长途运输的赤霉酸不敏感信使rna在烟草benthamiana

背景

赤霉素(GA)信号受时至今日（赤霉酸不敏感)阻遏剂，其特征是高度保守的n端DELLA域。DELLA域的删除导致GA信号的本构抑制。随着时至今日转录本在韧皮部中可转运，一个Δ-DELLA时至今日（时至今日)转基因砧木可通过转运使接穗矮小时至今日从细胞液中提取mRNA。然而，人们对油菜接穗的特性知之甚少时至今日股票。

结果

拟南芥Δ德拉时至今日（时至今日)与T7表位标签融合，并在伴随的细胞特异性表达启动子的控制下表达，黄斑驳病毒促进子(CoYMVp)，以促进韧皮部的运输。CoYMVp: Atgai-T7 (资本利得税)转基因烟草benthamiana表现为矮秆表型，对GA增强的敏感性较低。野生接穗，野生接穗资本利得税股票包含两个Atgai-T7mRNA和翻译产物。阐明了微阵列分析的效果资本利得税砧木在接穗上的基因表达模式清楚地揭示了WT接穗上的性状资本利得税基因表达在GA处理后发生变化的种群较少。一个苹果砧木品种，马吕斯prunifolia综合CoYMVp:Atgai可适度降低苹果品种接穗的树高。

结论

我们的结果表明AtgaimRNA可以从伴生细胞移动到筛管，翻译产物停留在它被运输到的位置，通过减少许多基因的表达，导致GA反应的衰减。一个苹果品种在砧木上的半矮化诱导Atgai表明从移植物中长距离运输mRNA适用于园艺作物。

赤霉素(GAs)对被子植物生长调控的重要性已被赤霉素缺乏突变体的表型所证实。的GA-deficient拟南芥ga1-3突变的缺乏ent-kaurene合成酶A, GA生物合成途径中的一种酶，表现出特征性的严重矮化表型[1］．突变体等ga1-3是在许多不同的植物物种中观察到的对GA敏感的矮化突变体，它们通常携带隐性突变，降低GA生物合成酶的活性[2］．对各种GA反应突变体的进一步分子表征导致了GID1（赤霉不敏感矮人1)和DELLA蛋白，它们是GA- gid1 -DELLA分子机制的关键组成部分，使植物对GA作出反应[3.］．遗传和分子研究已经确定了GA受体和GA信号级联的几个阳性和阴性成分[4，5］．其中，三个主要的角色是GA受体、DELLA抑制蛋白和控制DELLA蛋白稳定性的F-box蛋白。Ueguchi-Tanaka等人[6)表明,GID1是水稻中的可溶性GA受体(栽培稻)．通过分子克隆编码现在称为DELLA蛋白的基因，发现了内源性植物抗ga生长抑制因子的分子特性。

的拟南芥丐帮突变导致显性ga不敏感侏儒症[7，8］．插入突变的方法促进了分子克隆时至今日通过隔离Dstransposon-inactivated等位基因(9］．的时至今日开放阅读框携带了一个小的帧内缺失突变，因此编码了一个改变的产物，一个突变gai蛋白缺少17个氨基酸片段，现在称为DELLA结构域，以其前5个氨基酸命名。对ga不敏感矮化突变体的分子遗传分析也发现了F-box蛋白(斯莱1)，它是与DELLA蛋白的c端区域相互作用的E3泛素连接酶的一部分[10- - - - - -12，并将DELLAs作为蛋白酶体分解的目标。DELLA蛋白被认为抑制植物生长，赤霉素通过克服这些蛋白的抑制作用来促进生长。的拟南芥gai-1该突变体有51 bp的缺失，编码了部分保守的DELLA结构域。如上所述，Δ-DELLA形式的GAI作为一种功能获得突变体，可以抑制GA信号通路的某些成分[9］．的表达拟南芥丐帮在水稻中产生矮化表型，这表明GAI在植物科之间足够保守，使其能够发挥作用[13］．

