基于itraq的蛋白质分析提供了驱动葡萄浆果发育和成熟的中枢代谢变化的见解gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

小道消息(gydF4y2Ba葡萄gydF4y2BaL.)是一种重要的经济水果作物。决定葡萄品质的成分，如糖、酸、香精、花青素、单宁等，在葡萄浆果的不同发育阶段积累。因此，将葡萄的蛋白质组学特征与葡萄发生的生化和生理变化相关联，对于促进我们对浆果发育和成熟过程的理解具有至关重要的意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们报告的发展分析gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba简历。马斯卡汉堡浆果的蛋白质水平，从果实成熟到完全成熟。基于itraq的自下而上蛋白质组学方法和串联质谱法分别在绿色和成熟阶段鉴定和定量了411和630个蛋白质。在发育过程中检测到与蛋白质水平变化相关的两个关键点:第一个生长期的结束(7毫米至15毫米)和成熟的开始(15毫米至v100, v100t至110)。基于浆果生长过程中GO术语的富集，利用Blast2GO软件进行功能分析。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

蛋白质组的研究有助于破译水果及其衍生产品的发育和品质性状所涉及的生物过程和代谢途径。这些发现主要体现在葡萄果实中糖和苹果酸盐的代谢和储存，呼吸作用、光合作用和发酵等能量相关途径，以及多酚类物质作为主要次生代谢产物的合成等方面。此外，本研究还确定了碳水化合物和苹果酸代谢的一些关键步骤，即PFP-PFK或SuSy-INV开关等，它们可能会影响成熟水果中最终的糖和酸平衡。综上所述，一些迄今未报道的蛋白质已被检测到在特定组织和发育阶段被解除调控，从而对葡萄浆果发育的代谢过程提出了新的假设。这些结果为破译葡萄果实发育和成熟的控制过程提供了新的线索。gydF4y2Ba

小道消息(gydF4y2Ba葡萄gydF4y2BaL.)是世界上最重要的水果作物，葡萄栽培和酿酒在许多发达国家和新兴国家的经济中发挥着重要作用。2007年，联合国粮食及农业组织(粮农组织)估计，全球葡萄浆果的总产量超过每年6,700万吨，土地占用面积为7,272,583公顷(粮农组织，2007 [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba])。在食品工业中，葡萄浆果作为新鲜和干果被广泛商业化，或主要被加工成葡萄汁或葡萄酒。葡萄浆果的种子、皮肤和葡萄叶子的提取物被用作营养和化妆品工业的商品。gydF4y2Ba

葡萄浆果是一种非更年期水果，呈现双乙状形生长模式[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．坐果后的第一个生长阶段的特点不仅是快速的细胞分裂，增加细胞数量，而且还包括现有细胞的扩张。接下来是一个增长很少或没有增长的滞后阶段。第二个生长期与成熟的开始相一致，称为gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba其特征是浆果发生软化、着色、消化等重要的生化和生理变化。随着葡萄浆果的发育，它们的大小和成分会发生变化。这些转变的范围从小、硬、酸、含糖少、味道或香气令人满意，到变成大、软、甜、味浓、酸少、颜色鲜艳的水果。葡萄果实成熟背后的生化变化最近得到了综述[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．这些特性的发展取决于遗传、环境和葡萄栽培条件，这些条件决定了浆果及其衍生产品的最终质量。在第一生长期，叶绿素是果实中主要的色素，细胞中富含有机酸;最常见的化合物是酒石酸和苹果酸，它们主要积聚在皮肤和肉中。化合物从gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba，主要是葡萄糖和果糖[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，除了酚类和芳香族化合物外[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，而苹果酸盐浓度降低[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．葡萄风味的形成部分是由于酸/糖的平衡[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，这在鲜食葡萄中尤其重要。汉堡马斯喀特是一种经典的黑色鲜食葡萄品种，在欧洲许多地方都有种植，因其令人愉悦的马斯喀特风味而广受欢迎。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

正确的葡萄成熟对于水果的商业使用和葡萄酒的品质都是至关重要的。出于这个原因，葡萄浆果的发育已经通过监测质量性状相关基因的表达进行了经典的靶向研究[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，以及利用cDNA或寡核苷酸微阵列进行全球mRNA表达分析[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]因为基因组资源gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba相关物种已经大规模产生。gydF4y2Ba

近年来，基于蛋白质组学的技术已成功应用于葡萄的胁迫响应分析[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]和浆果发育[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．这些研究在蛋白质组水平上提高了对葡萄浆果变化的理解，但受到单次染色定量二维凝胶电泳(2-DE)固有不准确性的限制[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．应用更可靠的定量蛋白质组学方法，如差异凝胶电泳(DIGE)或基于ms的稳定同位素标记，应该能够更好地覆盖和准确地检测蛋白质变化。DIGE应用于葡萄果实发育的研究。它使基于凝胶的方法报告的蛋白质变化有了更好的覆盖率和准确性[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．吕克尔gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]采用基于定量ms的iTRAQ方法研究了葡萄浆果成熟起始过程，报告的总蛋白鉴定和蛋白变化数量明显多于基于单染色2- de的研究。这些作者注意到蛋白质鉴定的困难，因为没有完整的葡萄基因组序列数据可用。因此，他们通过结合内部生成的[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]和公开的葡萄核苷酸序列。迄今为止，由于葡萄基因组测序计划，这一限制已大大降低[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，他们已经将在基因组中发现的翻译orf发布到公共蛋白质数据库。然而，葡萄蛋白质的序列描述和注释，包括基因组来源的蛋白质，还远远不够完整。通过iTRAQ技术分析葡萄浆果的外果皮，以提供更好的蛋白质组覆盖[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]以及充分利用最近的葡萄基因组测序计划[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

稳定同位素标记然后反相高效液相色谱结合串联质谱(HPLC-MS/MS)分析是一种相对较新的定量技术，由Ross首先描述gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．等压相对和绝对蛋白质定量标签(iTRAQ)目前已成功用于复杂生物样品中蛋白质水平的表征和定量变化[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．iTRAQ已成为定量蛋白质组学中的一项重要技术，因为在蛋白质丰度的广泛动态范围内，可以相当准确地测量蛋白质表达的大倍数变化[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．iTRAQ方法可对4个不同样品(4-plex)中的蛋白质进行多重鉴定和定量，最近已扩大到可测量多达8个不同样品(8-plex)中的蛋白质变化[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

葡萄浆果的组织特异性分析是至关重要的信息，如果它的个人贡献，最终的果实质量寻求。与浆果和葡萄酒的感官特性有关的品质特征与特定的浆果组织有关:果皮成分在决定颜色、香气、涩味和苦味方面起着重要作用，而果肉则有助于糖/酸平衡、脆度、多汁性和酒精潜力。它的种子也会增加葡萄酒的涩味和苦味。gydF4y2Ba

GrimpletgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，利用大规模转录组分析研究了基因在主要组织、种子、肉和皮肤之间的差异表达，并报告了60%的基因在三种主要组织类型中至少一种表现出显著的差异表达。在组织特异性水平上进行了若干蛋白质组学分析[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．然而，总的来说，差距仍然存在，要么是因为只分析了一个组织，要么是因为没有全面覆盖浆果的发育。gydF4y2Ba

本研究探讨了葡萄果皮/中果皮组织中蛋白质表达变化的问题，并涵盖了所有发育阶段。为了更好地了解葡萄果实中蛋白质的组成及其在发育过程中的变化，对葡萄果实从坐果到完全成熟的7个不同阶段进行了分析。目的是提高覆盖范围，并补充之前DIGE实验中所做的蛋白质组学分析[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba本文采用另一种方法，即自上而下定量蛋白质组iTRAQ技术，进行高通量蛋白质组学分析。注释和分析工具的使用[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，以及最近的文献发现，也导致了深入了解蛋白质组学数据的生物学意义，以寻找有用的蛋白质生物标志物，以跟踪与葡萄浆果发育相关的最终质量性状。gydF4y2Ba

