草食动物破坏后玉米叶片倍半萜形成和释放的定位gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2BaL.)被鳞翅目食草动物破坏的叶子释放出一种复杂的挥发性混合物，可以吸引食草动物的天敌，也可能在直接防御和植物间或植物内信号传递中起作用。该挥发性混合物主要由倍半萜组成，其中大部分由两种草食动物诱导的萜类合成酶TPS10和TPS23产生。然而，对玉米叶片挥发性物质的释放模式知之甚少。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们限制草食动物进食玉米叶片的一小部分，目的是确定挥发性倍半萜在整个受损叶片和邻近叶片的释放模式。倍半萜挥发物从受损的叶子中释放的速率很高，但从相邻的叶子中释放的速率要低得多。释放仅限于损伤部位或位于损伤顶端的叶段，但在损伤基部或中脉的另一侧未见释放。发射模式与各自倍半萜合酶基因的转录模式有很好的相关性，gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba这意味着生物合成可能发生在排放的地点。在萜类分泌组织中，茉莉酸及其亮氨酸衍生物的浓度也升高，提示茉莉酸在传播损伤信号中发挥作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

与其他防御反应不同的是，玉米的防御反应通常发生在整个植株的系统中，草食动物诱导的倍半萜生成仅限于损伤部位和远端叶片部分。由于调节这一反应的信号被定向到叶尖而不能平行于叶轴传播，它很可能与木质部相连。从叶尖向受损部位的挥发物不断增加的梯度可能有助于食草动物的敌人寻找宿主或猎物。gydF4y2Ba

植物释放的挥发物使它们能够与远处的其他生物相互作用。例如，许多植物会释放花挥发物，这些挥发物在吸引和排斥传粉者方面具有不同的功能[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．植物的营养器官也释放挥发物，尤其是在草食动物伤害后。植物性挥发物可作为吸引食草动物敌人的剂[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并被认为可以直接防御食草动物[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，作为抵御病原体的手段[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，作为对抗非生物胁迫的保护剂，以及作为植物内部和植物间通信的信号[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．然而，其中一些角色的研究很少。更多地了解挥发物在树叶中的确切位置可能会揭示它们的作用。gydF4y2Ba

在过去的二十年里，玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2BaL.)已被建立为研究草食动物诱导的营养挥发物的模型系统。被鳞翅目幼虫破坏的玉米叶片会释放出一种复杂的混合挥发物，这种草食动物的寄生蜂可以利用这种挥发物在被侵染的植物上找到潜在的宿主[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．寄生蜂在寄主身上或寄主体内产卵，寄主继续取食，但通常数量减少，最终在未到成虫阶段就死亡[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此，招募食草动物敌人对植物是有益的，被称为“间接植物防御”。草食动物破坏玉米叶片的挥发性混合物由三类化合物组成:1)由类异戊二烯途径产生的单萜、倍萜和同萜烯;2)绿叶气味，如脂氧合酶途径产生的饱和和不饱和六碳醇和酯;3)芳香族化合物，如吲哚、邻氨基苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯，由石草酸/色氨酸途径产生[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．该共混物的定量和定性组成因玉米品种而异，但通常以倍半萜为主[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．虽然大部分倍半萜挥发物是从食草动物受损的叶子本身释放出来的，但在邻近的叶子中也观察到低水平的挥发物排放[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．邻近叶的混合物的成分与受损叶不同，它缺乏大部分倍半萜，但仍含有单萜芳樟醇和同萜(gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba-4,8-二甲基-1,3,7-非三烯(DMNT)和(gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba7 egydF4y2Ba) 4 8 12-trimethyl-1 3 7 11-tridecatetraene (TMTT) [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此前对玉米的研究表明，单萜和倍半萜的排放与生物合成之间存在很强的相关性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，这表明化合物在合成后不久就会被释放，而不会长期储存。但在单个叶片内部，从未研究过释放和生物合成之间的关系。大多数草食动物诱导的玉米倍半萜是由两种萜类合成酶(TPS)产生的，这两种酶都能将法尼基二磷酸(FPP)底物转化为多种结构多样的产物。萜烯合酶TPS10形成(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-bergamotene和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-法内烯和13个小倍半萜在草食动物受损的叶子中[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．用过表达TPS10的拟南芥植物试验了TPS10倍半萜对鳞翅目昆虫幼虫的间接防御作用。在初步学习后，寄生黄蜂利用了TPS10挥发物gydF4y2BaCotesia marginiventrisgydF4y2Ba找到它们的鳞翅目寄主[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．草食动物诱导的倍半萜合酶TPS23主要形成(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-芳烯，它也可以吸引寄生黄蜂到食叶食草动物身上[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．此外，TPS23在西部玉米根虫(gydF4y2BaDiabrotica virgifera virgiferagydF4y2Ba)其中(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-芳烯产物吸引昆虫病原线虫攻击食草动物[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．虽然几乎所有玉米品种都能产生TPS10产物(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-bergamotene和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-法内烯，TPS23产品(gydF4y2BaEgydF4y2Baβ-晶酚只在欧洲玉米系中形成[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．显然，许多来自北美育种项目的玉米系已经失去了表达TPS23的能力[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．除了TPS10和TPS23外，最近发现另一种萜烯合成酶参与了玉米营养挥发性生物合成。这种酶，TPS8，在几乎所有的植物器官中都有组成性表达，似乎与病原体防御有关(Fontana A, Köllner TG, Schnee S, Reichelt M, Rosenberger D, Luck K, Gershenzon J, Degenhardt J:玉米萜烯合成酶8 (TPS8)产生的挥发性倍半萜化合物的复杂混合物对一种坏死真菌具有活性gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．提交)。gydF4y2Ba

