向日葵和黄瓜子叶中脂氧化酶衍生的氧脂素的乙氧化酶体降解

背景

油籽萌发的特点是贮存脂质的降解。它可以通过三酰基甘油脂肪酶的直接作用进行，或者在某些植物物种中通过特定的脂质体13-脂氧合酶进行。对于脂氧合酶的参与，先前的结果表明，由脂氧合酶引入脂肪酸主链的羟基或氧基形成了连续β氧化的屏障。

结果

然而，这项研究表明，通过分离的黄瓜和向日葵glyoxysomes可以完全降解含氧脂肪酸。有趣的是，降解伴随着饱和短链酰基辅酶a的形成，其链长在4到12个碳原子之间，缺乏氧合脂肪酸底物的羟基或氧二烯系统。这些辅酶a酯的存在表明，在链长为12个碳原子的二烯体系中，包括C7羟基的转化，参与了特定的还原。

结论

据我们所知，这种代谢途径尚未被描述为多不饱和脂肪酸的降解。它可能代表了一种新的原理来降解由脂肪加氧酶形成的氧化脂肪酸衍生物或由活性氧引起的化学氧化。

在油籽萌发过程中，储存脂质的代谢为幼苗的生长提供能量和碳供应。1]。这些储存脂质沉积在称为脂质体的特殊细胞器中[2]。在许多油籽-如向日葵和黄瓜-亚油酸(LA, 9)Z, 12Z)-十八烷-9,12-二烯酸)是储存三酰基甘油(TAGs)时酯化的主要脂肪酸[3.，4]。在种子萌发过程中，游离脂肪酸如LA在脂体脂肪酶的作用下从标签中释放出来，然后通过乙醛小体中的β-氧化进行运输和降解[5，6]。的独联体LA中的-双键可能构成了常规β-氧化级联反应和辅助酶参与的屏障(Δ)^3.,Δ²-烯酰辅酶a异构酶和nadph依赖性2,4-二烯酰辅酶a还原酶)是完全分解这种脂肪酸所必需的[7]。这些辅助活性首先从黄瓜中分离出来，然后从拟南芥中鉴定出来[8- - - - - -11]。此外，研究表明，从向日葵子叶中纯化的glyoxysomes可以以不依赖nadph的方式将LA完全降解为乙酰辅酶a，并且该体系可用于遵循所有顺序反应步骤[12]。

尽管有这一途径，另一种依赖于脂氧合酶(LOX)的储存脂质的动员已被提出[13]。相应的反应级联是由脂质体特异性的13-LOX氧化酯化LA引发的[14]这是由脂质体特异性patatin型脂肪酶促进的[15]。这一过程伴随着TAG馏分中脂质氧化产物的形成。在4天的黄瓜幼苗中，高达20%的LA部分酯化成标签，并被发现被氧化[14]。随后,(9Z，11E, 13年代)-13-氢过氧-9,11-十八二烯酸(13-HPOD)从TAG片段中释放出来，被还原，然后可能被转运到乙氧基小体中[13]。相应的(9)Z，11E, 13年代)-13-羟基-9,11-十八二烯酸(13-HOD)作为β-氧化的底物。虽然在向日葵、亚麻籽和黄瓜的萌发过程中，13-LOX介导的13-HOD的动员和释放已经被很好地描述[16]，关于这种氧化脂素降解的知识仍然不完整。在之前的研究中已经提出，无论是13-HOD的共轭羟基二烯体系还是对应的亲电氧二烯体系(9Z，11E)-13-酮-9,11-十八二烯酸(13-KOD)不能被分离的向日葵乙氧体的β-氧化机制代谢[17]。虽然使用分离的glyoxysomes发现了外部添加的13-HOD对13-HOD- coa的有效激活，但本研究的数据表明这种氧脂素的转换不完全。这些底物只发生了两轮β氧化，挑战了储存脂质脂氧合是储存脂质动员的另一途径的假设。

