叶片有丝分裂后细胞扩张增强对叶绿体增殖的促进作用

背景

叶子是确定的器官;因此，精确控制细胞增殖和临床后细胞膨胀对其生长至关重要。细胞增殖的缺陷通常触发叶片中有丝分裂后细胞膨胀。这种现象被称为“补偿”。来自补偿研究的几种证据表明，在叶片发育过程中，细胞增殖和后型细胞膨胀在叶片发育过程中是协调的。因此，补偿引起了叶片生长的机制。然而，我们对亚细胞水平的赔偿的理解仍然有限，因为补偿的研究主要集中在细胞级表型上。适当的叶片生长需要与细胞水平变化相关联的亚细胞组分的定量控制。为了进入补偿的亚细胞方面，我们研究了在补偿展线中每个细胞细胞面积和叶绿体数之间的公知关系，并询问叶绿体增殖是否响应补偿诱导而调节。

结果

我们首次建立了一种方便可靠的观察叶绿体的方法原位．利用这种方法，我们分析了拟南芥蒂利亚纳突变体fugu5和angustifolia3（AN3)和转基因细胞系KIP-RELATED实验研究overexpressor (KRP2.OE)，这些都具有典型的补偿特征。我们在这里发现，在这些细胞系的表皮下栅栏组织中，每个细胞的叶绿体数量增加了。我们分析了四倍体野生型，Fugu5，AN3和KRP2.OE发现，决定叶绿体增殖活性的关键参数不是核倍性，而是细胞面积本身。特别是在……的情况下AN3，我们发现促进叶绿体增殖依赖于增强的有丝分裂后细胞的扩张。在此过程中叶绿体增殖相关基因的表达水平与野生型相似或低于野生型。

结论

该研究表明，在展示展示线中促进了叶绿体增殖。这种促进叶绿体增殖的促进响应于细胞面积增加在歧视性后阶段AN3．叶绿体增殖相关基因的表达在包括AN3争论尚未证明的机制负责在这些线中调节叶绿体增殖。

叶片生长是由细胞增殖和有丝分裂后细胞扩张的时空控制驱动的。在叶原基发育早期，细胞增殖活跃。增殖区维持在距叶基部一定距离内，然后从叶片的远端到近端突然消失[1- - - - - -5]．有丝分裂周期停止后，细胞呈有丝分裂后扩张，液泡体积强烈增加。在叶片发育过程中，细胞增殖的缺陷通常会引发有丝分裂后细胞的增强扩张。这种现象被称为“补偿”[6- - - - - -8]，广泛见于种子植物，包括拟南芥蒂利亚纳（下文拟南芥）和水稻［9- - - - - -11]．有趣的是，我们最近的代偿研究表明，叶片生长的两种驱动力——增殖和细胞有丝分裂后的扩张——在发育过程中是协调调节的[12]．因此，补偿被认为是理解叶片生长控制的一个关键现象。

增强的有丝分裂后细胞扩张可以通过观察叶细胞从柱顶视图和测量其面积来检测。细胞面积变化的动力学表明，细胞面积的增加以三种不同的代偿表现线的方式发生angustifolia3（AN3）（增强后临床后细胞扩张率），fugu5(延长有丝分裂后的细胞膨胀)和周期蛋白依赖的激酶抑制剂基因KIP-RELATED实验研究overexpressor (KRP2.（有丝分裂和有丝分裂后阶段细胞面积增加）[10，13]．这AN3在补偿显示线中具有良好的特征AN3基因，也称为GRF-INTERACTING因子1，编码拟南芥叶细胞增殖的转录共激活剂[14- - - - - -16]．在AN3叶片，细胞数量减少超过70％，但与WT相比，细胞面积增加了50％[10，15- - - - - -17]．为了诱导增强的有丝分裂后细胞扩张，需要将细胞增殖降低到阈值以下[18].这一事实表明，有丝分裂后细胞扩增增强AN3不是简单的细胞增殖缺陷的结果，而是响应细胞增殖缺陷的叶片生长的主动运动的结果。这一观点得到了我们最近对嵌合叶的分析的支持AN3表达式:AN3突变细胞被认为积极地产生和传递细胞间信号，促进有丝分裂后细胞的扩张[12]这些研究加深了我们对细胞水平上补偿机制以及叶片生长的理解。

