克隆多样性及相对克隆年龄估算在山药农业生物多样性研究中的应用薯蓣属rotundata）

背景

无性繁殖是在植物和动物王国中发现的一种特殊的生殖系统，从人类寄生虫到无性繁殖的作物。克隆多样性提供了植物和动物进化史的信息，即克隆如何传播，或特定克隆的年龄。在植物中，这可以提供有关农业生物多样性动态的有价值的信息，并更广泛地了解特定作物的进化史。我们研究了山药的进化史，薯蓣属rotundata．在非洲，山药是通过块茎无性系繁殖栽培的。

结果

利用12个微卫星标记对山药品种克隆内多样性进行了鉴定。然后，我们利用这种多样性来评估克隆的相对年龄。通过模拟，我们评估了近似贝叶斯计算如何利用克隆多样性来估计克隆的年龄，这取决于样本的大小、独立样本的数量和标记的数量。然后，我们将这种方法应用于我们的特定数据集，并表明可以估计品种的相对年龄，并且可以按年龄对每个品种进行排名。

结论

我们在近似贝叶斯框架中给出克隆年龄的第一个估计。然而，克隆年龄的精确估计取决于突变率的精确。我们提供了有关农业生物多样性动态的有用信息，并建议在无性系繁殖作物中反复创造品种多样性。

无性繁殖在植物、真菌、微生物和少数通过孤雌生殖繁殖的动物中很常见[1]。无性繁殖产生的后代在基因上与父母完全相同。人类利用这一特性种植一年生作物(木薯、土豆、山药、芋头、红薯等)、多年生植物(葡萄藤、橄榄、棕榈树、柑橘、苹果、桃子、樱桃等)和观赏植物(百合、郁金香、番红花、水仙等)。由于没有重组，通过无性繁殖繁殖的作物主要通过突变和漂变来进化。因此，通过分析植物的遗传多样性来研究品种的传播是可能的。利用这一特性，Moncada等人[2]利用84颗核微卫星分析了“赤霞珠”葡萄品种的起源和传播。他们的研究结果表明，法国是该品种的起源中心，随后传播到澳大利亚、智利、匈牙利、意大利、西班牙和美国，在那里出现了新的基因型。

由于突变随着时间的推移而积累，突变的数量提供了有关特定克隆年龄的信息。从理论上讲，利用这些信息来深入了解作物的进化史是可能的。据我们所知，还没有研究利用这一信息对无性繁殖作物作出这样的推断。

大多数进化模型都是针对有性生殖的生物体发展起来的。新工具的最新发展[3.和一种新的统计方法[近似贝叶斯计算ABC, 4]将通过提供强大的建模方法来促进无性繁殖作物的进化研究。ABC是一种基于模拟的方法，允许对参数进行贝叶斯估计和对模型进行比较[4]。在这种方法中，使用预定义的进化模型来模拟数据，其中参数是随机选择的先天的分布。在模拟数据上计算汇总统计，并与真实数据集上计算的汇总统计进行比较。利用在模拟数据上计算的汇总统计量与实际数据之间的距离后验可以建立参数的分布。ABC目前被广泛用于测试情景和估计参数，包括植物、动物和病原体的分化时间和种群大小。[5- - - - - -9]。

多亏了这些新工具，现在有可能超越对无性生物遗传多样性的描述，并推进我们对其进化史的了解。本文以无性繁殖作物山药为研究对象，研究了山药品种的年龄变化。

山药(薯蓣属rotundata)是一种生产淀粉块茎的一年生作物，广泛种植于热带国家，特别是西非[10]。山药是农民利用块茎片段无性繁殖的。这种耕作系统是有利的，因为具有高适应性等级的植物可以多年保持不变。番薯的驯化可以追溯到1万年前的西非[11]，但由于考古遗迹的缺乏和深入的基因数据，无法确定确切的日期或地点。最近对山药多样性的分析显示，山药在两个形态上都有显著的变异。12，13]和在分子水平上[14]但也表明山药的遗传多样性是高度结构化的[15]。事实上，农民对山药品种的管理避免品种混合，并在选择用于下一代的块茎时强烈选择异型[16]。因此，品种分化较好，品种内遗传多样性很低。因此，可以认为山药品种是通过积累突变而进化的单一基因型[15]。了解了品种的突变率和种群进化，就有可能估计出品种是什么时候被创造出来的。

