黄芥菜芥酸含量和硫代葡萄糖苷组分遗传连锁图谱的构建及QTL分析(Sinapis阿尔巴l .)

背景

黄芥末(Sinapis阿尔巴L.)是世界香料贸易中重要的调味品作物。它已经落后于油籽芸苔属植物物种分子标记的开发与应用。内含子长度多态性(ILP)标记具有高度多态性、共显性和高成本效益。ILP标记的跨种适用性芸苔属植物物种和拟南芥为黄芥菜农艺性状的遗传连锁定位和进一步QTL分析提供了可能。

结果

将250个ILP和14个SSR标记定位在黄芥的12个连锁群上，标记为Sal01-12。所构建的图谱全长890.4 cM，平均标记间隔3.3 cM。芥菜含量的QTL与芥菜共定位脂肪酸延长酶1（FAE1)基因。自相容性基因归属于Sal08。4-羟基苄基、3-吲哚甲基和4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷含量均由1个主QTL控制，均位于Sal02位点。鉴定出2个qtl，分别占2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷含量总变异量的20.4%和19.2%，定位于Sal02和Sal11。同源性比较分析表明，黄芥菜具有亲缘关系拟南芥在物种形成过程中经历了大量的染色体重排。

结论

构建了基于ILP和SSR标记的连锁图谱，并用于黄芥种子品质性状的QTL分析。与不同硫代葡萄糖苷组分基因紧密相连的标记将用于标记辅助选择和基于图谱的克隆。ILP标记和连锁图谱为黄芥育种提供了有用的分子工具。

黄芥末(Sinapis阿尔巴L;基因组SS, 2n = 24)是专性异交作物，具有自交不亲和的繁殖系统。它更耐热和耐旱，更能抵抗豆荚碎裂和黑腿病等疾病芸苔属植物显著而且b·拉伯［1- - - - - -3.］．黄芥末很适合加拿大西部的半干旱地区，自1936年以来一直作为调味品作物在大草原上种植[4］．调味品黄芥菜品种在种子中含有理想的高4-羟基苄基(HBEN)硫甙(GSL)成分[3.]，它会水解，在口中产生辛辣的“热”感。此外，黄芥种子中还含有3-吲哚基甲基(IND)、4-羟基-3-吲哚基甲基(HIND)和2-羟基-3-丁烯基(HBUT) GSL成分。

遗传连锁作图在分析数量性状位点(QTL)、标记和克隆控制优良农艺性状的基因以及研究基因组的组织和进化方面具有重要意义。基于各种分子标记的遗传连锁图谱的构建揭示了大范围复制和广泛的染色体重排的发生b·拉伯［5,6),b . oleracea［7),显著［8,9),b . juncea［10,11］．QTL分析确定了两个主要的芥酸含量QTL显著而且b . juncea［12,13］．将5个硫代葡萄糖苷总含量的qtl定位于中药材的A2、A9、C2、C7和C9染色体上显著［14,15］．马哈茂德等人。[16]确定了5个qtl，解释了大约30%至45%的脂肪族硫代葡萄糖苷含量变化b . juncea．

黄芥末远远落后于油籽芸苔属植物物种分子标记的开发与应用。这可能是由于以下原因。首先，黄芥具有孢子体自交不亲和的生殖系统，这使其难以形成亲本和重组自交系。其次，黄芥末不是一种主要的粮食作物，因此在基因组研究中没有得到太多的关注和资金。迄今为止，基于限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性，RFLP)标记的连锁图谱仅构建于黄芥的杂合亲本群体[17］．然而，RFLP标记技术在遗传研究和育种中的应用由于程序繁琐、成本高而受到限制。单核苷酸多态性(SNP)和简单序列重复(SSR)标记已被证明是非常有用的高密度图谱的构建显著而且b . juncea．然而，这些标记尚未在黄芥菜中得到开发。

内含子长度多态性(ILP)标记具有高度多态性、共显性、高成本效益和跨物种应用价值[9,18］．ILP引物显著,b·拉伯而且答:芥已经发展了[10,18］．黄芥末,显著而且b·拉伯属于芸苔亚族[19]，并且可能是从同一祖先物种进化而来的答:芥［10,20.- - - - - -22］．因此，ILP引物从芸苔属植物物种和拟南芥可用于黄芥的遗传连锁定位。加拿大农业和农业食品研究中心(AAFC-SRC)最近在黄芥菜中培育出双单倍体(DH)和自交系[23,24］．分子标记脂肪酸延长酶1（FAE1)和自我相容性基因也已在我们的实验室开发[25］．本研究的目的是:1)构建基于ILP和SSR标记的遗传连锁图谱₂2)鉴定芥酸含量和GSL成分的qtlFAE1以及与黄芥各自连锁群的自(内)亲和基因。