采用iTRAQ技术对葡萄果实发育进行了分析。一项iTRAQ试验覆盖了第一个生长期的四个时间点，从坐果到孕穗期gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba(FS-to-15毫米)。另一项iTRAQ试验覆盖了从开始到完全成熟的第二个生长期的三个时间点(v100r -140 g/l)，以及一个预gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba第四个时间点(15毫米)，与第一个实验共用。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba介绍了两个实验的实验设计和工作流程。gydF4y2Ba

蛋白质鉴定和定量gydF4y2Ba

在绿色阶段，鉴定出542种蛋白质，这与葡萄浆果外果皮iTRAQ实验中至少两种多肽鉴定出的蛋白质数量相似[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba](附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．其中，524种蛋白质被量化，在应用p<0.05过滤器后，列表缩短到411种(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．524个定量序列均被赋予描述，508个序列被标注，平均每个序列标注5个，平均标注深度为5.8。gydF4y2Ba

在成熟阶段，鉴定出1117种蛋白质，这几乎是绿色阶段实验中鉴定出的蛋白质数量的两倍(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．其中，1034种蛋白质被量化，在应用p<0.05过滤器后，列表缩短到630种(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在1034个序列中，1010个序列被分配了描述，977个序列被注释，每个序列平均有5个注释，平均注释级别深度为5.5。gydF4y2Ba

作为注释结果的总结，在附加文件中显示了每个实验的生物功能和细胞成分基因本体(GO)术语的饼图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,分别。生成的注释文件作为附加文件提供gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(绿色)和附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(成熟)。gydF4y2Ba

蛋白质组在发育过程中发生变化gydF4y2Ba

为了更好地描述蛋白质组变化最活跃的阶段，在相邻阶段之间计算了未调控蛋白质的相对丰度(每个实验报告离子比率为115/114、116/115和117/116)，并使用这些值对所选蛋白质列表进行排序。对于每个阶段的转换，建立了两个蛋白质亚群:折叠变化大于1.5的蛋白质亚群和折叠变化小于−1.5的蛋白质亚群。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba提供了葡萄浆果形成阶段的每对连续采样时间点之间蛋白质组变化的全局图像。数字gydF4y2Ba2gydF4y2BaA表示通过过滤器的上调和下调蛋白的数量，而图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB表示这组蛋白质的平均和最高折叠变化。在解除调控的蛋白质数量中，可以形成三类发育阶段:变化很少的阶段(从4毫米到7毫米和从110克/升到140克/升);有许多变化的阶段(从7毫米到15毫米，从15毫米到v100);阶段，中间变化数量(fs到4毫米过渡和v100r001到110克/升)。如果考虑变化幅度，配对阶段之间的平均折叠变化差异不大。然而，在某些转变中很少有非常重大的变化，揭示了发育阶段的潜在标记蛋白。本文得到的结果与之前的蛋白质组学实验报道的结果一致，该实验使用DIGE平台分析了相同的时间点[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．本研究中包含的额外时间点，即从v100r001到15mm的过渡，导致了发生变化的蛋白质数量最多和发生最大折叠变化的发育阶段。这些结果表明，在蛋白质水平上最重要的变化发生在绿色期结束和成熟开始的时候。gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，寡核苷酸/微阵列转录组[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]和蛋白质组学[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba的研究也表明。gydF4y2Ba

功能分析gydF4y2Ba

本研究有助于显著增加葡萄浆果整个发育的差异蛋白质组的覆盖率，并有信心地允许基于先前的蛋白质组实验检测假定的标记蛋白，该实验揭示了观察到的蛋白质变化与所分析的生物个体的发育相关[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在本文和Martínez-Esteso中共同鉴定的蛋白质的大多数概况之间具有良好的一致性gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，作为本研究使用非凝胶精确定量蛋白质组学iTRAQ方法的验证。gydF4y2Ba

功能注释分析gydF4y2Ba

费舍尔的富集分析[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]的方法是将上调和下调蛋白亚群注释项的频率与整个定量蛋白列表作为参考列表进行比较。结果，我们得到了一系列GO项，这些项在统计上在子集中被过度代表(p<0.005)。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba为分子函数(F项)的Fischer富集分析结果(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)，生物过程(P项)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)和细胞成分(C术语)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)选择的GO术语，其级别在大多数情况下为4级或更深。额外的文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba提供了每个富集GO项注释的蛋白质列表。gydF4y2Ba

从FS-to-4 mm蛋白上调列表中富集的go术语注释的蛋白主要是组蛋白、小管蛋白和参与细胞骨架组织和生物发生的蛋白的不同异构体。一些核糖体蛋白在FS-to-4 mm表达上调，标注术语为“胞内非膜结合细胞器-GO:0019685”(C项)和“细胞成分组织和生物发生-GO: 0016043”(P项)。相比之下，这些术语从7毫米开始下调，表明这些是发育早期阶段的主导过程，当时果实细胞在分裂和扩张中非常活跃，新的蛋白质正在合成。“水解酶活性，作用于糖基键- go:0016798”(F项)明显上调，与不同的糖基水解酶和一种酸性液泡转化酶有关，该酶从4毫米阶段开始积累，可能参与了果实中卸载的蔗糖的碳水化合物分解代谢，在葡萄体内起下沉器官的作用。参与“类黄酮生物合成过程-GO:0009813”和“芳香族氨基酸合成-GO:0006725”(P项)的蛋白质在这一发育阶段出现下调，包括“苯丙氨酸代谢过程-GO:0006558”GO项(P项)，这是所有苯丙类化合物的前体。这一发现反映了在果实发育早期类黄酮的积累。从4毫米到7毫米的转变的特征是在蛋白质的上下亚群中富集了一些项，这反映了大多数发育过程发生在这一时间点之前或之后。只有“光合作用光收获- go:0009765”表达上调，一些组蛋白异构体表达下调(“核小体- go:0000786”(C项)、“蛋白质-DNA复合物组装- go:0065004”(P项)和“DNA结合- go:0003677”(F项))，在葡萄果实发育早期表现出较大的积累。在接下来的转变(7毫米到15毫米)中，只有下调的蛋白质子集包含富含氧化石墨烯的项。其中最显著的过程是“大分子生物合成过程-GO:0009059”(P项)和“细胞成分组织和生物发生-GO: 0016043”(C项)，它们与蛋白质有关，如延伸因子、小管蛋白、组蛋白和核糖体蛋白，这与细胞此时的发育状态一致。 These results tie in with the fact that fruit entered a lag phase, with little or no division or expansion, and most processes were switched off before triggering theveraisongydF4y2Ba．另一个重要的下调术语是苯丙烷代谢(GO:0009699)，涉及类黄酮和氨基酸前体，其中包括一般苯丙烷途径的酶。7 mm- 15 mm的下调过程主要发生在细胞质中，而15 mm- v100的下调过程主要发生在叶绿体中。一些属于光合作用机制的蛋白质(' Photosystem I-GO:0009522 ' (C项)，' Photosystem II-GO:0009523 ' (C项))和那些参与光合作用的蛋白质，无论是光反应(GO:0019684)还是暗反应(GO:0019685) (phosphoribulokinase, rubisco)，之前都被强烈下调gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba被触发。叶绿体中发生的一些相关过程，如淀粉代谢(4- α -葡糖苷转移酶)、氧化还原状态(硫氧还蛋白、过氧还蛋白)和蛋白质折叠(chaperonin 60)，都与下调亚群中富集的项有关，因此也表明光合依赖过程的减少。同时，大量核糖体蛋白下调(术语“结构分子活性- go:0005198”(F项))。术语' integral to membrane- go:0016021 ' (C术语)包括水通道蛋白和质膜HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- atp酶，表明水相关的特异性转运蛋白在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba．同样，细胞壁相关的过程(木葡聚糖内转移酶，果胶酯酶)似乎被解除调控，这表明这些特征在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba这一阶段的特点是果实软化。这是一个复杂的调控过程，从15 mm到v100的过渡阶段的术语中可以推测，其中一些与细胞壁生物发生相关的特定异构体(术语“细胞质膜结合囊泡- go:0016023”(C术语)，“细胞外区域- go:0005576”(C术语)，内基木葡聚糖转糖基酶，膨胀素，聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，转化酶果胶甲基酯酶抑制剂家族)强烈上调。而其他亚型在这一点上下调了。有趣的是，一些用“铜离子结合- go:0005507”(F项)注释的应激相关蛋白(多酚氧化酶，二酚氧化酶，超氧化物歧化酶)被下调。这些条款在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba为“细胞质膜结合囊泡- go:0016023”、“细胞外区域- go:0005576”，除上述蛋白质外，还涉及成熟相关蛋白(grip22)、质膜蛋白和一些蛋白酶(枯草菌素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。然而，这一时期最相关的术语是“细胞壁代谢过程- go:0010382”(P项)，“几丁质分解代谢过程- go:0006032”(P项)，涉及防御蛋白(PR-4，几丁质酶IV)，碳水化合物相关过程，包括蔗糖代谢相关蛋白(蔗糖合成酶，蔗糖-磷酸合成酶)，在术语“裂解酶活性- go:0016829”(F项)后面，发现了己糖和丙酮酸代谢(烯醇化酶，醛缩酶，丙酮酸脱羧酶)。总而言之，这反映了成熟开始时围绕碳水化合物代谢的强烈活动，大概是在生物合成方向上，将现有的苹果酸盐池转化为糖储存，因为糖酵解应该在成熟开始后被抑制[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在从v100r001到110的过渡过程中，下调过程主导了上调过程。在上调的序列中，保留了包括防御蛋白在内的“几丁质分解代谢过程”和“多糖代谢过程- go:0005976”(P项)，出现了“预折叠复合物- go:0016272”(C项)(稳定新合成蛋白所需)和“半胱氨酸型内肽酶活性- go:0004197”(F项)(半胱氨酸蛋白酶，蛋白酶抑制剂复合体的半胱氨酸蛋白酶组分和组织蛋白酶b样半胱氨酸蛋白酶)。在下调的蛋白质中，最显著的特征是蛋白质合成丰度的降低，如“细胞内非膜结合细胞器”(C项)“细胞成分组织和生物发生”(P项)，其中包括不同核糖体蛋白的重要代表，以及“翻译- go:0006412”(P项)(t-RNA合成酶)。除此之外，与核糖体功能相关的细胞成分和分子功能类别的其他术语在下调子集中富集(“大分子生物合成过程”(P项)，“核糖体的结构成分”-GO:0003735 (C项))。另一个显著的特征是参与光合暗反应的蛋白质被强烈下调，这反映了葡萄浆果在成熟时失去了光合能力。最后，在110- 140过渡阶段，只有“养分库活性- go:0045735”(F项)在上调的蛋白质亚群中得到富集。这一术语包括三种种子储存蛋白质，它们大量积累。gydF4y2Ba