尽管有关于玉米萜类化合物释放的化学和分子基础的所有可用信息，但我们对其在单个叶片中的位置知之甚少。更多地了解玉米叶片中挥发物是在哪里产生和排放的，不仅能让我们更清楚地了解它们的功能，还能增加我们对是什么控制着合成和排放的了解。在本研究中，我们研究了草食动物受损叶片与对照叶片以及草食动物受损叶片与其余部分叶片的倍半萜释放和生物合成基因表达的模式。为了检测单个叶片部分释放的少量倍半萜，我们分析了浸渍组织释放的挥发物，并使用它们作为自然倍半萜释放的估计。基因表达和发射数据都表明，损伤诱导信号定向地向叶尖移动，而不是穿过叶中脉。对叶片内防御激素水平的分析表明茉莉酸酯参与了信号传递过程。gydF4y2Ba

倍半萜在草食动物受损的叶片中被诱导产生，但在相邻的对照叶片中只有低水平的倍半萜产生gydF4y2Ba

通过测定倍半萜释放量和TPS10转录水平，研究了玉米品种B73叶片对草食动物攻击的响应。TPS10是草食动物损伤叶片挥发性倍半萜生物合成中最重要的酶。由于没有足够灵敏的标准方法来测量小面积植物组织的头部空间挥发物，我们在液氮中浸渍叶片样本，并使用固相微萃取(SPME)分析从产生的粉末中释放的萜烯。在整株植物上进行的初步实验比较了浸渍法和传统的顶空挥发性成分收集，揭示了使用SPME纤维收集的全叶粉末释放的倍半萜的数量与完整植物释放的头空倍半萜的数量直接相关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)展示了浸渍法作为天然倍半萜排放的良好代理的价值。gydF4y2Ba

从叶子中释放出的挥发性倍半萜根据其生物合成来源可分为两类(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．第一组是草食动物诱导的TPS10的产物，包括倍半萜(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2Baα-gydF4y2Babergamotene (gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba金合欢烯和gydF4y2BaβgydF4y2Ba-sesquiphellandrene [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，而第二组是TPS8的产物，TPS8是一种多产物倍半萜合酶，在玉米品种B73的所有器官中都有组成性表达，包括gydF4y2BaαgydF4y2Ba-copaene (gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-芳塔娜A, Köllner TG, Schnee S, Reichelt M, Rosenberger D, Luck K, Gershenzon J, Degenhardt J:玉米萜烯合成酶8 (TPS8)产生的挥发性倍半萜化合物的复杂混合物对一种坏死真菌具有活性gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．提交)。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-芳烯合成酶TPS23不参与(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba- B73以来石蕊酚的形成gydF4y2Batps23gydF4y2Ba不是用这种变种表达的[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