在本研究中报道的方案分离的乙氧化酶体和β-氧化中间体的分离在体外优化了检测方法。并用质谱法对β-氧化中间体进行了表征。尽管不同链长和氧化态的中间产物酯化成CoA，但在降解过程中释放出不同的游离脂肪酸。目前的数据表明，黄瓜和向日葵glyoxysomes可以完全降解13-HOD，但该体系可能对活性亲电试剂如13-KOD及其降解产物敏感。

LA-和13- hod依赖的乙醛酶体部分形成NADH

nadh形成的光学检测提供了一种直接的方法来确定脂肪酸降解的速率和完整性，在分离的乙氧基体的情况下，其他干扰性的nadh形成反应不存在。因此，我们使用这种方法来确定glyoxysomal fractions for LA或13-HOD的偏好。这两种底物都产生NADH，表明它们被各自的酰基辅酶a酯激活，随后通过β-氧化降解。黄化黄瓜和向日葵幼苗的Glyoxysomes对13-HOD的活性相当。一个典型的实验如图所示1、表1给出所有实验的平均值。总之，这些数据表明，特别是在高底物浓度下，所施用底物的失活效应可能对nadh的形成产生负面影响。因此，每个图都显示了两次拟合(图1)1B和D):第一次拟合包括5 μM以下的所有数据点，结果斜率更陡，因此每个底物的nadh生成量更高。这个值最有可能最好地描述了乙氧化酶体部分的催化能力。为了比较，也给出了整个检测底物浓度的拟合。尤其当底物浓度为10 μM和20 μM时，其值可能会受到失活效应的影响，因此这些数据点不太符合线性方程。尽管如此，该图提供了每个底物形成nadh的最小值，这在所有情况下仍然支持13-HOD超过两轮β-氧化的发现。根据glyoxysomal preparation的质量，最大的nadh形成速率在1000和4000 pmol * s之间¹*毫克¹和S_0.5在4 ~ 10 μM之间。在这两种体系中，计算出每个13-HOD分子形成2.5 - 3.5个NADH分子，表明每个底物分子平均发生2 - 4轮β氧化。这一发现表明，一个优化的在体外系统可以进行多达4轮的β-氧化，而不是以前报道的只有两轮的形成[17]。尽管如此，在完全降级的情况下，预计会有8轮比赛。

黄瓜和向日葵glyoxysomes对13-HOD的代谢没有显著差异，但两种体系对LA的代谢行为不同。使用黄瓜的乙氧基体，nadh的形成速度相当，但S_0.5LA相对于13-HOD的价值。此外，观察到每个LA分子增加4.7 - 5.6个NADH分子。这表明黄瓜glyoxysome对非氧化脂肪酸LA有更高的偏好。然而，应该指出的是，即使在这些优化的条件下，也只能观察到6轮β-氧化，并以此定量和完全降解LA在体外无法连接到系统。

相反，黄化向日葵细胞器对LA形成NADH的能力较弱。两者的最大反应速率均为400 ~ 900 pmol * s¹*毫克¹)和NADH的产率(1.7 ~ 2.6 μM NADH / 1 μM LA)显著低于由相同的glyoxysomes转化13-HOD或由黄瓜glyoxysomes转化LA。

LA的活化

观察到LA是黄瓜而不是向日葵中乙氧基体的良好底物，提出了这个底物在两种系统中是否以类似的方式被激活的问题。理论上，在NAD时，LA只能被活化为LA- coa，并转化为3-羟基中间体⁺被排除在反应之外(如图13-HOD所示2)。事实上，当使用黄瓜的glyoxysomes时，可以在15分钟后观察到形成一种独特的化合物，其在260 nm处的吸收最大(图2)3.A，用黑色圆圈标出的信号)。根据光谱性质和保留时间，初步确定该中间体为3-羟基- la - coa。此外，还检测到少量的13-HOD和13-HOD- coa(图2)3.A，用开圈标出的信号)。