蛋白质谱分析gydF4y2Ba

如附加文件所示gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，详细观察了果实发育过程中果皮/中果皮重要品质性状下功能蛋白群的时间过程行为。本文讨论了“转运蛋白”、“多酚类”、“光合作用、呼吸和发酵”以及“碳水化合物和苹果酸盐代谢”的功能蛋白群。其余的功能蛋白质组，包括“氮和氨基酸”(附加文件)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)“萜类代谢”，“信号和激素”，“压力”，“蛋白质合成”，“蛋白质降解”，“蛋白质加工”，“细胞分裂和生长，生物发生”，“防御蛋白”和“其他感兴趣的蛋白质”，在附加文件中讨论gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

1.转运蛋白gydF4y2Ba

由于液泡体和质膜充能在糖的转运和积累中具有特殊的意义，本文将重点讨论液泡体和质膜充能所涉及的转运现象。液泡是葡萄浆果细胞中非常重要的细胞器，因为液泡占据了葡萄浆果细胞的主要细胞质[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，其主要作用是作为有机酸、糖、次生代谢产物和氨基酸的储存室，并由于其在胞质pH调节中的中心细胞功能。到目前为止，关于液泡膜中转运蛋白的知识出奇地少。因此，葡萄的高酸度和成熟过程中发生的变化仍然意味着重要的问题。V-ATPase和V-PPase是两种广泛分布于植物细胞中的液泡体一级质子泵。在这里，成熟过程中中果皮中两种泵的蛋白质水平被量化。几个v - atp酶亚基在成熟开始的发育过程中被发现上调(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, ' 1 ')。这与先前研究中报道的亚单位C和F的概况一致[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．V-PPase的蛋白水平从成熟开始到100%是恒定的gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba但随后逐渐降低，直至成熟结束(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， ' 2 ')，这与报道的转录本和蛋白质谱一致[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在V-PPase和V-ATPase质子泵活性的基础上，有人提出V-PPase在葡萄发育过程中对液泡体充能的主要作用，尽管它的化学效价比V-ATPase差[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]而v - atp酶的作用在整个成熟阶段都是相关的[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．因此，在此发现了HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba泵的活动与所报告的活动一致[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．虽然在第一个生长期没有检测到V-PPase，但在第一个生长期发现了更多的V-PPasegydF4y2BaveraisongydF4y2Ba比在成熟时;这种减少结合了一个假定的细胞质sPPase的紧急情况(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，“3”)沿成熟指向焦磷酸盐(PPi)作为能源泵质子穿过液泡体在绿色发展期间，但不是在成熟期间。gydF4y2Ba

此外，成熟的诱导已知与韧皮部卸载从共质体途径转移到外质体途径有关[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．后者涉及几个质膜糖转运蛋白的参与gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．糖转运是由质膜H建立的质子梯度驱动的二次转运gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(PM-ATPase)。这里有丰富的pm - atp酶(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2BaA)在成熟初期达到峰值，之后逐渐下调，这与之前的研究结果一致[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．这一剖面与韧皮部和浆果外质体中的糖浓度一致;也就是说，在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba早熟，但随着浆果的成熟而降低[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，并响应PM动力需求。因此，pm - atp酶可以在触发浆果糖分积累方面发挥相关作用。与PM不同的是，液泡体水平的能量需求不断增加，用于糖向液泡的转运和维持细胞质和液泡之间的高糖梯度浓度。事实上，质子糖反转运体的诱导支持液泡糖的积累[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．特异的已糖体反转运载体VvHT6在成熟过程中上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2BaA)按照报告的成绩单水平[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．此外，液泡HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba泵必须在产生质子动力来积累糖的过程中发挥关键作用。如上所述，V-PPase和v - atp酶都可以发挥这一作用，但考虑到它们各自的特征和可溶性PPase的逐步积累，atp驱动泵的重要性随着浆果的成熟而增加。gydF4y2Ba

如上所述，PPi可能在浆果发育过程中发挥关键作用，尽管其代谢过程仍然是一个很大程度上未知的过程。PPi是在几种合成代谢反应中作为副产物释放出来的，在幼年发育时期，如DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物等的合成反应中具有很高的活性，它可以被可溶性焦磷酸酶(sPPase)简单水解来拉动生物合成反应或用于其他过程。根据利用ppi的细胞质酶的丰度谱(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，在发育中的葡萄浆果中，它可能充当能量捐赠者gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]通过V-PPase泵为液膜体供能，但也作为磷酸基供体通过蔗糖合成酶(SuSy)降解蔗糖(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， ' 4 ')和udp -葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-GP)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， ' 5 ')以及通过焦磷酸盐依赖的磷酸果糖激酶(PFP)进行糖酵解(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， ' 6 ')(普拉克斯顿评论道，[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba])。除了这些酶的谱，值得注意的是sPPase的谱与磷酸果糖激酶1 (PFK-1)的谱呈正相关(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， ' 7 ')和v - atp酶，但与利用PPi的酶如PFP和V-PPase呈负相关，因此，sPPase是成熟浆果发育阶段控制细胞质PPi池的候选酶。gydF4y2Ba