草食动物受损叶片释放TPS10和TPS8萜类化合物的速率远高于对照叶片。对照组的叶子只释放相对较少的TPS8化合物(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．邻近的、未受伤害的草食动物诱导植物的叶子只释放出微量的TPS10产物以及与对照植物相当的TPS8萜类。转录水平的gydF4y2Batps10gydF4y2BaRNA杂交法测定。该基因在受损叶中高度表达，而在相邻对照叶中未检测到转录本。这一模式与TPS10挥发性测定结果相似，表明在玉米系B73中，除了草食动物受损的叶片外，没有系统诱导挥发性物质。gydF4y2Ba

玉米叶片中萜类化合物的释放限制在受损部位和叶尖之间的区域gydF4y2Ba

为了分析植物生长场地周围萜烯排放的空间分布，我们测量了不同叶段的萜烯排放。这些实验使用的玉米品种Delprim比品系B73释放挥发物的速率更高[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．第二个完全展开的叶子的基部、中间和顶端暴露在gydF4y2Ba美国littoralisgydF4y2Ba幼虫生长7小时。用一个小笼子来限制对相应叶段的损害。与B73释放的挥发性混合物相比(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)、Delprim生产的混合生产线(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-来自TPS23的石蕊酚，但没有来自TPS8的萜类。食草动物在叶子基部进食后，(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-bergamotene和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-法内烯(TPS10)和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-叶芳烯(TPS23)，由叶片的所有部分产生(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).然而，限于叶片中部的草食性导致只从叶片中部和上部释放倍半萜;叶基部未释放倍半萜。草食动物在叶尖取食后，倍半萜只从叶上部释放。gydF4y2Ba

倍半萜合成酶在倍半萜释放位点表达gydF4y2Ba

分析损伤部位远端叶片中发现的倍半萜是否产生gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba或者从损伤部位运输到这些叶片组织中，我们测量了基因的转录物积累gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba，在不同的叶片部位编码产生草食动物诱导的倍半萜的酶。RNA杂交证实了转录物积累的模式gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)与各自挥发性产物的含量相同(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).这表明(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba石竹烯(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-bergamotene, (gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-法内烯可能形成gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba在萜类合成酶作用下的释放部位gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23。gydF4y2Ba

介导食草动物诱导的萜烯形成的信号不通过中脉横向运输gydF4y2Ba

由于食草动物诱导的萜烯的形成仅限于叶片的受损部位和远端区域，信号必须从受损组织传递到叶尖。为了测试这种信号是否能穿过垂直于叶片轴的中脉传播，我们测量了草食动物诱导的倍半萜(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba石竹烯(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaαgydF4y2Ba-bergamotene, (gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-gydF4y2BaβgydF4y2Ba-法内烯以及相应生物合成基因的转录物积累gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba分别在中脉的两个部位，食草后仅局限于一侧(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).如前所述，损伤部位及其远端组织释放诱导挥发物和积累的转录本gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB和C)。但在中肋另一侧的相应组织中，仅检测到挥发物的痕迹，未检测到转录物(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB和C)，表明信号没有横向穿过中肋。gydF4y2Ba

茉莉酸及其异亮氨酸共轭物的积累模式与萜类化合物的释放位点有关gydF4y2Ba

植物激素茉莉酸(JA)及其异亮氨酸结合物(JA- ile)参与植物对食草动物的直接和间接防御信号传递[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在玉米中，挥发性倍半萜的释放与受损叶片中内源性JA的水平密切相关[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]而外源JA施用于切除的和完整的叶片均可诱导排放[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．为了验证茉莉酸酯是否在叶片中发挥了移动信号的作用，我们测定了玉米叶片中部被植食性动物损伤后不同部位的JA和JA- ile的含量。与对照叶片相比，植食性损伤叶片周围和叶尖远端JA和JA- ile含量显著增加(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．由于JA和JA- ile的浓度模式与萜类合成酶转录水平相似，萜类的产生很可能是由依赖于JA的信号传导过程介导的。另一种参与植物防御的植物激素，水杨酸(SA)，经常参与抗病原体反应，可作为JA拮抗剂[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．与对照叶片相比，草食导致损伤部位及以上SA水平略有下降(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．草食动物损伤叶片与对照叶片基部SA含量无显著差异。gydF4y2Ba