然而，以往的研究表明，山药并不仅仅是通过无性繁殖来培育的。据报道，在许多国家和民族中都有一种被称为“册封”的做法[17，18]。这种做法包括测试和选择在耕地外自然生长的植物。如果这些植物符合农民的要求，它们将作为新品种纳入栽培池。遗传学研究表明，农民主要选择野生植物和野生(d . abyssinica和d . praehensilis)和栽培品种，而且这种授精做法实际上导致在栽培池中出现杂交品种和野生基因型[19]。这些研究还表明，山药多样性并不像最初认为的那样冻结，因为有性繁殖创造的多样性已经被纳入其中。然而，今天，只有不到5%的山药农民继续进行改良，而且这种做法通常无法生产出新品种[17]。

我们的主要目的是评估克隆性和性在山药多样性进化中的相对重要性。为此，我们需要确定新旧品种是否在今天的山药基因库中共存。潜在的假设是，一个积累了突变的品种一定是在很长一段时间内通过克隆繁殖繁殖的，因此可以被认为是一个“老”品种。相反，没有积累突变的品种一定是最近通过有性繁殖产生的，因此可以认为是“最近的”品种。

本研究利用12个核微卫星位点分析了7个山药品种820个单株的遗传多样性。我们创建了一个模型来模拟克隆繁殖过程中遗传多样性的进化。利用近似贝叶斯计算(Approximate Bayesian Computation, ABC)方法比较了真实和模拟数据的遗传多样性，估算了品种的相对年龄，从而揭示了山药多样性的进化动态。

山药品种的遗传多样性

对7个品种820份样品的12个微卫星位点进行基因分型，共发现18个基因型。表格1显示了品种内基因型的分布。每个品种平均有3个基因型(最小1个;除Aboudja和Ahimon两个品种外，其余品种的基因型均具有品种特异性。基因型之间的关系如图所示1．除了相同的两个品种(Aboudja和Ahimon)外，每个品种特有的基因型分化明显，至少有8个突变。在品种内，基因型密切相关，最多有两个突变。品种Ahimon和Aboudja共享基因型A和C，但比例不同:Aboudja样品中94%为基因型A，而Ahimon样品中70%为基因型C。根据我们掌握的信息，无法确定两个品种是共同起源还是混合。

模拟数据-该方法的试验

人工品种的树龄估计见图2．详细结果可在补充数据文件(附加文件)中找到1:图S1，附加文件1:表S1和附加文件1表2)。

使用模拟数据集对该方法进行了测试(图2)2)。我们首先确认了使用的统计数据(K_k,注_k,置_{k_k”}和凯_{k_k”})和参数T，范围为0.071 (p < 0.05) ~ 0.479 (p < 0.0001)。这表明所使用的统计数据具有足够的信息量，可用于t的估计。每个模拟模型的详细结果可在补充数据文件中找到。

总体而言，该方法能够正确估计模拟品种的年龄(图2)2)。在48次模拟中，模拟的老品种的平均年龄估计为3055代(95% CI 1072-4726)，而预期年龄为3000代。模拟晚熟品种的平均年龄总是被高估，平均年龄为1128代(95% CI 109-2750)，而预期年龄为500代。我们观察到，最近品种的估计年龄和置信区间高度依赖于所使用的位点数量。抽样的种群数量也会影响最近品种的结果，但影响程度较小，而每种群的样本数量对估计没有影响。老品种的年龄估计不受基因座数和抽样的强烈影响。

Yam数据-汇总统计和参数之间的相关性

汇总统计量(K, Nb, Fst和CLst)与参数T之间的相关性使用1000个随机选择的模拟进行估计(表1)2)。就像我们测试方法时一样，汇总统计和参数之间的相关性是显著的。

每个模拟都提供一些汇总统计数据，包括每个亚群观察到的基因型数量(Nb)。使用每个突变率随机选择的1000个模拟，我们计算了每个突变率下每个亚群体观察到的基因型的平均数量。变异率为0.00001，平均每个亚群体有3个基因型(μ = 0.00005为9个;14 μ = 0.0001;25 μ = 0.0005)。