亲本系Y514与Y517的多态性

共有1726个ILP引物，其中383个来自答:芥［10]， 1093从显著250个来自b·拉伯可在潜在内含子多态性(PIP)数据库中查询[18]， 222个SSR标记，其中73个来自显著149个来自b . juncea对亲本Y514和Y517进行多态性标记筛选。在1726份ILP引物中，230份(13.3%)在亲本系之间产生了清晰的、可得分的多态性条带，大小在100 bp至1300 bp之间。230个多态性引物中，211个(91.7%)扩增出1个位点的DNA片段，18个(7.8%)扩增出2个位点，1个(0.5%)扩增出3个多态性位点。总的来说，共对250个多态性位点进行了评分，其中共显性标记141个，显性标记109个。除多态性位点外，146条引物共扩增出253条单形条带。230条ILP引物共检测到503个位点，平均2.2个位点/ILP引物。222份SSR引物中仅有14份(6.3%)扩增出亲本间的多态性片段，其中共显性5个(35.7%)，显性9个(64.3%)。利用250个ILP和14个SSR多态性标记与F₂黄芥Y514 × Y517居群。

遗传连锁图谱的构建

Y514和Y517之间的264个多态性位点分布在12个连锁群上，遗传长度为890.4 CentiMorgans (cM)1,图1)．12个连锁群的图谱长度为37.5 ~ 100.1 cM，平均标记间隔3.3 cM。按遗传长度由高到低依次命名为Sal01 ~ Sal12。Sal01和Sal02具有相似的长图谱长度和平均标记间隔。然而，Sal01在两个标记BnGMS340和At1g72740之间有一个未映射的岛(21.0 cM的间隙)。Sal04的图谱长度与Sal03相似，但平均标记间隔最大(5.1 cM)，在BnapPIP1835和BnapPIP417两个标记之间有一个未映射的岛屿(23.2 cM)。Sal05、Sal06、Sal07和Sal08的地图长度相似，在77.8 cM到70.1 cM之间。Sal07的平均标记间隔最小，为2.6 cM。Sal09和Sal10在图谱长度和标记数量上相似。Sal11图谱长度为59.7 cM，平均标记间隔4.6 cM。 The shortest linkage group Sal12 had 13 ILP and 1 SSR markers and a small average marker interval of 2.7 cM. TheFAE1该基因位于Sal03的标记At4g34700c附近，遗传距离为0.2 cM。自亲和基因位于Sal08基因BnapPIP184位点附近，遗传距离为0.8 cM。ILP标记均匀分布在12个连锁基团上，可能代表了黄芥的12条染色体。

264个标记中的大多数(83.1%)以预期的1:2:1或3:1的孟德尔比例分离。但有16.9%的标记偏离预期的1:2:1或3:1的分离比(0.01≤P≤0.05)。这些畸变标记在Sal03、Sal06、Sal08和Sal10连锁群上分布不均匀。其中29个(64.4%)位点向纯合Y517基因型倾斜，11个(24.4%)位点向纯合Y514基因型倾斜。其余5个位点(11.1%)偏向杂合基因型。有趣的是，在亲本系未观察到的DNA片段在F₁59条ILP引物杂交植株。在F₁在杂合子F中出现植株₂植物。

HBEN, IND, HIND和HBUT GSL内容的遗传

F₁种子HBEN、IND、HIND和HBUT GSL含量与自交母本种子相近(表2)2)，表明它们是由母体基因型控制的。F_3.F上的种子₂HBEN含量为0 (<0.3 μmol /g种子)和中、高(124.8 ~ 237.5 μmol /g种子)两组，表型比为1(0):3(中、高)(χ²= 1.0, P = 0.31)2a).该结果表明HBEN GSL由一个基因位点控制，且高含量优于低含量。IND - GSL含量的分离符合3(低含量种子(0.2 ~ 1.6 μmol /g种子):1(中、高含量种子(2.0 ~ 10.6 μmol /g种子))的表型比2B)，因此处于单基因控制，低含量优于高含量。F_3.种子呈连续分布，不能划分为离散的组(图2c - d)。