然而，当仅使用少量假定的3-羟基- la - coa的向日葵中的glyoxysomes在15分钟后形成(图2)3.B，用黑色圆圈标出的信号)。相反，LA迅速转化为13-HOD。相当数量的氧化形式已经在这个实验的死期(化合物混合和酶热失活之间的时间)形成。13-HOD而不是LA被激活为辅酶a -酯，并进一步转化为羟基化的13-HOD-辅酶a衍生物(图2)3.B，用开圈标记的信号)。因此，LA似乎不会被向日葵的glyoxysomes直接降解，但lox介导的氧化可能在其降解之前发生。

13-HOD降解过程中β-氧化中间体的时间分辨谱

先前已经证明了黄化向日葵子叶的glyoxysome能够将13-HOD激活为相应的酰基辅酶a [17]。尽管β-氧化中间体已经分离，但许多中间体的鉴定仍然是开放的。因此，我们采用了报道的基于高效液相色谱的方案来分离β-氧化中间体，并对其进行了调整，以允许基于质谱的不同物种鉴定。此外，我们试图将向日葵与黄瓜的情况进行比较，其中主要描述了储存标签形成13-HOD的情况[14，15]。将20 μM的13-HOD加入到β-氧化实验中，其中含有纯化的glyoxysomes和所有活化和降解脂肪酸的化合物。在热失活和纯化后，中间体通过反相(RP)-HPLC分离，以便对13-HOD降解进行时间分辨分析(图2)4和5)。此外，从黄瓜glyoxysomes孵育物中收集主要化合物，并通过ESI-MS/MS进行鉴定(附加文件)1:图S3 - S9)。

黄瓜glyoxysomes对13-HOD的转化

在含有黄瓜细胞器的反应混合物中，反应60分钟后13-HOD完全消失(图2)4B，信号保持时间为~ 128 min)。此外，经过一到两次β-氧化循环后，13-HOD-CoA和不饱和中间体的形成(图2)4B，在保留时间为~ 100,96和92 min时观察到信号，以及饱和的短链中间体(图1)4A，信号在保留时间为~ 95、90、82和72分钟时)。因此，黄化黄瓜的glyoxysomes具有完全降解13-HOD的一般能力。此外，还检测到少量具有羟基二烯体系(234 nm)和辅酶a (260 nm)光谱特征的中间体。虽然该中间体的低含量妨碍了质谱鉴定，但保留时间(~ 89 min)和光谱性质表明，该化合物是经过三轮β-氧化的中间体- 7-羟基十二烯基辅酶a。

向日葵glyoxysomes对13-HOD的转化

使用向日葵中的glyoxysomes，总体降解情况与Gerhardt及其同事所描述的相同[17)(图5）：

1. 我。

   13-HOD(保留时间~ 130 min，在234 nm处最大吸收)在60 min后完全消耗，活化为13-HOD- coa(保留时间~ 100 min，在234和260 nm处最大吸收);

2. 2

   观察到两种降解中间体的形成，吸收最大值分别为260和234 nm(保留时间 ~ 96和92 min);

3. 3

   在260 nm和280 nm处观察到吸收最大值的中间产物的出现，表明羟基-二烯转化为酮-二烯体系。

中间产物从hplc梯度中重新提取，并进行ESI-MS/MS分析。如前所述[17]，具有234 nm吸收的化合物经过1和2个β-氧化循环后构成化合物(显示从黄瓜中获得的代谢物，附加文件)1:图S6和S8)。此外，相应的酮类中间体(13-KOD-CoA和经过1个和2个β-氧化循环的相应中间体)的身份得到了确认。这些物质相对于它们各自的羟基衍生物有大约1分钟的洗脱延迟。除了之前的报道外，还检测到缺乏共轭二烯体系的典型吸收特性的短链中间体(其特征是在260 nm处吸收CoA)。这些中间体与链长在4到12个碳原子之间的饱和酰基辅酶a共洗脱，并且可以通过ESI-MS/MS与黄瓜glyoxysomes进行相应的孵育(附加文件)1:图S4, S7, S9)。这一发现表明13-HOD中的羟基-二烯体系不构成降解的一般屏障[18]。