海伍德等人[14已经报道了RNA的长距离传递拟南芥ΔDELLA-gai（Atgai)基因。在嫁接实验中，他们证明了时至今日转录本特异性进入功能筛元，诱导番茄叶片表型发生高度可复制的变化AtgaimRNA被运送到番茄茎尖[14］．木本植物中GAI转录本的长距离转运(马吕斯而且Pyrus)亦已证实[15，16］．哈姆等人[17]报道了多嘧啶束内的结合基序时至今日mRNA参与了可移动核糖核蛋白复合体的形成，并提出了基序的存在是长距离运输的必要和充分条件时至今日成绩单。此外，黄和玉[18]报道了GAI RNA的转运是由编码序列和3 ' -未翻译区域之间存在的特定RNA基序介导的。

使用嫁接系统的实验已经提供了几个转录本跨越嫁接结合的长距离运输，例如CmPP16(编码16-kDaCucurbita最大值韧皮部蛋白质)[19]，CmNACP（Cucurbita最大值non-cell-autonomous蛋白质)[20.]，亲(pyrophosphate-dependent磷酸果糖激酶)-LeT6［21，22]，StBEL5（茄属植物tuberosumbel1样转录因子)[23，24),辅助/ IAA14［25，26］．然而，没有详细的分子机制涉及，特别是生理功能时至今日mRNA转运系统，已被阐明。在本研究中，我们进行了表征时至今日mRNA通过韧皮部转运Atgai以转基因烟草为实验材料。结果表明，小品系可成穗Atgai根茎中含有Atgai蛋白，其生长反映了许多GA响应基因的表达减弱。

Atgai转基因烟草表现出矮化和对GA的低敏感性_3.

过度表达转基因植物Atgai在番茄、烟草和苹果中都表现出了矮化表型。16，27，28］．自AtgaimRNA已被证明可通过韧皮部运输，这是一种T-DNA结构，含有表达的结构Atgai（资本利得税)由伴生细胞特异性启动子驱动(图1)被纳入n benthamiana通过农杆菌属转换。资本利得税转基因烟草植株明显表现出半矮化表型，在种植后7天没有表现出像WT植株那样的加速生长。即使在GA治疗后资本利得税植株的身高只有小幅增加，大约是WT植株的四分之一(图2)．

资本利得税砧木影响WT接穗生长

以确定是否资本利得税根茎影响WT接穗生长的原因是AtgaimRNA的转运，由WT接穗和a资本利得税股票(WT /资本利得税)、CgT接穗和WT砧木(资本利得税/WT)_3.(图3.)．Self-grafted WT和资本利得税植物(WT / WT和资本利得/资本利得)也准备好了。这些嫁接植物生长在花盆里的土壤上，并喷洒有或没有GA的水_3.．ga处理的WT/WT和WT/资本利得税组合表现出典型的GA响应表型:快速伸长，细长生长形态，叶片偏黄资本利得税/资本利得税两者的结合就不那么明显了(图4)．此外，WT/资本利得税约为WT/WT的一半，说明WT接穗嫁接到资本利得税对GA不那么敏感_3.．

采用水培培养，如图所示3.，精确测量了移植物茎和根的生长速率。的资本利得税根茎降低了WT接穗的身高资本利得税接穗也减少了WT砧木的长度(附加文件1)．观察的效果资本利得税测定了四种嫁接组合的植株质量、茎鲜重和根鲜重。茎部和根部质量最高的组合为WT/WT，其次为WT/资本利得税，资本利得/WT,资本利得/资本利得(图5)．构建了直方图(附加文件2)使用这些个别的移植物资料。尽管单个移植物的生长速率差异明显，资本利得税明显降低了嫁接接穗的生长速率。