食草动物诱导的萜烯生物合成发生在叶内部组织，而不是在表皮gydF4y2Ba

挥发性萜生物合成的组织和细胞特异性定位有助于了解这一生化途径的调控作用和生态作用。由于使用针对重组萜烯合成酶TPS10和TPS23的特异性抗体进行的定位实验不成功(数据未显示)，我们测量了转录本积累gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba在离体表皮组织中与完整叶片进行比较，以了解萜类生物合成率在不同叶片组织中是否存在差异。用一把锋利的镊子小心翼翼地从叶子表面剥去表皮。RNA从表皮组织粉末和从所有组织中提取的叶粉末中分离得到。用特殊探针进行杂交实验gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba结果表明，两种基因转录本均在植食性损伤后的叶片中积累，而在表皮中几乎检测不到。受损表皮样品中的弱带可能只是由于剥离过程中底层组织的污染造成的。这些结果表明转录本积累gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba存在于叶肉或束鞘细胞等叶内部组织中，而不在表皮中(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

食草动物对特定植物器官的损伤常常导致系统性防御反应，如从植物的其他部位释放挥发物[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba或邻近器官中蛋白酶抑制剂等防御蛋白的产生[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，本文报道了玉米自交系B73诱导的倍半萜挥发物的损伤gydF4y2Ba美国littoralisgydF4y2Ba几乎完全局限于受损的叶片，仅在相邻的叶片中出现微量含量。在草食动物受损的叶片内，草食动物受损部位的放射量最高，向叶片上部缓慢下降，但在叶片基部几乎检测不到(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).这些结果加上叶片内生物合成基因表达和茉莉酸信号化合物的测量，对玉米萜烯排放的生理、功能和调控具有有趣的意义。gydF4y2Ba

挥发性倍半萜的排放限制在被食草动物破坏的实际叶片上，而不是在未受损的相邻叶片上，这与之前的研究相吻合[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．一般来说，当以叶片特异性的方式测量食草后的挥发性排放时，许多其他植物物种也只显示出局部的倍半萜和/或单萜的释放，主要局限于受损的叶片。例如，从霍姆橡树中释放草食动物诱导的倍半萜主要局限于草食动物出没的树叶[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．在含有草食动物诱导的单萜合酶启动子- gus融合的转基因拟南芥损伤后也观察到没有系统性反应[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．相比之下，对玉米根系受幼虫侵袭的研究gydF4y2BaDiabrotica virgifera virgiferagydF4y2Ba确实表现为系统性诱导[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-ß-caryophyllene发射被检测到在攻击部位和相邻的根。gydF4y2Ba

倍半萜挥发物从受损部位向叶尖(而不是叶基)释放，将产生一个从叶尖向受损部位增加的挥发性梯度。对于从长叶子顶端开始搜寻的食草动物敌人来说，这可能有助于寻找宿主或猎物。如果食草动物诱导的倍半萜以其他方式向其他植物或同一植物的其他部分发出信号[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，从尖端释放也可能是有价值的增加信号传输范围。另一方面，如果挥发物对食草动物起直接防御作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，它们从受损部位和叶尖而非叶底部分的释放是不容易理解的，除非食性食草动物在进食时倾向于从叶尖移动。由于分生组织的存在可能使其比叶尖更有价值，人们可能会预期从叶基部释放更多的物质。然而，从叶尖发出的更大的辐射可能是一个不可避免的结果，损伤信号通路被限制为指向叶尖而不是基部。gydF4y2Ba