芥酸含量、HBEN、IND、HIND和HBUT GSL含量QTL分析

对芥酸含量、HBEN、IND、HIND和HBUT含量进行QTL分析3.)．检测到1个QTL (LOD = 83.5)，占芥子含量变异的92.3%FAE1在Sal03上的基因(图1)．1个QTL (LOD = 83.1)归属于Sal02，解释了HBEN含量变异的93.1%。它位于两个标记At3g58500和At2g40765a之间1)．1个QTL (LOD = 36.1)解释了IND 68.8%的表型变异，定位于Sal02上BnapPIP1056和At3g58500之间的区域。检测到1个HIND QTL (LOD = 13.4)，位于Sal02的标记At3g58500附近，占总变异量的35.1%。检测到2个HBUT含量qtl。第一个QTL (LOD = 7.1)占总变异量的20.4%，定位于Sal02标记At2g40765a附近的区域。HBUT的第二个QTL (LOD = 6.5)解释了总变异的19.2%，位于Sal11上的标记bnappip1011附近。HBEN、IND和HIND GSL含量的qtl以及HBUT含量的两个qtl中的一个qtl被映射到同一连锁群Sal02的一个末端区域(图2)1)．

黄芥末和答:芥

利用ILP标记对其连锁图谱进行比较分析美国阿尔巴而且答:芥(图1、表4)．黄芥的所有连锁基团均为嵌合答:芥染色体。Sal01和Sal08有标记答:芥染色体(AtC) 1、AtC2和AtC3，分别对应3个不同的保守同步性块。Sal02有四个保守块，其中两个来自AtC2，另外两个来自AtC5。Sal03包含4个保守块，其中3个来自AtC1, 1个来自AtC4。Sal04、Sal07和Sal10中含有AtC2、C3、C4和C5标记，在Sal04中分为2个保守区块，在Sal07和Sal10中分为3个保守区块。Sal05含有一个较大的AtC4保守区，包含12个标记，覆盖遗传长度为40 cM(占总图谱长度的51.4%)，以及一个AtC1保守区(图1)．Sal06以AtC1标记位点为主，Sal11以AtC5标记位点为主。Sal09是5个位点中嵌合度最高的连锁群答:芥染色体(图1)．Sal12携带三个保守的AtC3块。在黄芥的连锁群中，除了保守块外，还发现一个At染色体的部分标记分散在另一个At染色体的保守块中。

本实验室成功培育了黄芥双单倍体和高自交系。这使得我们可以利用F₂本异交作物品种中首次由纯合子亲本产生的群体。ILP引物基于内含子侧面的保守外显子序列设计，利用内含子多态性。因此，任何特定引物揭示的每个ILP标记位点都可能代表基因组中的一个基因副本。在本研究的230条ILP引物中，有50.4%的引物出现重复或三倍性位点，表明黄芥是一个次生多倍体物种。这与之前的RFLP映射结果一致[26］．这12个连锁基团很可能代表了黄芥末的12条染色体。Sal01和Sal04连锁群中出现未映射岛的原因可能是亲本系间这两个区域的多态性较低。ILP畸变位点发生的原因可能与自交不亲和标记的连锁作用有关，也可能与自然选择对具有更高活力的杂合子基因型的选择有关。在遗传图谱中，出现了标记偏析比畸变的现象显著［27),b . carinata［28］．在F₁杂交后，一些ILP引物对产生了亲本中没有的新的DNA片段，这表明亲本系两侧外显子序列发生了广泛的分化。两个亲本系中的每一个都可能只有与正向引物或反向引物互补的侧翼外显子序列，因此导致没有扩增。然而，F₁来自这两个亲本系的植物将包含两侧的外显子位点，这些外显子位点可以与正向和反向引物退火，从而产生一个新的带。

在芥子含量上检测到1个QTL，与前人报道的该性状单基因控制相一致[29,30.］．芥酸的生物合成受控于FAE1基因(31］．正如预期的那样，芥菜含量的QTL与FAE1基因在Sal03上。硫代葡萄糖苷的生物合成发生在硅果壁(母体组织)，然后转移到发育中的种子[32］．因此，HBEN、IND、HIND和HBUT含量受母本基因型控制。遗传研究和QTL定位表明，HBEN含量由Drost等报道的高含量高于低含量的一个基因位点控制。[33］．At3g58500和At2g40765a两个标记与HBEN含量链接紧密，可用于标记辅助选择和基于图谱的克隆。HBEN含量高的等位基因与IND含量低的等位基因连锁，重组频率为5.7%。HBUT的两个基因中，一个与HBEN基因在Sal02位点的重组频率为4.9%，另一个位于连锁群Sal11位点。这些结果表明，在黄芥中开发具有不同GSL谱的新种质是可能的。