运输AtgaimRNA通过移植物结合

任何影响的资本利得税砧木在WT上的嫁接会因长途运输而造成AtgaimRNA通过移植物结合。为了证实这一点，采用RT-PCR检测移植材料中的突变mRNA。63个WT/中的13个WT接穗资本利得税配对组合显示扩增清晰Atgai预测尺寸的乘积，347 bp(附加文件3.)，说明长途运输Atgai在一些移植物中出现了转录本，而在21个WT/WT配对组合中未检测到产物。为了量化运输Atgai我们选择了6 WT/资本利得税接穗随机挑选，试图检测Atgai用qRT-PCR检测其转录片段(图6)．6个WT接穗样品中的3个明显显示出扩增产物;其他细胞显示出非常少量的扩增产物，只能通过qRT-PCR检测到。扩增片段的测序证实它们来自Atgai从而证明了mRNA通过移植物结合的运输在个体之间是不同的。

atge - t7蛋白在WT/资本利得税结合

自Atgai在Δ-DELLA-Atgai砧木上嫁接的WT接穗中是否也存在mRNA。WT/WT和的接穗资本利得/资本利得均质移植物分别作为阴性和阳性对照(n >5)。叶从五个接穗的WT/资本利得税的组合,Atgai检测到mRNA阳性，仔细收集并使用T7-tag抗体进行Western blotting分析(图7)．在嫁接到atgait7上的WT接穗中检测到一个与atgait7的预测大小(57 kDa)非常匹配的清晰条带资本利得税股票．虽然认为Atgai mRNA可从资本利得税将砧木转移到WT接穗，然后在接穗组织中转化为蛋白质，蛋白质本身从砧木转移到接穗也是一种可能。

WT接穗GA响应的衰减资本利得税微阵列显示股票

详细研究接穗上的遗传效应反应资本利得税利用从WT/的接穗中获得的三个mRNA样本进行了微阵列分析资本利得税(GA)、WT/WT(GA)和WT/WT组合(括号中的GA表示GA_3.-处理的植物，如图所示3.)，以及*WT/WT (GA)与*WT/WT和*WT/导致的基因表达变化的差异资本利得税(GA)与*WT/WT组合(*WT表示用于RNA提取的样本)进行比较。在18,588个独特基因中，在两个组合中至少一个表达变化超过100和低于0.01的基因被删除。选择剩下的18418个基因，将其表达变化绘制在X- y散图上，其中X轴= *WT/WT(GA) vs *WT/WT, y轴= *WT/资本利得税(GA) vs *WT/WT(图8)．各样图的回归线均接近x轴，斜率为0.775，说明*WT/资本利得税(GA)组合弱于*WT/WT (GA)组合中的基因。为了证实这一点，我们将18,418个基因的数据根据表达变化的程度分为9类(Table1)，并比较了*WT/WT(GA)与*WT/WT和*WT/的基因数量分布资本利得税(GA)和* WT / WT。前者的表达变化显示，2115个基因(≥2)表达增强，1754个基因(≤0.5)表达减弱。另一方面，在后者的表达变化中，分别有1827个和1494个基因表达增强和减少。共有548个基因(3869 ~ 3321)表达发生E类变化(≤0.5~≥2)。这些结果清楚地表明，WT接穗生长资本利得税基因表达在GA处理下发生改变的基因较少，导致基因表达发生改变资本利得税砧木减弱了WT接穗的GA响应。

Atgai苹果砧木降低接穗品种的身高

马吕斯prunifolia是一种非矮秆型的苹果砧木，主要在日本使用。我们试图改变m . prunifolia通过引入Atgai基因的农杆菌属方法。在两次转化实验中，获得了几个假定的转基因株系。通过在含有选择标记的培养基上繁殖，只有一个株系(atgai26)被Southern blot杂交证实为转基因株系4)．获得单一转基因系的局限性可能是由于转基因效率低马吕斯物种和影响Atgai引入，抑制GA信号。的Atgai-26m . prunifolia表现为半矮化表型，对GA处理的敏感性降低，正如情况一样资本利得税烟草(附加文件5)．此外，atge -26砧木和苹果品种“Orin”接穗之间的嫁接显示出明显的枝条矮小(图9)．虽然这些结果是基于单个转基因苹果株系，但数据与烟草的结果一致。

GAI的DELLA结构域缺失导致突变型生长抑制剂的本构激活，其遗传优势作用不再被GA所反对。自时至今日是一种半显性和功能获得突变[8),集成时至今日转化为WT的结果是半矮化表型，这有助于绿色革命[29］．几种作物的高度，包括水稻[13]，菊花［30.),烟草(27和apple [28]，已被转化为ΔDELLA-GAI（时至今日)，与拟南芥gai-1等位基因。在所有情况下,ΔDELLA-GAI（时至今日的控制下表达CaMV 35 s（花椰菜花叶病毒35 s启动子)。