另一方面，亚细胞方面在薪酬展示线中包括AN3收到不太关注。叶细胞正常运作需要亚细胞组分的定量控制。解剖学研究表明，每个细胞的叶绿体数与细胞区域相关[19- - - - - -21]．在这项研究中，我们调查了每个细胞中叶绿体的数量，以研究亚细胞方面是否受补偿诱导的影响。

叶绿体来源于分生组织细胞中的前质体，并在叶片发育过程中通过分裂增殖。两个副同源核编码基因质体DIVISION1（PDV1),PDV2参与叶绿体增殖[22- - - - - -24]．PDV1和PDV2在拟南芥中表达发生在茎尖分生组织和幼叶原基中，然后随着叶绿体增殖的停止而减少[23，24]．重要的是，过度表达PDV1和/或PDV2增加叶绿体的数量，而致功能突变PDV1和/或PDV2有相反的效果[22- - - - - -24]．还鉴定了叶绿体增殖中涉及的其他组分，例如自组装细胞骨骼GTPAse基因丝状温敏Z1（FtsZ1),FtsZ2［25，一个编码含有j结构域蛋白的基因叶绿体的积累和复制6（ARC6） [26、最小系统相关基因[明克，介意，矿山和多叶绿体分裂位点1（MCD1)] [27，28]．虽然这些基因明显参与叶绿体增殖，但众所周知，它们的过表达或敲除/敲除并不促进叶绿体增殖[25- - - - - -31.]因此，叶绿体增殖的程度主要取决于刚才s、 这是值得研究的表达水平刚才以确定叶绿体增殖是否受代偿诱导的调节。

本文建立了一种简便的计算表皮下栅栏细胞叶绿体数量的方法原地。利用该方法，我们研究了代偿表现系细胞面积与叶绿体数量的关系。基于我们的结果，我们讨论了促进叶绿体增殖以响应增强的有丝分裂后细胞的扩张。此外，我们还讨论了是否通过上调表达水平来促进叶绿体增殖刚才年代。

建立叶绿体计数方法原位

我们首先建立了一种简要的方法，用于在骨髓普拉底细胞中计算叶绿体原位．关注表皮下组织的一个原因是，其中的细胞表型在代偿展示系中有很好的特征[10，12，18]．为了计算叶绿体，将21天幼株植物的第一叶浸入0.05％（v / v）Triton X-100和1％（v / v）甘油在室温下真空，然后进行观察。通过手动调整焦平面上下（图，该方法通过手动调节焦平面（图1a、e、I)，也可观察到表皮下的细胞(图1F-H)，确定该方法足以获得足够的聚焦深度来分析整个表皮下层原位．

在表现补偿的品系中，每个细胞的叶绿体数量增加

接下来，我们研究了21天龄代偿显示系的表皮下栅栏组织中每个细胞的叶绿体数量，包括fugu5，AN3和KRP2.OE。每个细胞的叶绿体数量分别增加了30%、67%和141%fugu5-1，an3-4和KRP2.与WT相比，OE线分别为（图2A).这些数据具有重复性，标准差小，证实了我们计算每个细胞叶绿体数量的方法的有效性。此外，这一结果表明，亚细胞过程(我．e(如叶绿体增殖)与代偿的诱导有关，而不管代偿发生的方式如何。此外，我们还观察了叶片细胞，并使用同样用于叶绿体计数的叶片样本测量了它们的面积。我们发现细胞面积增加了37%，65%和157%fugu5-1，an3-4和KRP2.当与WT比较时(图2一种）。细胞面积的这些增加的比率类似于每种细胞叶片数量的比率：每个细胞/细胞面积的叶绿体编号的值恒定到与WT水平相当的补偿展示线的相似程度（尽管该值是略微但显着下降KRP2.OE)(图2b）。这些结果表明，补偿展示线的颅骨特征组织中每种细胞的最终细胞面积和叶绿体数之间的紧密关系。

叶绿体增殖活性随WT叶片发育进程而降低[24]．另一方面，我们的数据表明每个细胞的叶绿体的数量与成熟叶中的最终细胞面积相关，这通过后型细胞膨胀确定。5日龄的有丝分裂细胞区域fugu5-1和an3-4lines与WT相似(图2C) (10，这支持了我们的观点，即在这些突变体中，叶绿体增殖受有丝分裂后细胞扩张状态的调节。我们应该仔细考虑有丝分裂后细胞扩张对促进叶绿体增殖的贡献KRP2.OE，因为该系有丝分裂细胞面积约为WT的2倍(图)2C) (10，13]．因此，叶绿体增殖在叶细胞有丝分裂阶段也受到调控。建立精确计数有丝分裂细胞中未成熟叶绿体的方法将有助于进一步研究这一问题。