当黄瓜glyoxysomes与向日葵细胞器进行比较时，观察到两个主要差异(图2)4vs。5):在黄瓜中只观察到含有酮-二烯体系的中间体的痕迹。相反，许多含有羟基-二烯系统的物质，其链长为14或16个碳原子，被检测到明显失去了CoA，因此很可能从β-氧化循环中释放出来(图2)4B，所有信号都有一个开圈，而不是一个闭圈，在~ 100到122分钟之间。

13-KOD形成与13-HOD降解的相关性

观察到形成不同数量的酮二烯中间体，特别是由向日葵细胞器(图2)5(信号标记为一个开放的正方形)提出了一个问题，即羟基二烯系统的氧化在多大程度上是13-HOD降解所必需的。假设13-KOD在13-HOD降解过程中是一个通路上的中间体，那么当13-KOD被用作底物时，可以期望更好或至少相当的NADH形成。实际上，在含有向日葵或黄瓜glyoxysomes的β-氧化实验中，当13-KOD而不是13-HOD孵育时，NADH的形成速率和最终量都降低了1)。因此，13-KOD可能不是13-HOD转化的必要中间体。相反，它可能对β氧化机制是有毒的，因为它含有亲电系统，可以与相关的酶形成迈克尔加合物，从而使它们失活。

储油脂的动员对油料幼苗的发育至关重要，尽管它在自养代谢建立之前提供能量和碳供应[1]。因此，patatin型脂肪酶对脂质体磷脂单层的降解可能允许不同的酶进入tag -部分[15]。存储脂质动员的经典途径可能由TAG脂酶依赖的游离脂肪酸(如LA)从脂质体中释放出来，随后转移到glyoxysome中，在glyoxysome中分别发生酰基辅酶a和β氧化的活化[1，6]。虽然洛杉矶有两个独联体-双键和典型的β-氧化反应级联只处理反式-双键，两个额外的酶(Δ^3.,Δ²-烯酰辅酶a异构酶和2,4-二烯酰辅酶a还原酶)是其降解所必需的[7]。

除了经典的TAG脂酶启动途径外，似乎还存在另一种lox启动途径[13]。脂质体特异性的13-LOX氧化tag -部分中的酯化LA，随后13-HPOD从脂质体中释放，还原为13-HOD并运输到glyoxysome中[14]。而13- lox介导的13-HOD在向日葵、亚麻籽和黄瓜萌发过程中的动员和释放已被描述[16]，关于这种氧脂素降解的知识仍然不完整。在最近的在体外研究表明，从向日葵幼苗中分离的glyoxysome可以有效地将13-HOD活化为13-HOD- coa。然而，小链酰基辅酶a的缺失和两种中间体的明显稳定积累表明，在两轮β-氧化后降解停止，并促使作者假设，羟基二烯体系可能构成β-氧化机制的一般屏障[17]。

在本研究中，优化了β-氧化中间体的分离方案，并开发了鉴定这些化合物的方法。Gerhardt和他的同事在[17]，观察到两种极性明显高于13-HOD-CoA的突出中间体的积累(图2)4和5，保留时间~ 96和92分钟)。质谱分析证实了之前的假设，即这些中间体是13-HOD-CoA经过一个和两个β-氧化循环后的代谢物。有趣的是，在我们的实验中，这些物种并没有构成13-HOD降解的最终产物。它们随着反应时间的延长而消失，并检测到三种主要的其他中间体。引人注目的是，在黄瓜和向日葵幼苗的glyoxysomes中，发现了缺乏羟基二烯系统的短链酰基辅酶a(链长在4到12之间的饱和酰基辅酶a)的形成。最重要的是，它们的形成只有在外源13-HOD加入后才能检测到。这一发现清楚地表明，这些植物的glyoxysomes具有完全降解13-HOD-CoA的一般能力。