HBEN是由酪氨酸产生的芳香族GSL。IND和HIND是由色氨酸衍生的吲哚型GSL, HBUT是一种以蛋氨酸为前体的脂肪族GSL [34］．在答:芥控制吲哚基GSL的QTL与脂肪族GSL的QTL不重叠，但控制种子苯基GSL积累的主要QTL与种子苯基GSL的QTL有关GS-Elong控制总叶脂肪族硫代葡萄糖苷的基因座[35］．本研究发现，在Sal02中HBEN、IND、HIND和HBUT的一个QTL在1-LOD置信区间内相互重叠。位于同一区域的4个GSL qtl是由同一基因控制，还是由黄芥中不同GSL组分的不同基因连锁控制，仍有待进一步研究。

对比synsyny分析表明，黄芥菜的连锁群与黄芥菜的连锁群共享许多保守区块答:芥．其中Sal06和Sal11主要与AtC1和AtC5有共同的标记位点。说明Sal06和AtC1可能来源于同一祖先染色体，而Sal11和AtC5来源于不同的祖先染色体。然而，也观察到大多数黄芥连锁群共享超过3条染色体的标记答:芥这意味着在黄芥的物种形成过程中发生了广泛的结构重排，如涉及祖先物种的各种染色体的易位和倒置。这与之前基于黄芥RFLP标记的作图结果一致[36］．对比映射芸苔属植物物种和答:芥同时也发现了广泛节段重排的发生b .黑质［20.),显著［37),b . juncea［10),b . oleracea［38］．之间出现的保守块美国阿尔巴而且答:芥将使基因组学知识从这种模式物种转移到黄芥菜。

目前黄芥栽培品种为异质群体品种。为了培育高产合成品种，通过清除每一代的有害等位基因，培育出耐近交的优良自交系[24］．对不同自交系的遗传多样性进行表征，对于选择具有高杂种优势的合成组分系至关重要。本研究所构建的ILP标记和遗传连锁图谱将极大地促进黄芥分子辅助育种。

植物材料及产量测绘种群

Y514和Y517两个亲本的质量概况见表2．Y514是AAFC-SRC生产的DH系SaMD3 [23］．芥子含量为0(平均0.1%)，HBEN含量为0(平均0.1 μmol /g籽)。Y517是由F₁介于Sabre品种和Svalöf高油线之间的植物(T. Olson，个人交流，2010)。芥酸含量高(平均52.9%)，HBEN含量高(平均210.4 μmol /g籽)。此外，Y514和Y517在IND、HIND和HBUT GSL含量上也存在差异(表517)2)．在Y514和Y517之间进行互交，得到F₁种子。F₁植物自花授粉产生F₂种子。150美元₂植物来自一个F₁以Y514 × Y517为材料构建遗传连锁图谱。亲代线F₁植物和F₂在AAFC-SRC的温室里种植。

DNA提取及聚合酶链式反应(PCR)

从亲本F₁和F₂采用改良十二烷基硫酸钠方法的植物[39］．ILP标记的PCR根据Javidfar和Cheng [30.］．用于SSR标记分析的PCR混合物含有50 ng基因组DNA、每个dNTP 200 μM、1倍PCR缓冲液、每个引物200 nM和1u Taq聚合酶(New England Biolabs)，最终体积为20 μl。PCR在94℃下进行，初始变性5 min;20个周期，94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s;20个周期，94℃30 s, 47℃30 s, 72℃45 s;最后在72℃下延长6分钟。片段用T7荧光标记引物(FAM, VIC, NED和PET)扩增(Life Technologies)。PCR产物在3130xl 600LIZ大小的DNA分析仪(Life Technologies)上组合分析，并使用GeneMapper 4软件(Life Technologies)进行评分。