倍半萜的形成定位于玉米叶片内部组织可能反映了与光合作用的联系。植物中本构性和草食动物诱导的萜烯排放通常遵循昼夜节律，白天排放最多，夜间排放最少[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．此外，此前的一项研究表明，草食动物损伤玉米幼苗叶片挥发性物质的释放依赖于光。在人工明暗循环的实验中，Gouinguene和Turlings [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]证明了植物只在光照阶段释放草食动物诱导的挥发物。在本研究中，抄本gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba在表皮中没有发现，而只在下层叶组织中发现。鉴于这一基础组织的大部分是光合作用，挥发性萜的生物合成依赖于光，这表明叶片挥发性萜的形成发生在光合细胞中。的精细的，细胞特异性的定位gydF4y2BatpsgydF4y2Ba应用特定的光合抑制剂后，对萜烯生物合成速率的转录和测量有助于更好地了解光和萜烯排放之间的联系。玉米根系中倍半萜的形成[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba似乎与光合作用没有直接联系。gydF4y2Ba

萜类合成酶在玉米中的表达位点与挥发性萜的释放位点密切相关，提示萜类产物的形成gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba并没有从受损部位转移到叶片的其他部位，如叶尖。以前用放射性同位素进行的实验明确证实，在棉花草食动物诱导的过程中，系统挥发物是在释放部位合成的[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．为了诱导叶片远处部分的萜合酶活性，必须存在一种可移动的化学信使，从受损部位移动到植物的其他部位。第一个这样的系统信号化合物，寡肽系统素，是在茄科植物中描述的[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．然而，玉米的系统损伤信号模式与茄科植物有本质的不同[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]和其他双子叶植物，因为信号只从损伤部位向顶端方向发出，而不能穿过中脉。这一信号通路与木质部的运动很像，木质部将水分和营养物质从根部输送到地上的器官，这表明移动损伤信号通过木质部移动。值得注意的是，一些植物激素，如脱落酸，细胞分裂素和独脚内酯是通过木质部的流动运输的[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物激素JA和相关茉莉酸盐可能是信号转导途径中最广为人知的成分，这些信号转导途径在食草后触发防御反应，包括许多植物物种挥发性物质的释放[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．已知这些化合物在远离草食动物损伤部位的地方起作用。无线电标记JA应用于gydF4y2Ba烟草的抗旱性gydF4y2Ba被运送到根部，在那里它被认为可以增加这些器官中尼古丁的生物合成[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．类似地，茉莉酸甲酯可以作为移动信号在gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba在那里，它通过韧皮部和木质部运输到未受损的系统叶[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．在番茄的伤口反应中，Wasternack和同事[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba的结论是JA，而不是肽系统蛋白，起着移动信号的作用。植物激素JA也可能参与玉米叶片的移动防御信号，因为它在挥发性物质排放最高的部位积累最多(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．Engelberth和同事最近报道了类似的JA积累模式[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．在这两项研究中，通过机械伤害和随后使用粗毛虫反流剂[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba或激发子n -亚麻烯酰-谷氨酰胺[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．两种处理均导致伤部位和叶尖处有较高的JA积累量，而叶基部只有微量积累量。此外，一种被认为催化JA生物合成关键步骤的酶——烯氧化物合酶(AOS)的转录本分析[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),显示,gydF4y2Ba先进的gydF4y2Ba在叶片处理部分和远端组织中表达量最高[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．由于已知AOS和其他JA生物合成基因的表达可以被茉莉酸盐诱导，我们可以推测这些化合物在玉米中也可以作为远距离信号，通过木质部从损伤部位运输到顶端叶组织，在那里它们诱导自己的生物合成以及萜烯合酶基因的表达。然而，此时不能排除转运后存在其他信号化合物在局部激活JA生物合成，以及物理过程，如创伤诱导的液压变化[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]或电子信号[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba也可能与此有关。对标记的茉莉酸酯进行进一步研究，并对玉米木质部汁液进行化学分析，可能有助于了解该物种中介导萜烯生物合成的信号的完整性质。gydF4y2Ba

