为:“变量~总蛋白+ %年中Block% +年*基因型+年*目标+基因型*目标+系”(M1模型)。数据集中两种启动子的效果采用以下模型与归一化数据进行比较:“变量~总蛋白+ %in%Year + Year*iTarget + Year*Promoter + Promoter*iTarget + Line”(模型M2)。生成非度量多维标度(NMDS)排序图，以展示转基因和对照系与使用metaMDS(包Vegan)函数所研究的变量相关的趋势。对于这两种分析(adonis和metaMDS)，用于计算成对距离的方法是“欧几里得”，有999个排列。使用包maptools来避免排序图中的标签重叠[50］．

西班牙科学与创新部(AGL2010-19643-C02-02和TRA2009_0047)、欧洲区域发展基金(FEDER)和Andalucía(项目P09AGR-4783)支持了这项工作。费尔南多Pistón感谢西班牙节目Ramón y卡哈尔。Javier Gil-Humanes感谢高级调查机构Científicas对I3P计划的财政支持，该计划由欧洲社会基金共同资助。我们感谢Paul Lazzeri博士(Agrasys SL)对手稿和英文编辑的批评意见。同时也感谢Ana García的技术援助。

从属关系

1. 西班牙农业研究所，高级调查委员会Científicas (IAS-CSIC)， Córdoba, E-14080

   Fernando Pistón, Javier Gil-Humanes & Francisco Barro

相应的作者

对应到费尔南多活塞．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

FB构思了这项研究，设计了实验，解释了结果，并撰写了论文。JG构思了这项研究，设计了实验，解释了结果，并撰写了论文。FP构思了这项研究，设计并进行了实验，对结果进行了分析和解释，并撰写了论文。所有作者都阅读并认可了最终的手稿。

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