此外，这些在13-HOD降解过程中鉴定出的中间体现在可以提出这种氧化脂质的改进降解途径(图2)2，道路在中间)。三轮经典的β-氧化反应生成7-羟基十二烯基辅酶a作为最后的中间体，它仍然含有初始的羟基二烯体系。除了完整的第一环(11-羟基-十六烷基辅酶a)后的中间体外，第二环(9-羟基-十四烷基辅酶a)和第三环(7-羟基-十二烷基辅酶a)也检测到相应的二羟基中间体的质量。它们很可能对应于这种氧脂的3-羟基β-氧化中间体(即图中上述第三种化合物)2图中保留时间为~ 96 min的化合物3.)。对于进一步的转换，理论上有三种可能的途径。第一个取决于已知的活性，它们在β-氧化的第4到6轮中依次降解羟基-二烯系统(图2)2如以前所建议的那样[13，18，19]。7-羟基十二烷基辅酶a的共轭羟基二烯体系由独联体——Δ^3.-烯酰辅酶a异构酶和Δ^3.,Δ²-烯酰辅酶a异构酶转化为经典的β-氧化中间体。这个途径现在可以被排除，因为它不能解释在本实验中新发现的羟基十二烷基辅酶a中间体和完全还原的中间体十二烷基辅酶a、癸烷基辅酶a和辛烷酰辅酶a的存在(图2)4和5)。

如果共轭双键在c12阶段完全还原，而没有在C7处的羟基转化，理论上可以解释羟基十二烷基辅酶a的存在(图7)2(正确的路径)。得到的7-羟基十二烷基辅酶a原则上可以用经典的β-氧化酶进一步降解。然而，这种替代途径也意味着存在链长比C12短的羟基化中间体，并且同样不能解释十二烷基辅酶a、癸烷酰辅酶a和辛烷酰辅酶a的存在。只有当羟基二烯体系在c12阶段被完全降解时，这些中间体才能被解释(图2)2中间道路)。然后使用正常的β-氧化反应完全降解产生的十二烷基辅酶a，这是我们的数据支持的唯一途径。

除了饱和短链中间产物的形成方式相似外，黄瓜和向日葵的glyoxysome在一些中间产物的形成方式上存在差异。在黄瓜glyoxysomes对13-HOD的转化过程中发现了大量被氧化的游离脂肪酸中间体，表明在前两轮中β-氧化就退出了。相反，当使用向日葵细胞器时，主要观察到羟基-二烯体系向酮-二烯体系的转化。两种观测结果都只能解释三到四个(而不是八个理论可能)的不充分形成，图1)从每个分子13-HOD中提取NADH分子。13-KOD衍生物可能以这种方式引起特别的兴趣，因为它们具有活性的α，β-不饱和羰基。这类化合物被称为反应性亲电物质，这类化合物不仅包括脂肪酸氧化产物，还包括次级代谢产物、hem代谢产物和许多其他产物[20.]。反应性亲电物质如氧脂类12-氧二烯酸和己烯醛刺激生存基因的表达，这些基因在环境胁迫和发病过程中通常被上调[21]。据报道，拟南芥叶片对病原体感染的反应是形成酮二烯，其中这些化合物可能作为植物抗毒素[22]。高浓度的这些代谢物可能具有毒性作用，尽管它们会使酶失活或由于与硫醇等亲核化合物的反应而改变细胞的氧化还原状态[20.]。因此，我们很容易认为，这种失活可能是向日葵和黄瓜glyoxysomes直接降解13-KOD能力较弱的原因。这一发现还表明，13-KOD不是13-HOD降解的必要途径中间体。然而，13-HOD是否形成反应性亲电物质是相关的在活的有机体内并支持幼苗活力，或者只是在施用下人为地增强在体外条件方面，仍是投机性的。