遗传连锁图谱构建及QTL分析

LOD评分≥4.0时，采用JoinMap 4.0版本构建遗传连锁图谱[40］．使用Kosambi映射函数将重组频率转换为cM单位的映射距离[41]，并用MapChart绘制遗传图谱[42］．进行卡方拟合优度检验，以确定标记物分离是否偏离预期比例。使用P < 0.01的阈值来排除图谱构建中的扭曲标记。区间映射分析[43,44]采用MapQTL 6.0软件[45]，检测芥酸含量、HBEN、IND、HIND和HBUT GSL含量的qtl。采用置换试验(1000次重复)确定LOD的显著性水平，全基因组概率P < 0.05。岛屿定义为两个相邻标记物之间距离大于20厘米的区域[10］．

比较同音分析

将构建的黄芥菜遗传连锁图谱与已建立的24个基因块(A-X)进行了比较答:芥［46］．在黄芥的连锁图谱中，一个保守区块被定义为至少有两个来自同一区块的ILP标记位点紧密相连的区域答:芥．

映射FAE1和自我相容基因

引物对No . 1 OF (ATGACGTCCGTTAACGTA) /PR (AAGACTTGTCGTCAGCTCCA)的设计基于FAE1Y517基因序列，产生928 bp的显性标记FAE1Y517基因(曾F. and B.F. Cheng, personal communication, 2012)，而引物对No . 2 Sal-SRK I (GATTATCTCGTGTCTGAATG/ GGTAATGTCGAATCTCTCCT)是基于类I设计的年代在Y514中发现了一个640 bp的自我(in)亲和基因显性标记[25］．的FAE1基于F₂居群为Y514 × Y517。PCR反应混合液(20 μl)含有1倍PCR缓冲液，1.5 mM MgCl₂每个dNTP 200 μM，正向和反向引物各0.1 μM, 1u Taq聚合酶(New England Biolabs)和50 ng基因组DNA。聚合酶链式反应在94℃进行初始变性5 min，然后在94℃下进行45 s，退火温度下进行45 s, 72℃下进行1 min，循环30次。最后进行72°C 5 min的伸展循环。所有PCR产物均在2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳液为1x TAE缓冲液。用0.5 mg/L溴化乙锭染色观察凝胶，并在数字凝胶记录系统上拍照。

芥酸含量及GSL谱分析

亲本品系、F₁和F₂采用半种子技术确定种子[47]和Thies的气相色谱方法[48]，除此之外，甲基酯的气相色谱是用HP-INNOWax熔融二氧化硅毛细管柱(0.25 mm × 7.5 m和0.5 μm)(安捷伦技术公司)在250℃下以氢气为载气进行的。每个亲本系至少20粒种子，后代20粒₁采用半籽法测定芥酸含量。各亲本系30粒自花授粉种子的散装样品，10 F₁种子和10f_3.每个F的种子₂采用Raney等人描述的方法对植物进行GSL谱分析。[49］．在AAFC-SRC的化学实验室中从旱金莲种子中分离出苄基GSL，并作为标准品使用。

利用ILP和SSR标记构建了黄芥子中芥酸含量和硫甙组分的遗传连锁图谱，并进行了QTL分析。与控制不同硫代葡萄糖苷组分的基因紧密相连的标记将用于标记辅助选择和基于图谱的克隆。本研究的ILP标记和连锁图谱为黄芥育种提供了有用的分子工具。

AAFC-SRC:

加拿大萨斯卡通农业和农业食品研究中心

空中交通管制:

拟南芥染色体

cM:

厘摩

DH:

Doubled-haploid

FAE1:

脂肪酸延长酶1

GSL:

芥子油苷

HBEN:

4-hydroxybenzyl

HBUT:

2-hydroxy-3-butenyl

后:

4-hydroxy-3-indolylmethyl

独立:

内含子长度多态性

印第安纳州:

3-indolylmethyl

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

皮普:

潜在内含子多态性

QTL:

数量性状位点

RFLP:

限制片段长度多态性

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单的序列重复。

调味品黄芥末育种和研究项目得到了加拿大农业创新计划(DIAP)、加拿大农业创新计划、加拿大21芥公司和加拿大萨斯喀彻温省农业发展基金(ADF)的支持。

从属关系

1. 加拿大农业和农业食品，萨斯卡通研究中心，107科学广场，萨斯卡通，SK, S7N 0X2，加拿大

   Farzad Javidfar & Bifang Cheng

相应的作者

对应到Bifang程．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

BC构思了这个项目。FJ进行了研究和分析数据。FJ和BC写了这篇文章。两位作者都阅读并批准了最终的手稿。

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