我们的研究表明，草食动物诱导玉米的倍半萜生成仅限于损伤部位和远端叶片。叶尖和受损部位之间产生的挥发性梯度可能有助于食草动物的敌人寻找宿主或猎物。由于调节这一反应的信号直接到达叶尖而不能穿过中脉，它很可能与木质部相连。gydF4y2Ba

植物和昆虫材料gydF4y2Ba

玉米种子(gydF4y2Ba玉米gydF4y2BaL.)杂交种Delprim由Delley Samen und Pflanzen (Delley，瑞士)提供，自交系B73的种子由KWS种子(Einbeck，德国)提供。植物生长在商用盆栽土壤中，在一个光周期为16小时、温度控制为1 mmol (m)的室内gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}光合活性辐射，22°C/18°C(昼夜)的温度循环和65%的相对湿度。所有试验均采用12 ~ 15天的老植株(15 ~ 25 cm高，4片展开叶)。gydF4y2Ba

鸡蛋的gydF4y2BaSpodoptera littoralisgydF4y2BaBoisd。(鳞翅目:夜蛾科)从Aventis (Frankfurt, Germany)获得，用人工小麦胚芽饲料(Heliothis mix, Stonefly Industries, Bryan, TX, USA)在22°C、750 μmol (m)光照下饲养约10-15 dgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}．在草食处理中，将一只三龄幼虫封闭在一个直径为2厘米的纸板管制成的小笼子里，放在一片叶子上。所有的草食处理都在下午4点到5点之间开始，毛毛虫被允许进食19个小时。去除毛虫后，植物材料立即在液氮中冷冻。gydF4y2Ba

完整植物头部空间挥发性物质的收集gydF4y2Ba

按照Kunert等人的描述进行头空间挥发性收集。[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．植物分别放置在3升的玻璃干燥器中，密闭。以2升/分钟的速度将净化空气泵入干燥器gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}与植物接触后，通过装有30mg SuperQ (ARS, Inc.， Gainsville, USA)的过滤器离开容器。收集挥发物4小时(上午10点至下午2点)。收集后，植物材料立即在液氮中冷冻，以便进一步分析。用含醋酸壬酯的100 μl二氯甲烷(10 ng μl)内标洗脱2次，将挥发性化合物从过滤器中脱附gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba

从浸渍的树叶样本中收集挥发性物质gydF4y2Ba

将冷冻的叶子材料在臼中粉碎，再将0.2克植物粉放入盖有隔片的玻璃瓶中。100 μm PDMS固相微萃取(SPME)纤维(Supelco, Bellefonte, PA, USA)穿过隔膜，在40°C下暴露60分钟。用GC-MS对吸附在纤维上的化合物进行分析。采用外部标准对0.2 g来自对照植物的粉末状组织进行了近似定量分析，该组织不产生挥发性倍半萜，添加已知量(4.5 ng、9.0 ng、45 ng和90 ng)的(gydF4y2BaEgydF4y2Baβ-炔(Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德国)。其他化合物的响应因子通过比较相对于(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-芳烯，GC-FID检测器操作在250°C。gydF4y2Ba

气相色谱法gydF4y2Ba

采用惠普6890型气相色谱仪，载气He浓度为1 ml / mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}，无分离注射(注射器温度，220℃)，Chrompack CP-SIL-5 b - ms色谱柱((5%苯基)-甲基聚硅氧烷，25米x 0.25 mm id x 0.25 μ膜厚，瓦里安，帕洛阿尔托，美国)和温度程序从40℃(保持3分钟)在5℃gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}至240°C(保持3分钟)。耦合质谱仪为惠普5973型，具有四极质量选择检测器，传递线温度230℃，源温度230℃，四极温度150℃，电离电位70 eV，扫描范围为40-350个原子质量单位。通过与标准化合物的保留时间和质谱比较，对产物进行了鉴定。gydF4y2Ba