2.多酚类物质gydF4y2Ba

从葡萄酒品质的角度来看，葡萄浆果中的主要酚类化合物是非类黄酮羟基肉桂酸(HCyAs)，以及类黄酮花青素(ACs)和原花青素(PACs) [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．酚类化合物的合成共享苯丙类途径，从苯丙氨酸(Phe)到对香豆酸，从中衍生出几个分支，在葡萄中导致木质素，羟基肉桂酸，二苯乙烯类化合物和黄酮类化合物[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba](见图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．所获得的结果清楚地表明，作为该途径的第两个酶，苯丙氨酸解氨酶(PAL，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 1 ')和肉桂酸4-羟化酶(C4H，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 2 ')，相对于15毫米的坐果，至少上调了4倍。同样，莽草酸途径的五种酶(3-脱氧-d -阿拉伯七聚酸7-磷酸合成酶(DHAPS，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 3 ')，脱氢脱氢酶-莽草酸脱氢酶(DD-SDH，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 4 ')， 5-enol-pyruvilshikimate-phosphate synthase (EPSPS，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 5 ')和chorismate合成酶(CHOSy，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 6 ')，导致芳香族氨基酸，在绿色发育过程中与苯丙类酶具有相同的特征(见图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．黄酮类化合物是葡萄果实中重要的酚类化合物，包括ACs、黄酮醇、黄烷-3-醇和缩合单宁酸(黄烷-3-醇和黄烷-3,4-二醇的聚合物)，是葡萄果实中含量最多的可溶性多酚类物质。类黄酮途径的常见酶(查尔酮合成酶(CHS，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 7 ')，查尔酮异构酶(CHI，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 8 ')，黄酮醇-3-羟化酶(F3H，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 9 ')，二氢黄酮醇还原酶(DFR，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 10 ')，花青素合成酶/亮色花青素二氧基酶(ANS/LDOX，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 11 ')和PACs生物合成的分支点(花青素还原酶(ANR，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 12 ')显示出与莽草酸和苯丙类酶相同的丰度模式。虽然没有检测到二苯乙烯或羟基肉桂酸合成分支的酶，但发现了具有上述丰度谱的白藜芦醇/羟基肉桂酸o -葡萄糖基转移酶(RHCA-GT)。它与一种双功能葡萄糖转移酶有94%的同源性gydF4y2Ba葡萄属lambruscagydF4y2Ba简历。Concord (VLRSgt)，可产生二苯乙烯苷和HCyAs的葡萄糖酯gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．相反，肉桂醇脱氢酶(CAD，图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 13 ')，它参与木质素生物合成，显示出完全相反的轮廓。在类黄酮通路的分支点上没有检测到其他酶的作用。所有这些结果共同提供了强有力的证据，在前gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba阶段，碳主要从糖酵解前体流向不仅生产PAC前体，而且羟基肉桂酸和二苯乙烯衍生物，根据较弱的证据。另外，其他途径终产物的产生，如木质素、黄酮、黄酮醇和ac，似乎由于缺乏相应的酶而被阻滞在中果皮中。这些结果与发育中的葡萄莓中ph衍生次级代谢产物的积累类型高度一致[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除ANR外，白花青素还原酶(LAR)也可产生PAC前体;两者都在葡萄PACs积累过程中表达，并以时间和组织特异性的方式进行调控[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．虽然在绿莓果皮中未检测到LAR，但ANR(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba' 12 ')可能在浆果发育早期组织中产生表儿茶素的类黄酮生物合成中发挥相关作用(见图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．黄酮类化合物合成的总体趋势是在成熟期下调。这源于观察到CHI和CHS在gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba在完全成熟之前一直保持下调。在其余的类黄酮途径酶中，只有DFR被检测到，从15毫米到完全成熟，其水平几乎没有变化。在葡萄莓果皮中，ac在成熟开始时大量积累，从下蒸汽酶的下降剖面观察到，果皮中显然没有发生对香豆酸前体的新合成[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．成熟过程中中果皮中存在的DFR将保证ACs前体的供应，以便通过ANS和udp -葡萄糖:类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶(UFGT)在皮肤中合成，如Martínez-Esteso所建议的gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然类黄酮化合物是在细胞质中合成的，但它们积聚在液泡中。人们认为它们的转运机制是通过gluthations -transferase (GST)和ABC转运体介导的[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，尽管与gst无关的传输也会发生(Terrier回顾gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba63gydF4y2Ba])。在皮肤颜色品种发育过程中的高通量研究揭示了与ACs积累相关的GST的表达[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．研究发现，在浆果发育过程中，7个属于tau、phi和lambda类的gst在果肉中被解除了调控。作为附加文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba描述，在浆果皮肤中也只检测到一种与AC积累相关的tau类亚型，而在诱导细胞培养中，没有一种与与二苯乙烯类积累相关的四种tau类亚型亚型一致[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．除了类黄酮结合外，tau和phi gst还具有已知的生长素和细胞分裂素结合活性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]，并在植物生长发育中发挥作用[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

据报道，一种异黄酮还原酶样蛋白(IFRL)的三种同工酶在中果皮成熟过程中被上调，这证实了之前在葡萄果实中果皮和果皮中得到的结果[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．脱序后的IFRLs与Eugenol synthas2序列同源性高gydF4y2Ba山字草brevwerigydF4y2Ba(CbEGS2)(79%)和用苯香豆聚糖苯醚还原酶(PCBER)从gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba(PtPCBER)(82%)。据报道，CbEGS2的酶活性表明，与脱氢二苯甲酰醇(DDC)相比，醋酸松木酯更适合作为底物[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]这表明目前以PCBER酶为特征的序列，以及其他系统发育相关的序列，可能更倾向于使用乙酸松柏酯或其他相关底物，而不是DDC。事实上，在成熟过程中代谢产物丁香酚增加，这是葡萄浆果中存在的挥发物之一，已在葡萄果实中报道。马斯喀特汉堡[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．这种增加与我们对IFRLs的定量蛋白质图谱平行。需要进一步的实验来验证这些假设。gydF4y2Ba

3.光合作用，呼吸作用和发酵gydF4y2Ba

除了光合产物从叶片转移，葡萄浆果能够局部光合同化。通过这些iTRAQ实验，我们检测并定量了大量的蛋白质，从而首次在蛋白质水平上提供了葡萄浆果发育过程中光合机制的完整图景(附加文件)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．几乎每一种参与卡尔文-本森循环的酶都被鉴定和量化了。在整个浆果形成和成熟过程中，它们的丰度呈下降趋势，从7- 15毫米或15毫米到v100的下降幅度更大。此外，光反应蛋白的广泛代表性也被检测和量化(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．在浆果形成过程中，这些蛋白的总体分布趋势与卡尔文-本森蛋白不同，在第一个生长期，轻反应蛋白的丰度适度增加，从7毫米到15毫米保持稳定。在果实成熟过程中，碳固定蛋白的丰度也以同样的方式降低。这些结果与此前在生理、转录和酶活性水平上的研究结果一致，表明葡萄进行光合作用的能力此前有所下降gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba在成熟过程中[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．同样地，它们可以在很大程度上与转录组研究相关[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在第一个生长期，卡尔文-本森周期与光反应蛋白相关的逐步消失表明，能量和还原力的重要部分可以用于碳同化以外的过程，例如芳香氨基酸和类黄酮的生物合成，蛋白质的合成或细胞分裂，这些在浆果形成过程中非常活跃。事实上，葡萄果实在任何发育阶段都不能通过光合作用达到净碳同化率，而光合作用可以平衡CO的损失gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过呼吸作用[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