另一方面，时至今日mRNA能够穿过韧皮部，并被认为在其被运送到的部位起作用[14，18］．当胞间连丝将韧皮部的功能性无核筛素与邻近的伴生细胞连接时[31]，该通路被认为允许信息大分子选择性进入韧皮部易位流。在这项研究中，Atgai转基因是通过植物病毒CoYMV的启动子传递的，CoYMV仅在伴生细胞中表达强烈[32］．有趣的是,资本利得税与使用35S启动子时的情况一样，转基因烟草植株也表现出半矮秆表型，表明表达Atgai只有在伴生细胞中才能诱导出明确的矮化表型。因此，建议时至今日伴生细胞中的转录本非细胞自主地调控植物的生长。此外，较不敏感的遗传效应在小波接穗上资本利得税根茎表现出较强的非细胞自主效应时至今日成绩单。在高等植物中时至今日通过韧皮部的mRNA运输可能在植物器官间的生长模式整合中起作用[14］．在我们的实验中，不仅仅是积分Atgai也是现存的n benthamiana丐帮被认为是由相同的分子机制传递的。通过移植物结合对这两种基因转录本的运输进行详细的分析可望澄清时至今日信使rna长途运动。

我们检查的移植物中约有四分之一没有显示RT-PCR产物时至今日mRNA从细胞株中运输。RNA在筛管中的长距离运输似乎是由RNA结合蛋白介导的。哈姆等人[17识别了参与mRNA运输的rna结合蛋白，并提出了一个核蛋白复合体在韧皮部移动的模型。很明显，RNA也会与伴侣蛋白结合以保持稳定性并传递到目标组织[18］．当然，这样大的复合体必须通过移植物联合，在那里，维管束在愈伤组织中生长6)．新创通过筛管往往是非正统的，表现出诸如弯曲路径等特征，从而破坏了大型核糖核蛋白复合物的通过，在极端情况下，这些复合物会被堵塞。由于导管的导电性与导管半径的四次方成正比(Hagen-Poiseulle定律)，导管直径稍微减小就会造成通过障碍。另一方面，许多园艺作物的嫁接是一项很发达的技术，这种现象在这类植物中可能问题较少，这表明随着生长的进行，它们可以在嫁接连接处建立近乎完全的筛管连接。

没有其他的报道确定翻译蛋白来自运输时至今日mRNA的接枝实验。在WT接穗上资本利得税股票,时至今日与t7标签肽融合的蛋白清晰可见。它的数量被认为是大约三分之一的资本利得税股票，建议有效翻译时至今日接穗中的mRNA。然而，有一种可能性是，该蛋白质可能在伴生细胞中被翻译，然后通过移植物结合体移动。为了澄清这一问题，有必要进行一个高精度的检测筛元中GAI蛋白的实验。

我们目前的微阵列实验也是第一个研究mRNA在嫁接植物中的长距离转运的实验。总体结果清楚地表明，小波接穗生长资本利得税与WT砧木上的接穗相比，WT砧木对GA处理的基因表达改变较少。已知GA对从开花到结果的整体生殖生长有显著影响[33］．因此，虽然我们成功地种植了一棵矮小的苹果树Atgai砧木，这种操作对随后果实发育的影响将需要仔细调查。然而，许多作物的半矮化栽培可能是可行的Atgai -表达根茎。此外，应用不仅时至今日还包括其他韧皮可转运的mrna [21，23，26通过嫁接就可能成为可能。最后，目前的结果表明，非转基因接穗可以通过转基因砧木进行改良，因此，植物的果实将不包含插入的DNA序列。作为一种农业创新方法，使用转基因砧木进行嫁接有望成为人们关注的焦点[34］．