每种细胞最终细胞区域，核倍增性和叶绿体数的关系

最后的细胞面积通常与核内再复制水平平行[32.]．此外，以前的研究表明AtCDT1a，是DNA复制前复制复合物的组成部分，定位于细胞核和叶绿体中，参与核内再复制和叶绿体分裂的调控[33.，34.]．这些事实表明，核倍增性通过eAdoreduplication方法与叶绿体增殖直接相关。然而，我们得出结论，核倍性与补偿展示线中的叶绿体增殖直接相关，因为这些系列中的核倍增性变化，即增加fugu5-1，相对正常an3-4和减少KRP2.OE与WT比较(图3.一种） [10，17，35.]．

核倍性不仅增加了eAdoreduplic，而且增加了多倍化。为了进一步探讨核倍增性增加对叶绿体增殖的影响，我们建立了四倍简化的WT，fugu5-1，an3-4和KRP2.OE线(图3.B)并在播种后21天分析其叶片。我们发现，在四倍体WT中，每个细胞的叶绿体数量分别增加了55%、43%、53%和15%，fugu5-1，an3-4和KRP2.与二倍体对应物相比，分别与二倍体相比（图3.C）。如果每个细胞叶绿体数与核倍增性线性相关，则这些增加率与预期的（100％）不同。相反，这些增加的速率类似于细胞面积：在四倍体wt中，fugu5-1，an3-4和KRP2.OE、细胞面积分别比二倍体增加了69%、34%、42%和14%(图)3.C).总之，我们得出结论，核倍性并不直接影响叶绿体增殖，最终细胞面积是叶绿体增殖的关键参数。

促进叶绿体增殖需要增强的后偶联细胞扩增AN3

我们以前确定过超小姐1（xs1）显示叶片中最终细胞面积减少的突变体[17]．这xs1突变抑制小鼠有丝分裂后细胞扩增增强AN3遗传背景(17]，但不影响有丝分裂期的细胞面积，无论WT或an3-4遗传背景（图4我们接下来研究是否促进叶绿体增殖取决于有丝分裂后期细胞面积的增加xs1 an3-4双突变系。21日龄表皮下栅栏组织中每个细胞的叶绿体数量减少xs1 an3-4相比,an3-4与最终细胞面积的减少有关(图4因此，我们得出结论，叶绿体增殖是响应增强的有丝分裂后细胞的扩张an3-4．

叶绿体增殖在代偿性表现中得到促进，而不上调表达刚才年代

以前人们认为PDV决定了叶绿体增殖的速率，因为增加或减少的水平PDV表达分别导致叶绿体增殖的增加或减少[23，24]．在WT中，PDVs的表达随着叶片的发育而降低，而我们的数据表明，叶绿体增殖是响应细胞面积的增加而促进的。这一事实表明，叶绿体增殖的控制可能比以前认为的更灵活，以响应最终细胞面积的变化。如果是这样，表示级别是否刚才在补偿显示系的叶片中，s随着细胞面积的变化而上调是一个重要的问题。

为了解决这个问题，我们询问是否通过上调基因表达来促进叶绿体增殖刚才S在补偿展示线中的表达。我们研究的表达水平刚才S在7日龄幼苗地上部分和14日龄植株叶原基中的含量。细胞面积增加的速度fugu5-1，an3-4和KRP2.OE已经高于播种后14天的WT [10]．然而，表达水平刚才在这些补偿显示线中，类似或低于小波变换(图5一种）。该结果表明，促进叶绿体增殖响应于补偿展线中的细胞面积增加并不依赖于上调PDV表情。我们进一步研究了补偿展示系中其他叶绿体增殖相关基因的表达水平，发现它们的表达水平也与WT中的表达水平相似或更低（图1）5B).这一事实表明，在代偿表现型品系中，促进叶绿体增殖并不依赖于上调叶绿体增殖相关基因的表达。

在本研究中，我们报道了一种可靠的叶绿体计数方法原位并证明在补偿展示系中每个细胞的叶绿体数量增加。核倍性不直接参与补偿显示系叶绿体增殖的控制。特别值得注意的是，叶绿体增殖在叶片发育过程中受有丝分裂后细胞状态的调节。在这个过程中刚才s和其他叶绿体增殖相关基因没有上调，这说明了一种未知的机制，可以促进叶绿体增殖以响应细胞面积的变化。这些发现突出了补偿的一个新方面，因此为叶生长的基本理解提供了重要的见解。