DIGE实验中指出，促氧增强子(OEE)蛋白从7 mm上调至15 mm [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．33 KDa (OEE33)和16 KDa (OEE3)的亚基比大多数PSI, PSII, LHCI和LHCII蛋白的增加更明显。正如之前的蛋白质组学研究中假设的那样[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]时，OEE组分的增加可能对未使用电子向O的重定向做出反应gydF4y2Ba_2gydF4y2BaH调制gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba形成，这是一个广泛接受的理论，当NADPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba供应不足[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]并且可能发生在浆果形成阶段的末尾，这时许多上述的生物合成过程减慢，甚至停止。有趣的是，两种纤维蛋白异构体(见附加文件)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，“其他感兴趣的蛋白质”)表明，蛋白质的分布与光合作用机制蛋白质的分布平行(见附加文件)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)，从7毫米到15毫米，分别增加1.5倍和2倍，之后减少gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba．纤原蛋白是参与aba介导的PSII光保护的脂质结合蛋白[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．葡萄莓中的纤维蛋白谱支持PSII稳定理论，用于电子和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba当它通过卡尔文循环显著减少碳减排时，形成控制。与这些发现一致，抗氧化的叶绿体酶同时增强(见附加文件)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,“压力”)。gydF4y2Ba

关于呼吸活动，一些参与线粒体呼吸链和氧化磷酸化的蛋白质已被检测到在发育过程中被解除调控(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2BaC).这些蛋白以及ATP合酶和复合体I NADH:UQ还原酶的几个亚基在第一个生长期增加，但从成熟开始减少，这与发育过程中描述的呼吸活动一致[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．从成熟开始，腺苷酸和磷酸盐转运蛋白也显示出相似的蛋白谱(见附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2BaA).来自复合体III和细胞色素c的呼吸链其他蛋白质保持不变或仅略有增加。在成熟过程中，电子输运呈递进式减速。当线粒体呼吸受到损害时，ATP合酶能够逆转并消耗ATP，从而维持线粒体膜电位。这种活性可以耗尽ATP并导致细胞死亡。线粒体蛋白IF可缓解这一过程gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba，一种内源性ATP合酶抑制剂[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．一种atp酶抑制蛋白被发现在7毫米到15毫米和成熟过程中强烈上调。这里的结果还揭示了NAD-ME的蛋白水平(mME，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“24”，见第4组“碳水化合物代谢”)在前达到峰值gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba但在成熟过程中下降。当苹果酸含量丰富时，mME能够向线粒体基质提供高水平的NADH。这种还原环境可以激活非磷酸化脱氢酶(由Sweetman综述)gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba77gydF4y2Ba])，此时磷酸化途径受到限制，这与观察到的氧化爆发相吻合gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba［gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．线粒体解偶联蛋白(MUP)在质子转运前含量较高，而不是作为质子转运复合物- i的替代氧化酶gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba果实成熟后辅酶活性下调，这与浆果细胞的能量状态无关，有助于辅酶的再氧化。gydF4y2Ba

这些数据进一步证明了线粒体在成熟过程中呼吸速率的降低。在这种情况下，TCA循环被呼吸控制逐渐抑制，从而触发苹果酸在细胞质中的积累。因此，部分苹果酸盐将被转移到乙醇发酵中，由丙酮酸脱羧酶积累支持(PDC，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 21 '，见第4组'碳水化合物代谢')和醇脱氢酶2 (ADH2)在成熟过程中，(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“22b”，见第4组“碳水化合物代谢”)。ADH2是负责乙醇在成熟时发酵的异构体[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．在草莓中，如果酸度增加，例如呼吸活动受限，乙醇发酵可以在成熟的果实中进行有氧发酵，苹果酸是假定的碳源[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．上述情况可能导致细胞质NAD(P)H:NAD(P)的改变gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba简化形式的平衡有趣的是，据报道，依赖于nadp的FMN醌还原酶(BQR)从v -100到110 g/l显著增加了4倍，并在成熟过程中保持其水平。BQR酶在葡萄浆果中还没有特征，在植物中也很少有特征[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．BQRs允许醌类的双电子还原为对苯二酚形式，以避免单电子还原半醌的生成，后者已知会引起氧化应激[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]，而酵母中的一种异构体已被证明是氧化应激的NAD(P)-氧化还原传感器[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．因此，BQR蛋白成为研究其在葡萄成熟过程中复杂氧化还原调控中的潜在意义的一个有趣的蛋白质。此外，BQR已被证明是葡萄浆果中果皮中最丰富的蛋白质之一[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

4.碳水化合物和苹果酸盐代谢gydF4y2Ba

近几十年来，人们一直在努力解释葡萄发育过程中控制糖/酸平衡的代谢酶，这是葡萄浆果果肉的主要品质特征。成熟叶片叶肉通过光合作用产生的蔗糖被装载到韧皮部，并在整个发育和成熟阶段卸载到沉浆果中(由Boss和Davies综述，[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba])。从果盘到gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba苹果酸作为进口蔗糖的主要最终产品储存在液泡中;此后，苹果酸被消耗，而大量蔗糖衍生的葡萄糖和果糖储存在液泡中。如张所示gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，在成熟开始时，卸载途径从共质体转向外质体，并伴随着细胞壁转化酶(cwINV)的表达和活性的增加。蛋白质组学数据[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]之前已经为蔗糖合酶(SuSy)和液泡酸转化酶(vINV)之间的转换提供了证据gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba，从而支持了SuSy和INV在葡萄浆果发育和成熟过程中分别卸载糖的功能机制[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]，如tomato [gydF4y2Ba85gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．在目前的实验中，cwINV没有被识别出来，而是一个vINV(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba， ' 23 ')从7- 15毫米强烈上调(14倍)，在成熟过程中蛋白质水平保持不变。两种vINV (VvGIN1和VvGIN2)转录本和蛋白水平在此之前积累gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba在果实成熟过程中减少[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，尽管vINV的活动曾达到峰值gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba在每个浆果的基础上保持不变[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．此外，Steuven杂交葡萄中vINV的自然损耗有助于成熟浆果中蔗糖的增加[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．以上累积证据表明，除了cwINV在成熟过程中的重要作用外[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]， vINV也在成熟过程中驱动糖的输入中起着相关的作用。此外，SuSy(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，“1”)被鉴定为两种异构体。一种从发育到7 mm开始丰富，但在发育到7 mm之前突然减少gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba，与vINV的趋势相反(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba, ' 1 ')。第二个SuSy亚型(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 1b ')似乎在成熟开始时上调，而此后水平保持不变，直到完全成熟。由于SuSy的表达是由糖感机制诱导的[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba]，其减少之前gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba提示库细胞的细胞质中蔗糖浓度较低，可能是由于在卸载途径的转移时发生了胞间连丝阻断[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．第一种亚型，也在之前的研究中发现[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，是一个明确的候选基因，在第一个生长期参与糖的卸载和代谢，而第二个亚型将与vINV一起负责成熟期间的功能。目前的iTRAQ实验揭示了第三种参与蔗糖卸载和下沉强度的酶，蔗糖磷酸合酶(SuPSy)(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 2 ')，在开始时上调了近4倍gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba并在成熟过程中保持恒定的水平。SuSy、SuPSy和INV的共同作用将导致蔗糖的动态合成和降解循环，称为“无效循环”，发生在调节流动强度和方向的植物细胞中。蔗糖无效循环是卸载和储存糖到成熟番茄果实的关键机制[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]就像在葡萄中一样，在成熟开始时停止了共体卸载途径[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