黄瓜和向日葵体系的另一个显著差异是LA的周转。在光学分析中，黄瓜Glyoxysomes比13-HOD更倾向于降解LA，而向日葵细胞器仅表现出非常弱的LA生成NADH。这一发现以及在没有NAD的情况下LA迅速转化为13-HOD并被激活为13-HOD- coa的观察，促使我们假设，在向日葵中LA的降解通常是由氧化为13-HOD引起的。然而，向日葵glyoxysomes从LA生成NADH的弱能力在某种程度上令人不解，因为最初形成的13-HOD应该是一种有效的底物，但可能仅限于使用的向日葵品种。当la衍生的13-HOD以nadh依赖的方式氧化为13-KOD时，甚至可以预期nadh形成的初始爆发。这种转化确实依赖于NAD，这可以从观察中得出，在一个完整的β-氧化实验中，13-HOD产生了大量的13-KOD(图2)5)，但当NAD不存在时，只形成13-KOD的痕迹(图2)3.)。然而，如果酶失活的速度快于底物的消耗，那么向日葵细胞器的强氧化能力可能解释了在LA转换过程中产生的NADH的量很低。

总之，提出的发现可能对植物中不寻常脂肪酸的产生产生影响。我们的研究结果可能表明，一些植物(如使用的向日葵品种)可能面临严重的问题，因为它们具有很强的氧化能力，并由此将不寻常的脂肪酸转化为活性亲电物质。其他植物(如黄瓜)可能更适合生产大量的脂质。本文提出的13-HOD转化谱分析方法可作为目前应用的经济植物强氧化能力和弱氧化能力分类的参考系统。观察表明，这里呈现的活性不仅局限于幼苗在黑暗中发芽，在光照条件下生长7天的绿黄瓜幼苗也能有效地转化13-HOD(数据未显示)。因此，所获得的结果很可能也适用于叶片中受伤或病原体感染过程中形成的氧化脂素的降解[23]。

材料

所有化学品，如果没有特别提到，都是从Sigma-Aldrich(慕尼黑，德国)，默克(达姆施塔特，德国)或卡尔罗斯公司(卡尔斯鲁厄，德国)购买的。所有HPLC级溶剂均购自Acros(比利时Geel)或Baker(德国Griesheim)。脂肪酸底物从Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA)或Larodan (Malmö， Sweden)订购。

植物生长与glyoxysomes的分离

30克黄瓜籽(Cucumis巨大成功,简历。Chinesische Schlangengurke, N. L. Christensen, Erfurt，德国)或40克葵花籽(向日葵,简历。来自德国斯特劳宾Hespa Sonnenblumen的Spanners Allzweck在28°C和100%湿度的黑暗中发芽。在第4天(黄瓜)或第7天(向日葵)收获子叶酮，并分离乙氧基体[12]。简而言之，子叶酮在冰面上用刀片均匀，研磨介质为(1 M蔗糖，170 mM Tricin pH 7.5, 10 mM KCl, 1 mM MgCl)₂(1 mM EDTA, 0.7% BSA, 20 mM β-巯基乙醇)，用奇迹布过滤。为了去除残留的粗糙植物物质，样品在1500 g下离心10分钟。得到的上清随后在14000 g下离心20分钟。沉淀在3ml研磨介质中溶解，并应用于蔗糖密度梯度，由以下层组成:4 mL 60%， 5 mL 57%， 7 mL 52,5%， 7 mL 47%， 5 mL 43%， 5 mL 35%。在100000 g离心90分钟后，间期的glyoxysomal fraction在57%到52.5%之间。蛋白质浓度根据Bradford测定，使用BSA进行校准，并在57%的蔗糖中稀释至0.15 mg/mL [24]。