本研究首次证实了表达ΔDELLA-的转基因作物时至今日基因通过伴随细胞的特异性启动子能够转移时至今日-mRNA到野生型接穗。此外，本研究提供了第一个证据，翻译的产物时至今日mRNA存在于接穗中。此外，微阵列数据清楚地表明，在ΔDELLA-上的野生型接穗中有许多ga响应基因时至今日股票表现出减弱的反应。

植物材料和生长条件

烟草benthamiana生长在MS上[35琼脂(Wako Pure Chemical Industries Ltd, Osaka, Japan)放在有盖培养皿或玻璃瓶中。嫁接烟草植株在土壤上以荚栽培。水培培养还使用漂浮在水培溶液上的泡沫聚苯乙烯板进行(日本大阪大冢化学株式会社大冢屋1号和2号)。培养温度为24℃，光周期为16:8 h，温度为100 μmol m^－2年代^－1由冷白荧光管提供。野生苹果根茎(马吕斯prunifoliaBorkh。var。林格Asami Mo 84-A)用于改造。的移植马吕斯植物被移植到豆荚上，在温室里生长。36］．

二元向量的构造

拟南芥种子(时至今日-1, CS63)是由拟南芥生物资源中心(俄亥俄州立大学)。用CS63植株提取RNA片段，获得完整的cDNAAtgai保守DELLA结构域编码区缺失51个bp的基因[9］．Xba我和囊I限制性位点被添加到5 ' -和3 ' -位点上Atgai用引物AtgaiXba和AtgaiSac进行PCR扩增7)．删除了GUS片段pBI121与Xba我和囊我(37，然后用新的替换Atgai片段。35S启动子被从载体中删除萨尔我和双消化由同Spe我和Xbai。黄斑驳病毒启动子(CoYMVp)的pCOI [38)(来自Neil Olszewski教授，明尼苏达大学，圣保罗，MN，美国)，特异性表达在伴侣细胞中[39]，用引物coymvprofpal和CoYMVproRPSpe扩增，然后用萨尔我和SpeI网站(附加文件7)．将t7表位标记序列(MASMTGGQQMG, Invitrogen, USA)插入到3 ' -位点CoYMVp: Atgai通过聚合链反应。正向引物为CoYMVproFl，反向引物为包含t7表位标记序列的T7tag R。对新矢量进行测序以确保插入正确。的CoYMVp: Atgai-T7（资本利得税)融合基因克隆于pBI121(图1)携带诺-卡那霉素耐药盒。用引物CoYMproFP1和AtgaiR1对转基因株系进行PCR鉴定，检测Δ-DELLA -gai。kihyufg(附加文件7)．

嫁接实验

根据Bai等人描述的方法进行显微嫁接。[40］．简单地说，如图所示2种子萌发后10天，在体视显微镜下在干净的平台上接枝。植株在子叶以下约3毫米水平切割。用硅胶管(φ 0.4 mm × 0.1 mm，长3 mm)将接穗(带子叶的组织)和砧木(底部带根的组织)固定在一起;日本大阪,TechJam)。在MS琼脂培养基上，将嫁接的植株靠在琼脂块上。移植后7天，切断硅胶管。然后在土壤中或使用标准营养液(日本大阪大冢化学株式会社大冢屋1号和2号)培养移植物，直到表型观察或取样。在马吕斯植株，继代苗间进行裂接。

遗传算法_3.治疗

在培养皿中生长7天的嫁接植株转移到有苗圃土壤的花盆中。1周后喷涂0.1 mM GA_3.(Nakarai Tesque, Inc.)含0.02% Tween 20，每两天一次，持续三周。采用水培法培养9 d，然后喷洒0.1 mM GA，进行RT-PCR、蛋白提取、微阵列和幼苗身高测定_3.解决方案_．