苹果酸是葡萄果实中主要的有机酸，并有一定的积累规律，在葡萄果实的前期积累最多gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba触发成熟前的阶段[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．它的代谢与中果皮葡萄浆果细胞的糖命运和碳水化合物代谢密切平行。参与碳水化合物代谢的酶的丰度曲线与之前DIGE蛋白质组学研究中发现的酶的丰度曲线一致[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．此外，iTRAQ的大规模研究增加了发育过程中驱动糖/酸平衡的代谢途径的覆盖面，更重要的是，还增加了控制糖酵解/糖异生和苹果酸合成/降解的酶的覆盖面。先前的一项研究强调了焦磷酸盐依赖性磷酸果糖激酶(PFP，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 8 ')在绿色发育过程中作为果糖-6磷酸磷酸化的催化剂。如前所述(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，在绿色发育过程中sPPase的低水平和PPi释放反应的发生支持了PPi对PFP的可用性。PFP不同于磷酸果糖激酶-1 (PFK-1，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 7 ')，不受最终产物如PEP或ATP的负调控，因此允许糖酵解流动仅由底物可用性驱动。这里PFP的剖面显示，在下降之前gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba时，该水平不再恢复。PFK-1仅在成熟阶段检测到，在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba它的水平一直保持到成熟结束。因此，在成熟过程中，糖酵解受到PEP积累和中果皮细胞能量状态的严格控制。gydF4y2Ba

下一个关键事件是在绿色发展中使用PEP。一些证据支持两种主要用途:通过草酸酯(OAA)转化为苹果酸，用于液泡储存[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]和呼吸[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．作用于PEP的相应酶的图谱表明，两条通路都是开放的(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

将PEP转化为OAA的两种酶，PEP羧化酶(PEPC，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 20 ')和PEP羧激酶(PEPCK，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“15”)在这里被检测到，但具有完全不同的特征。PEPC的一种亚型在发育早期丰富，但在发育早期下降gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba而另一种亚型在gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba．这种谱图与基因表达的谱图一致[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]和酶活性[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba从而在蛋白质水平上为其在苹果酸合成中的作用提供了证据。相反，PEPCK亚型的丰度在绿色发育的最后阶段开始增加，并一直保持到成熟结束。尽管在pre-中检测到转录本和酶活性gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba浆果(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]，本文中发现的谱图并不支持PEPCK在苹果酸盐合成中的关键作用，如前所述[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]，相反，它们在成熟过程中是重要的，如下所述。随后在绿色阶段通过细胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)将OAA转化为苹果酸也得到了cMDH谱的很好支持(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 19 ')，通过该阶段的活性糖酵解和PEPC分别作为NADH和OAA的连续来源，以及反应本身的热力学。虽然没有报道过cMDH活性的单独测量，但与线粒体MDH (mMDH)相比，本文发现的剖面表明，它可能在很大程度上有助于在早期发育期间报告的高水平的总MDH活性[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．综上所述，目前的结果支持了这样的观点，即在葡萄浆果发育的绿色阶段，苹果酸盐合成中的主要碳流是通过PEPC和cMDH发生的，直到其在前期的最大积累gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在呼吸使用中，PEP通过丙酮酸激酶直接转化为丙酮酸(PK，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 16 ')并被运送到线粒体进行完全氧化。PEP的呼吸使用是由PK谱支持的，在发育早期比发育前更丰富gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba当它最小的时候。丙酮酸脱氢酶(PDH，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 27 ')和该相的MDHm是平坦的。的有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba葡萄浆果的进化特征，在发育早期较高，在成熟开始时降低[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]，与包括PK在内的糖酵解酶相比，与线粒体酶PDH和mMDH的相关性更好，这表明呼吸机制不是速率限制步骤。由于糖酵解和光合作用都在进行，糖酵解的碳流量和光合作用的强度可能是CO的主要决定因素gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进化。gydF4y2Ba

丙酮酸可能被胞质nadp依赖性的苹果酸酶转化为苹果酸(cME，图)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“18”)。然而，尽管cME催化可逆反应，苹果酸脱羧在热力学上是有利的。因此，这种酶被认为参与了成熟过程中苹果酸盐的降解[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．cME水平在绿色发展中期上升，而苹果酸在成熟中期积累并下降。从这个意义上说，cME在成熟过程中苹果酸盐降解中可能没有独特的作用，当大量这种化合物从液泡中释放出来时。一个这样的角色可以推测为生化pH-stat的一部分，它还包括MDH, PEPC和PEPCK [gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在成熟初期，苹果酸净积累转化为净降解[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba这是因为它从液泡中释放出来，并在不同的途径中使用。糖异生作用被认为发生在葡萄成熟阶段[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba］．如上所述，cMDH丰度在胁迫前明显下降gydF4y2Baveraison,gydF4y2Ba而两种PEPCK亚型则表现出中等程度的前期积累gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba阶段。PEPCK转录本的增加[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]，成熟过程中酶的活性[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]并且在这里发现的蛋白质支持其在糖异生中的作用。然而，另一种途径涉及cME和丙酮酸二磷酸二激酶(PPDK，图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba' 17 ')也可能在植物的糖异生中起作用。在浆果发育过程中，一个编码假定PPDK的转录本被发现增加，而ME亚型的表达未被检测到变化[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．结果表明，cME从中期绿色发育到中期成熟，PPDK的积累高峰为gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba，在成熟初期的短暂糖异生阶段与此作用一致。如果我们记住糖卸载途径的开关在前面gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，可以假设，成熟早期的糖异生是为了补偿从胞间连丝被阻断到转运体介导的外质体糖卸载完全运作的糖的短暂衰变。PFK-1和下游糖酵解酶的积累，包括PKgydF4y2BaveraisongydF4y2Ba完全成熟表明，一旦糖的输入再次恢复，该途径可能流向丙酮酸。早期的生化和生理学研究提供了糖异生发生的证据，但它不是苹果酸盐在整个浆果成熟过程中降解的主要途径[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．因此，cMDH、PEPCK、cME和PPDK的特征支持成熟前期的糖异生，而不是成熟后期的糖异生。gydF4y2Ba

成熟过程中的呼吸作用受到TCA循环酶的相应谱的强烈支持，至少在成熟阶段的前半段，呼吸复合体的谱的强烈支持(见上面关于“呼吸作用”的第3组)。大量苹果酸盐从液泡中释放出来gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba从苹果酸或糖酵解中获得的丙酮酸可直接运输到线粒体，以满足TCA循环，产生ATP，并维持水果细胞的呼吸通量。mMDH的上调(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“25”)与后期蛋白质水平和活动的增加有关gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba用于MDH [gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101gydF4y2Ba］．使用丙酮酸作为呼吸底物是由增加的PDH剖面(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba“27”)。这种情况与我们的假设一致，即苹果酸盐降解代谢的变化主要由成熟早期的呼吸作用支持，然后在成熟后期通过细胞质发酵发生。在成熟后期，呼吸速率可能降低并诱导乙醇合成(见上文关于“发酵”的第3组)。gydF4y2Ba

应用iTRAQ技术研究葡萄果实发育过程，分别鉴定出411个和630个青涩和成熟阶段的蛋白质。这些较长的蛋白质列表补充了之前基于凝胶的蛋白质组学研究，具有更好的蛋白质组覆盖范围，并且通过分析发育中的共同时间点，特别是15毫米，更好地连接了两个生长阶段。这项技术可以检测到发育过程中的另一个关键点，15毫米到v100，蛋白质水平的大多数戏剧性变化都发生在这里。获得的结果导致了对葡萄浆果发育的全面研究，支持并补充了之前的蛋白质组学分析[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．这项大规模的蛋白质组学研究作为一种无假设的方法，提供了果实发育过程中进化的主要和重要途径的完整视图，从而更好地理解浆果的发育和成熟生理学。这些发现有助于了解葡萄果实中糖和苹果酸盐的代谢和储存、呼吸、光合作用和发酵等能量相关途径，以及多酚类物质作为主要次生代谢产物的合成。它们都在很大程度上决定了最终的浆果质量，对葡萄栽培行业至关重要。在蛋白质水平上的类似方法现在是可行的，可以研究其他感兴趣的变量(环境因素和文化实践)对这些途径的影响。此外，本研究中确定的关键步骤，如PFP-PFK或SuSy-INV开关等，可以在多种条件下靶向，以精细地描述它们对成熟水果中最终糖/酸平衡的影响。最后，一些蛋白质在特定的发育阶段发生了重大变化;因此，它们可以作为迄今为止尚未被检测到的浆果发育的新型蛋白质生物标志物。因此，这可能有助于开辟新的品系来探索葡萄果实发育和成熟的控制参数。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