玉米叶片组织中植物激素的测定gydF4y2Ba

植物激素的分析遵循Wang等人描述的程序。[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在含有0.9 g FastPrep基质的FastPrep试管中收集250 mg的组织样本(BIO 101, Vista, CA, USA)。乙酸乙酯(1 ml)，加200 ng DgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba茉莉酸，40 ng DgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba-水杨酸和40纳克茉莉酸-gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-异亮氨酸添加到每个样品中，然后在FastPrep均质器上均质(Savant Instruments, Holbrook, NY, USA)。在12,000离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下处理20分钟，将上清转移到新鲜的1.5 ml Eppendorf管中。用1ml乙酸乙酯重新提取小球并离心。然后在真空下将组合的上清液蒸发至干燥。残渣重悬于0.5 ml 70%甲醇/水(v/v)中，混合5分钟，离心。上清液采用HPLC-MS /MS分析。测量在1200L LC/MS系统(Varian)上进行。流速为0.1 ml / mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}，每个样品10 μl注入到ProntoSIL c18 - aes - eps色谱柱(50 × 2 mm, 5 μm, 120 Å， Bischoff, Leonberg，德国)。流动相由溶剂A(0.05%甲酸)和溶剂B(甲醇)组成，以梯度模式进行分离。这些化合物在ESI阴性模式下检测，并如Wang等人所述进行定量。[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

核糖核酸杂交gydF4y2Ba

根据制造商的说明，用RNeasy植物小试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)制备植物RNA。为了验证RNA的均匀装载，凝胶用溴化乙锭染色并观察。一个400 bp的片段，包含的前两个外显子gydF4y2Batps23gydF4y2Ba作为探针，用引物5gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba——GAACTTCAAAAATACATCAGA-3gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba和完整的ORF [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]作为模板。的子gydF4y2Batps10gydF4y2Ba由pASK-IBA7结构扩增而来[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba引物向前:5gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba-ATGGTAACCTGCATTAGCGCATGGATGCCACCGCCTTCCAC-3gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba和反向:5gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba-ATGGTAACCTGCATTATATCAGAATAATGATATTGGATCCACAAAGA-3gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba．该片段作为模板，用引物5进行线性PCR合成1196 -bp探针gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba-TACTTGAAAGGCTCCCACC-3gydF4y2Ba^”gydF4y2Ba．这些探针被贴上了gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba使用条带- ez PCR方法检测三磷酸腺苷(Ambion, TX, USA)。在nytrans - plus尼龙膜(Schleicher & Schuell，德国)上进行印迹，按照标准程序进行杂交和洗涤。用Storm 840磷成像仪(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA)对印迹进行扫描。因为最近对玉米基因组测序的BLAST分析显示没有gydF4y2BatpsgydF4y2Ba具有高度相似性的基因gydF4y2Batps10gydF4y2Ba而且gydF4y2Batps23gydF4y2Ba在美国，北方探测器的交叉杂交可能性不大。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

相关样本的统计显著性分析采用单向重复测量方差分析或独立样本的双向方差分析。数据正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov检验，方差相等性检验采用Leveen检验。在非正态性和/或不等方差的情况下，记录数据gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba-变换或分析的曼-惠特尼秩和检验。p<0.05表示数据有显著差异。gydF4y2Ba

我们感谢延斯·沃利策提供的出色技术援助。这项工作得到了德国研究基金会和马克斯-普朗克学会合作研究项目SFB648的支持。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 克丽丝汀SchneegydF4y2Ba

   现住址:德国耶拿，07743,Naumburger Strasse 96a, Friedrich Löffler研究所gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 马克斯·普朗克化学生态研究所，德国耶拿Hans-Knöll-Strasse 8, D-07745gydF4y2Ba

   Tobias G Köllner, Christiane Schnee, Sabrina Köpke & Jonathan GershenzongydF4y2Ba

2. 马丁-路德大学Halle- wittenberg药学院，德国Halle/Saale, Hoher Weg 8, D-06120gydF4y2Ba

   克劳迪娅·伦克，彼得·林德曼和Jörg德根哈特gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba托拜厄斯G KollnergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

TGK、CS、CL、SK和PL进行了实验工作。CL进行统计分析。JD和JG参与了研究的设计，并对稿件进行了改进。TGK构思了这项研究并起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

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再版和权限gydF4y2Ba