植物材料和生长条件

本研究中使用的拟南芥WT标记为Columbia-0。Tetraploidization WT,fugu5-1，an3-4和KRP2.OE生产线如前所述进行[36.]，其次是流动计数器分析，确认其核窝状物[37.]。植物在22°C的岩棉上生长，光照16小时/8小时黑暗，每天浇水0.5 g L^-1Hyponex解决方案。大约50 μmol m^-2 s^-1由白色荧光灯提供。

叶绿体枚举

用0.05% (v/v) Triton X-100和1% (v/v)甘油浸渍21日龄植株的第一批叶片，计算叶绿体数量(n = 160 cells from 8 leaves for each line). Detailed method is described in the Results and Discussion section.

叶片中细胞区域的测量

枚举每个细胞的叶绿体数量后，对相同的叶片样本进行细胞面积分析(n = 160 cells from 8 leaves for each line). Subepidermal palisade cells were observed under a light microscope (DMRX/E; Leica Microsystems). The leaf primordia was fixed in a formalin-acetic acid-alcohol (FAA) and cleared in a chloral hydrate solution (chloral hydrate, 200 g; glycerol 20 g; H₂O、 50 ml）测量从5天龄植株上解剖的第一片叶子中有丝分裂细胞的面积。

利用qRT-PCR定量叶绿体增殖相关基因的转录本

根据制造商的说明，使用RNEasy植物迷你套件（QIAGEN）从7天龄幼苗的地上部分的RNA从7天龄幼苗和第一个叶子的原叶中提取。使用Revertra Ace QPCR RT Mast Mix与GDNA去除剂试剂盒（Toyobo）从提取的RNA合成第一链cDNA。使用雷鸟SYBR QPCR混合物（TOYOBO）使用STEMONEPLUS实时PCR系统（Applied Biosystems）监测PCR产物。使用的引物如下：5' - CttaacgcaattCgaAccGC-3'和5' - TCCTGCTCTGTTCAAGCCG-3'PDV1， 5 ' - GCTGAACGGCTTTTGCGTAT - 3 '和5 ' - AATCAATCTCAGAGAGAGCCAGTTG - 3 '为PDV2，和5 ' - TCGGTGGTTCCATTCTTGCT - 3 '和5 ' - gctttaagcctttgatcttgagag - 3 '为ACTIN2，或按其他地方所述[38.]．叶绿体增殖相关基因的表达量归一化ACTIN2基因作为内标，相对于WT水平表达(WT = 1)。通过监测熔融曲线检测PCR扩增的特异性。数据从三个独立的生物学重复中获得，每个样本中有三个重复，并进行统计学分析。

我们感谢U. Fujikura（Potsdom Univ。）了解他对叶绿体观察的建议。This work was supported by grants-in-aid for Creative Scientific Research (No. 18GS0313 to H.T.), Scientific Research on Priority Areas (No. 19060002 to H.T.), Scientific Research A (No. 17207005 to H.T. and G.H.), Exploratory Research (No. 18657020 to G.H.), Scientific Research on Innovative Areas (No. 25113002 to H.T. and No. 25113010 to M.Y.H.), a fellowship from the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (No. 217214 to K.K.), the RIKEN Special Postdoctoral Researchers Program (No. K23253 to K.K.) and the Toray Science Foundation (to H.T.).

隶属关系

1. 东京大学科学研究生院生物科学系，7-3-1弘，东京，东京，113-0033，日本

   川田贤介、石川直子和津田广一

2. 科技大学学院生命科学系，3-34-1 Nishi-Ikebukuro，Toshima-Ku，东京，171-8501，日本

   Gorou Horiguchi

3. 日本东京富岛区西池袋3-34-1立教大学生命科学研究中心171-8501

   Gorou Horiguchi

4. 日本神奈川县横滨鹤美区穗广町1-7-22理化研究所可持续资源科学中心，神奈川县横滨鹤美区穗广町1-7-22

   Kensuke Kawade＆Masami Yokota Hirai

通讯作者

通信Kensuke Kawade．

作者的贡献

KK和HT设计了研究;GH帮助设计了这项研究;KK进行了主要部分的实验;GH建立xs1 an3-4双突变线;Ni和Ht进行了拟南芥线的四倍化;KK，GH，NI，MYH和HT写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。

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