葡萄莓(gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Bal .简历。汉堡麝香葡萄)于2006年从Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario (Torrepacheco，穆尔西亚，西班牙)的实验葡萄园中采集。从四个选定的葡萄藤中取样，并在两个生长季节从坐果到完全成熟的七个不同发育阶段收集浆果。根据不同的浆果生长模式参数，对葡萄个体进行发育分期。根据果实赤道直径分别为4、7、15 mm，将青果分为FS期。第二浆果生长阶段的开始，标记为100%gydF4y2BaveraisongydF4y2Ba(V-100阶段)，视觉评估为100%的浆果表面变成粉红色。根据在不同NaCl溶液中漂浮的估计密度，对成熟浆果进行分类:110阶段是在110 g/l中下沉，但在120 g/l中漂浮，而140阶段是在140 g/l中下沉的浆果。由于一束浆果发育不均匀，因此在每个采样日从同一植物的不同束中收获浆果，然后根据它们的发育阶段进行分类，视为一个样本。在果实发育和成熟期间选取四株葡萄进行取样，每个阶段进行四次生物重复。采样的浆果在分离后立即在液氮中冷冻，除了先前根据密度分类的110级和140级浆果。所有样品保存在−80°C直到使用。另一组平行的浆果样品在分离后冷藏并运输到实验室，以测定颜色指数、果汁pH值、总酸度和°Brix，显示出葡萄浆果的典型特征。方法和结果在其他地方有报道[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

蛋白质的提取gydF4y2Ba

果实的三种主要组织，即种子或内果皮、果肉或中果皮和表皮或外果皮，在不同发育阶段均有分化，只有在一定发育阶段后才有分离的可能。在提取总蛋白之前，从阶段4毫米开始从浆果中除去种子，而从阶段V-100开始剥去浆果的外果皮组织。由此，分别从果皮和中果皮中提取青莓蛋白和成熟莓蛋白。从同一棵葡萄树上采摘的一堆浆果，用液氮在臼中研磨成细粉，然后用4克研磨过的组织制备蛋白质提取物。蛋白质提取物如Martínez-Esteso所述gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

蛋白用Bradford染色结合法定量[gydF4y2Ba102gydF4y2Ba]，以牛血清白蛋白作为标准，并从每个阶段重复中汇集等量的蛋白质用于等压标记。gydF4y2Ba

等压肽标记gydF4y2Ba

对于每个发育阶段，用10体积的丙酮在−20°C下沉淀100 μg蛋白质过夜。在15300 ×离心10 min后gydF4y2BaggydF4y2Ba，蛋白球溶解于含有0.2% (w/v) SDS的iTRAQ溶解缓冲液(Applied Biosystems) 60 μl中。蛋白质在3 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)中还原，并在60°C下孵育1小时。将样品冷却至室温下，用2 μl 200 mM甲基甲硫代硫酸盐(MMTS)封闭半胱氨酸残基，室温下孵育10 min，加入250 μl iTRAQ溶出缓冲液稀释样品。然后，在每个小瓶中加入10 μg蛋白质组学级修饰的胰蛋白酶(Sigma)，溶解在相同的缓冲液中，在37°C下消化过夜。然后，留下一个小颗粒，每个小瓶中加入5 μg溶解在iTRAQ溶出缓冲液中的蛋白质组学级修饰胰蛋白酶(Sigma)，在37℃下消化3 h。将所得的胰蛋白酶肽真空浓缩，重新悬浮在30 μl iTRAQ溶出缓冲液中。标记反应按照制造商的建议进行，在每个蛋白质样品瓶中加入一种iTRAQ试剂114.11123、115.10826、116.11162或117.11497，之前溶解在70 μl纯乙醇中。加入1ml含10mm K的缓冲液，在RT孵育1小时后停止标记反应gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba和25%乙腈(ACN)， pH值2.7，每瓶。在一项iTRAQ实验中，用试剂标记FS 4毫米、7毫米和15毫米阶段，并在另一项实验中标记15毫米、V-100、110 g/l和140 g/l阶段。然后，将4个样品混合，用浓磷酸调整到pH 3.0。由于所有这些实验都是在不同的实验室进行的，因此下游的工作流程略有不同。gydF4y2Ba

强阳离子交换分离肽gydF4y2Ba

用强阳离子交换色谱(SCX)对标记样品池进行分离。样品分离使用Äkta Purifier (GE Healthcare)中压液相色谱系统，配备Mono S PC, 1.6 mm × 50 mm色谱柱(GE Healthcare)，流速为0.1 ml/min(绿色阶段)，或BioCAD工作站(应用生物系统)，使用100 × 4.6 mm聚磺乙基天斯巴酰胺色谱柱(PolyLC Inc, Columbia, MD, USA)，流速为0.5 ml/min(成熟阶段)。首先，将样品装入色谱柱，在缓冲液A (10 mM K)中稀释5倍gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba/25% ACN pH 2.7)。之后，用缓冲液A洗涤色谱柱20分钟，用两步梯度洗脱多肽:首先是5-35%的缓冲液B (0.5 M KCl在10 mM K中)的线性梯度gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba/25% ACN pH 2.7) 30分钟，然后35-100%缓冲B线性梯度60分钟。在280 nm监测肽的洗脱，并在整个色谱运行过程中分为0.1 ml(绿色阶段)或214 nm和0.5 ml(成熟阶段)。对于绿色阶段，通过池化3或4个连续分数的集合，将收集的77个分数进一步减少到21个。所得的21个馏分真空浓缩，在100 μl 5% ACN/0.5%三氟乙酸(TFA)中重悬，并根据制造商的建议使用PepClean™C-18旋转柱(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)脱盐。用40 μl 70% ACN/0.1%甲酸(FA)洗脱的多肽真空干燥，18 μl 0.1% FA重悬。在成熟阶段，收集了61个馏分，但其中只有18个馏分包含通过214 nm光密度监测测量的洗脱标记肽，用于2小时的LC-MS/MS程序分析。分馏样品在speed-vac (thermov - savant, Holbrook, NY, USA)中降至150 μl，并转移到自动进样管(LC填料，阿姆斯特丹，荷兰)。gydF4y2Ba

反相色谱法gydF4y2Ba

由Famos自动采样器、Switchos开关泵和UltiMate微型泵(LC填料公司，阿姆斯特丹，荷兰)组成的集成系统用于对所选SCX组分进行反相色谱。绿色阶段，将5 μl tryptic肽预富集于C18 PepMap保护柱(300 μm i.d. × 5 mm 5 μl, 100 Å， LC Packings, Amsterdam, Netherlands)，浓度为40 μl/min, 0.1% FA中3 min，然后在C18 PepMap (75 μm i.d. × 15 cm, 3 μm, 100 Å， LC Packings, Amsterdam, Netherlands)中以15 - 50%溶剂B线性梯度洗脱120 min;溶剂A在水中为0.1% FA，溶剂B在95% ACN中为0.1% FA。成熟期，每个SCX馏分的1 / 5在C18 PepMap保护柱(300 μm i.d × 5 mm 5 μm, 100 Å， LC填料，阿姆斯特丹，荷兰)中以50 μl/min脱盐15分钟。HPLC缓冲液包括缓冲液A - 2% ACN, 0.1% FA和缓冲液B - 98% ACN和0.1% FA。肽在手工填充的75 μm × 15 cm C18色谱柱(Magic C18Aq, 5 μm, 100 Å， Michrom Bioresources Inc.， Auburn CA, USA)中分离，37-48组分的缓冲液B以250 nl/min流动，梯度为5%-75%，缓冲液B梯度为5%-75%，梯度为35 min。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