RNA提取，RT-PCR和qRT-PCR分析

用TRIzol试剂(Invitrogen, Tokyo, Japan)从叶片中提取总RNA，用TURBO无DNA试剂盒(Ambion Inc.， Austin, USA)去除基因组DNA。使用SuperScript®VILO™cDNA合成试剂盒(Invitrogen, USA)制备反转录的cDNA。用S1000热循环仪(Bio-Rad, USA)进行10 μl反应，得到50 ng总RNA对应的cDNA。放大Atgai制备WT接穗mRNA、引物(AtgaiF2和AtgaiR2)和嵌套引物(AtgaiF3和AtgaiR3)。扩增条件为:94℃初始变性4 min, 94℃30 s, 58℃30 s, 72℃1 min, 25个循环;嵌套式PCR以第一个PCR产物1 μl为模板，循环30次。对于qRT-PCR，使用1 μl cDNA对应50 ng总RNA与iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA)进行20 μl反应。在Chromo 4实时PCR检测器(Bio-Rad, USA)上扩增每个样品的三次重复反应和非模板对照。NbUbi(加入。：AY912494) was used to normalize the expression levels ofAtgai．引物(Atgai QF/Atgai QR和Ubi QF/ Ubi QR)特异性于Atgai而且NbUbi在这个实验中使用的基因(附加文件7)．

蛋白质提取和免疫印迹

在检测到mRNA转运阳性后，取约3.0 g接穗芽组织(n = 5)，然后用预冷的臼和杵在液氮中研磨。按照前面描述的方法提取蛋白质[41］．用DC蛋白测定法(Bio-Rad, USA)测定蛋白浓度。将总蛋白(25 μg)与SDS负载缓冲液混合，在95°C下加热变性5分钟，然后用SDS- page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分离。SDS-PAGE在12.5%聚丙烯酰胺凝胶中使用Bio-Rad Mini-PROTEAN 4设备在200V条件下进行1小时。蛋白质转移到immune - blot™PVDF膜(Bio-Rad，美国)。然后，用牛血清白蛋白(牛血清白蛋白，Sigma，德国)在室温下阻塞每个膜1小时(在阻塞缓冲液中，将牛血清白蛋白溶于1 × TBS- 0.1%吐温至最终浓度0.02 g/mL)。免疫印迹分析用0.1 μg/mL抗t7肽单克隆抗体(Novagen, USA)在4℃下孵育过夜，然后在室温下洗涤4次1 h。然后用2000倍稀释的抗小鼠IgG, Goat Poly HRP (Cosmo Bio Co.， Ltd, Tokyo, Japan)孵育膜1小时，在室温下洗涤3次1小时。使用Amersham ECL Plus Western Blot检测系统(GE Healthcare, UK)检测信号。同时运行一个重复凝胶，然后用考马斯亮蓝R250染色作为加载对照。

微阵列分析

5个WT接穗AtgaimRNA从资本利得税将经RT-PCR检测的样品进行组合，并从样品中制备总RNA。加和不加GA的WT/WT组合有5个接穗_3.处理后的RNA也作为样品进行RNA提取。cRNA的纯化、标记、与44K烟草DNA微阵列(Agilent Technologies)杂交、信号扫描和处理由日本北海道系统科学有限公司(Hokkaido System Science Co.， Ltd.)使用Agilent Technologies微阵列扫描仪(Agilent Technologies, USA)使用低输入快速放大器标记试剂盒完成。共有18588个通过严格质量控制的独特基因被用于检测。

资本利得:

CoYMVp: Atgai-T7

遗传算法:

赤霉酸

盖:

赤霉酸不敏感

女士:

Murashige和Skoog中号

T7:

T7(噬菌体)-表位标签

CoYMVp:

黄斑驳病毒。

本研究由日本科学技术厅通过目标衍生研发的适应性和无缝技术转移计划和广崎大学的机构研究拨款资助。

作者指出

1. 海盐徐

   现住址:中国林业科学研究院林业研究所，北京100091

从属关系

1. 广崎大学农业与生命科学学院，日本广崎036-8561

   徐海燕，岩iro Reika &原田武夫

2. 岩手大学农业科学联合研究生院，日本盛冈020-8550

   徐海燕，原田武夫

3. 中国农业大学水果细胞与分子育种实验室，北京100193

   Tianzhong李

相应的作者

对应到Takeo原田．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

HX和TH设计实验;HX和RI进行了大部分的研究，并与TL和TH一起分析了数据;所有作者都对手稿的写作有所贡献。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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