β-氧化活性测定

利用25°C下产生的NADH的吸收，在光学分析中监测乙醛酶体部分的β-氧化活性。将100 μL的glyoxysomal fraction与900 μL的β-氧化反应混合物混合，在乙醇中加入20 μL合适的脂肪酸引发反应。标准分析的最终组成为175 mM Tris pH 8.5, 10 mM ATP, 0.6 mM NAD⁺， 0.6 mM CoA, 20 mM Na-azid, 7.5 mM MgCl₂， DTT 1 mM, glyoxysomal protein 15 μg/mL。的formation of NADH was quantified using the molar extinction coefficient at 340 nm ϵ₃₄₀= 6200米¹*厘米¹．

hplc法分离β-氧化中间体

1 mL的β-氧化反应混合物(见上文)在不同的时间点通过95℃孵卵5分钟灭活。样品使用固相萃取管(Strata C18-E, 55 μM, 70A, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)纯化，以去除糖和聚集蛋白。因此，将1ml样品应用于用1ml H平衡的管中₂O:MeCN:AcOH(95:5:1，按体积计)，然后用2ml H洗涤₂O:TEA(100:0.25，按体积计)。用1 mL乙腈:H洗脱β-氧化中间体₂(90:10，卷)。有机溶剂在氮气流下蒸发，剩余样品在50 mM Mes pH 5.0下调节至120 μL。

100 μL样品采用反相高效液相色谱法(柱EC 250-2 Nucleosil 120-5 C18;Macherey-Nagel, d ren，德国)和β-氧化中间体使用25 mM磷酸盐pH 5.3和乙腈之间的复合梯度分离(附加文件)1:图S1)。

GC/MS和ESI-MS鉴定β-氧化中间体

中间体的ESI-MS/MS分析使用Applied Biosystems 3200混合式三重四极杆/线性离子阱质谱仪(MDS Sciex, Ontario, Canada)与ESI芯片离子源(TriVersa NanoMate;BioSciences, Ithaca, NY, USA)。各HPLC组分在流氮下干燥，再以10 μL乙腈/H重悬₂O/乙酸(90:10:10 .1，按体积计)，并定向到纳米esi芯片，调整到电离电压为-1.25 kV和气体压力为0.2 psi。中间产物在负离子模式下电离，在产物离子扫描模式下测定m / z从350到1100不等。碰撞电池中氮气的碰撞能量为-55 V，脱簇电位为-120 V，退出电位为-8 V。质谱分析仪在半高处调整到0.7 μ全宽的分辨率。对于每个频谱，在多通道分析仪模式下平均进行10-20次连续扫描。离子源温度为40℃，幕气设为10(单位任意)。为了鉴定酰基辅酶a中间体，在a的前体离子模式下对HPLC组分进行了分析m / z范围从700到1100，选择前体离子m / z408年(25]和与上述相同的设置。

中间体的GC/MS分析使用Agilent 5973网络质量选择检测器连接Agilent 6890气相色谱仪，配备毛细管DB-23柱(30 m × 0.25 mm;0.25 μm涂层厚度;J&W科学，安捷伦;Waldbronn,德国)。以氦气为载气，流速为1ml min¹．温度梯度为100°C 1 min, 150-250°C 8 K min¹250℃，持续6 min。注射温度设置为220℃。电子能量为70 eV，离子源温度为230℃，传输线温度为260℃。离子记录在am / z范围从50到400。

辅酶a:

辅酶A

H (P) OD:

氢(pero)xy十八二烯酸

拉:

亚油酸

KOD:

酮十八烯酸

液态氧:

脂氧合酶

女士:

质谱分析

NAD:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

RT:

保留时间

茶:

三乙胺

标签:

三酰甘油。

这项工作得到了德国研究协会(fe446 /4)的支持。我们感谢萨宾·弗莱塔格提供的技术援助。

从属关系

1. 乔治-奥古斯特大学Albrecht-von-Haller植物科学研究所植物生物化学系，Justus-von-Liebig-Weg 11, Göttingen, D-37075，德国

   Danilo Meyer, Cornelia Herrfurth, Florian Brodhun和Ivo Feussner

相应的作者

对应到Ivo Feussner．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

DM分离纯化了glyoxysomes，并进行酶分析和孵育实验。DM、CH和FB进行产物分析。DM, FB和IF设计了研究并撰写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作品要有适当的署名。创作共用公共领域免责声明(https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。

转载及权限