洗脱液直接喷入QSTAR XL系统(绿色阶段)或QSTAR Pulsar I(成熟阶段)质谱仪，配备纳米喷雾源(Applied Biosystems/MDS SCIEX Concord, ON Canada)。QSTAR操作软件Analyst QS v1.1采用信息依赖采集(IDA)方法优化了MS/MS谱采集，周期为6秒，在整个梯度持续时间内重复。MS-TOF测量扫描在400-1200范围内持续1秒gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba目标离子电荷状态2-4+，超过阈值20计数。在接下来的180秒内，100 ppm以内的前一个目标离子被排除。每个产品离子扫描持续2.5秒，范围为100-1500gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba．增强所有被打开的产品离子扫描。gydF4y2Ba

数据库检索和蛋白质定量gydF4y2Ba

原始数据文件使用Protein Pilot v1.0与Paragon Search和ProGroup Algorithms™(Applied Biosystems/MDS Sciex Foster City, CA USA)进行胰蛋白酶肽鉴定和定量。多肽和相应的相对丰度在ProteinPilot中分别使用>1.0(>90%)和>1.3(>95%)的置信临界值(称为“Prot评分”)获得，用于绿色阶段和成熟阶段的实验。在NCBInr蛋白质数据库中对每个样本进行数据库搜索，不受分类限制，胰蛋白酶、MMTS作为固定修饰，iTRAQ标签作为变量修饰。只有至少含有2种不同多肽且p<0.05，且定量比值为>1.5且p<0.05的蛋白质才被考虑。前者p值与鉴定中的蛋白质得分截断值有关，后者p值与每个定量蛋白质的iTRAQ比值有关，由ProteinPilot软件中的ProGroup算法计算，用于衡量其统计显著性。不考虑角蛋白、胰蛋白酶和植物以外物种的序列。gydF4y2Ba

生物信息功能分析gydF4y2Ba

由于来自葡萄基因组项目的翻译orf [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]已经部署在公共数据库中，迄今为止没有描述和注释，搜索往往匹配一个未描述的氨基酸序列。Blast2GO v2.4.0应用程序gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]已经被用于自动分配蛋白质描述和从公共数据库的同源序列中提取注释，然后如果可能的话，这些序列已经被手动审查和充实。从NCBI网站批量检索鉴定和/或定量蛋白集的FASTA格式序列文件。Blast2GO被输入FASTA文件，并运行到:首先通过对NCBInr执行BLASTp搜索(e-value cutoff为1 × 10)来合并序列描述gydF4y2Ba^{-50年gydF4y2Ba}， BLAST命中检索数为20,HSP(最高得分对)长度截断值为33);第二，绘制GO, EC和Interpro术语;然后对序列进行注释(E-Value Hit-Filter为1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba， Hsp-Hit Coverage Cutoff为0,Annotation Cutoff为55,GO Weight为5)。由Blast2GO执行的自动注释被手动修改，以保证准确分配。费雪精确检验[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，以找到显著富集的GO项(FDR <5%)。简单地说，在包含实验中所有定量序列的参考列表和通过任意定量比截断值1.5倍(下调蛋白的比值<0.6，上调蛋白的比值为>1.5)选择的序列子集列表之间比较注释术语的频率。在每个发展阶段选择子集进行分析:FS-to-4 mm, 4 mm- 7 mm, 7 mm- 15 mm, 15 mm- v100, v100r00to -110和110- 140。gydF4y2Ba

ACs:gydF4y2Ba

花青素gydF4y2Ba

消化:gydF4y2Ba

差凝胶电泳gydF4y2Ba

FS:gydF4y2Ba

果设置gydF4y2Ba

V100:gydF4y2Ba

全颜色更改在véraisongydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

销售税:gydF4y2Ba

Gluthatione-S-transferasegydF4y2Ba

热休克:gydF4y2Ba

热休克蛋白gydF4y2Ba

iTRAQ:gydF4y2Ba

等压标记用于相对和绝对蛋白质定量gydF4y2Ba

HPLC-MS /女士:gydF4y2Ba

液相色谱结合串联质谱gydF4y2Ba

cMDH:gydF4y2Ba

苹果酸脱氢酶细胞质gydF4y2Ba

mMDH:gydF4y2Ba

苹果酸脱氢酶线粒体gydF4y2Ba

PFK-1:gydF4y2Ba

磷酸果糖激酶1gydF4y2Ba

政治行动委员会:gydF4y2Ba

原花青素gydF4y2Ba

亲:gydF4y2Ba

Pyrophosphate-dependent磷酸果糖激酶gydF4y2Ba

sHSP:gydF4y2Ba

小上海gydF4y2Ba

SCX:gydF4y2Ba

强阳离子交换色谱法gydF4y2Ba

苏西:gydF4y2Ba

蔗糖合酶gydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

二:gydF4y2Ba

双向凝胶电泳gydF4y2Ba

UDP-GP:gydF4y2Ba

UDP-glucose焦磷酸化酶gydF4y2Ba

vINV:gydF4y2Ba

液泡酸转化酶。gydF4y2Ba

MJME感谢阿利坎特大学的资助。作者非常感谢Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario Alimentario研究所(IMIDA)提供葡萄浆果材料的合作。MJME承认在维多利亚大学基因组BC蛋白质组学中心停留，Christoph Borchers博士作为设施主任，以执行成熟阶段分析的iTRAQ实验。MJME感谢莫妮卡·埃利奥特和德里克·史密斯在逗留期间提供的实验帮助。绿色阶段iTRAQ实验的质谱分析由Manuel Sánchez del Pino博士指导的Príncipe Felipe研究中心的蛋白质组学单元进行。阿利坎特大学蛋白质组学研究所是proteorer网络的成员之一。这项研究得到了Genoma España, GrapeGen项目的支持，作为Genoma España-Genome加拿大联合合作研究协议的一部分。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Grupo de Proteómica y Genómica植物功能，部门Agroquímica y Bioquímica，阿利坎特大学科学学院，阿利坎特Apartado 99, E-03080，西班牙gydF4y2Ba

   María José Martínez-Esteso, María特里萨Vilella-Antón &罗克Bru-MartínezgydF4y2Ba

2. 西班牙穆尔西亚大学，埃斯皮纳多校区，穆尔西亚，E-30100，西班牙，Peroxidasas Vegetales，部门Fisiología Vegetal, faculty tad de BiologíagydF4y2Ba

   María Ángeles PedreñogydF4y2Ba

3. 实验室Proteómica，中心de Investigación Príncipe，费利佩，自动售货机，16，巴伦西亚，46012，西班牙gydF4y2Ba

   María卢兹·瓦莱罗gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaMaría José Martínez-EstesogydF4y2Ba或gydF4y2Ba罗克Bru-MartinezgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

MJME对实验设计、葡萄采样、蛋白质提取、标记和SCX分馏、生物信息学分析以及生物学和数据解释做出了贡献。MTV有助于葡萄取样、蛋白质提取和标记。MLV在绿期iTRAQ实验中进行质谱分析，进行蛋白质鉴定和定量。MAP对实验设计和数据解释做出了贡献。RBM确定了工作目标和技术方法，并为实验设计、生物信息学分析和数据解释做出了贡献。本文是María José Martínez-Esteso博士论文的一部分。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

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转载及权限gydF4y2Ba