估计山药品种的年龄

利用该方法，我们用μ = 0.00001估计山药品种的年龄(表1)3.,图3.)。品种的年龄估计在93 ~ 1776代之间，考虑到在一年生繁殖的情况下，每年只有一代，这意味着93 ~ 1776年。T的估计值均与大方差相关，但品种年龄之间的差异总是显著的(Kolmogorov-Smirnov检验，p < 0.00001)。请注意，品种年龄的估计在很大程度上取决于所选择的突变率(图2)4)。7个品种的平均年龄为448岁，μ = 0.00001(表2)3.μ = 0.0005，为112年。因此，将突变率降低50%会使估计年龄增加7岁。比较相同突变率的T值，可以将品种从最近的到最古老的进行排序。无论使用何种变异率，顺序总是相同的:Moroko是最年轻的品种，其次是Alassini、Aboudja、kouna、bonniwour、Wouloukaba、kinksamuzouzou，最后是最古老的品种Ahimon。

本研究利用核微卫星位点分析了7个山药品种的遗传多样性。使用近似贝叶斯计算(ABC)，我们证明了用我们的模型可以估计七个品种的相对年龄，并将它们分类为老的或最近的。到目前为止，这项研究是第一次使用ABC方法来估计克隆的年龄。

方法检验

用已知参数的人工品种进行模拟，结果表明该方法能够正确地估计散度时间。在模拟中，无论使用多少个种群、个体或基因座，高方差总是与旧品种的散度时间估计有关。在最近的品种中，这种差异要低得多，特别是当使用了许多位点时。这个结果可以用同质性来解释[20.]。事实上，在我们的模型中，由于DNA复制过程中的错误，微卫星重复序列随机增加或减少。一个物种进化的时间越长，它积累的突变就越多，同质性就越多，从而扰乱了进化信号，导致了更高的变异。当估计是基于分子数据或ABC方法时，大方差通常与发散时间的估计有关[8，9，21]。然而，即使有很大的差异，仍然有可能评估一个品种相对于其他品种的相对年龄。在这里，我们的目标不是估计山药品种的绝对年龄，而是了解某些品种是否比其他品种更年轻。

我们的结果表明，在这个特殊的模型中，每个群体至少抽样20个个体是一个很好的策略。此外，如果可能的话，使用来自许多种群的少量样本(例如10个或20个)比使用来自少数种群的大量样本(例如50个)更有效。事实上，T参数主要与Fst和CLst这两个基于群体遗传结构比较的统计量相关。无论抽样大小如何，当至少使用12个标记时，估计相对较好。更多的标记导致较小的方差，但对结果没有显著影响。我们的实地抽样是在抽样的种群数量和每个种群的样本数量之间的折衷。我们对每个群体至少抽样27个人，并且在可能的情况下，我们对尽可能多的群体进行抽样。最终的种群数量从2个到5个不等，每个样本的大多数种群数量为3个。我们使用了12个微卫星位点，在我们的模拟研究中，这个数字与令人满意的估计有关。

接近极限

我们的研究是最早使用ABC方法来估计克隆的相对年龄的研究之一。然而，为了更好地理解，我们必须解释这种方法的局限性。在这里，我们使用了一个简单的模型，在这个模型中，所有给定品种的种群都是同时产生的，种群的大小是固定的，种群之间没有迁移。我们承认，这个模型可能不能完全代表复杂的耕作现实。然而，这是估计克隆的相对年龄的一个有用的初步方法。

一个重要的参数是突变率。这在本研究中尤为明显:从μ = 0.0005切换到μ = 0.00001，估计年龄乘以7倍。到目前为止，还没有对山药微卫星的突变率进行估计，但我们从以前的研究中知道，它们可以从10%到10%不等²(人类)到10⁶(果蝇)取决于有机体和微卫星模式[22，23]。在这里，我们选择了最适合我们真实数据集中观察到的基因型数量的突变率(0.00001)的模拟结果。在不知道确切的突变率的情况下，仍然可以估计品种的相对年龄，这是本研究的目的。

最后，我们的方法能够估计一个品种在我们收集样本的村庄分裂成几个种群的时间。因此，为了解释我们的数据，我们需要考虑到我们获得的日期对应于同一品种的几个种群的分化时间，并且原始克隆可能更老。

本研究结果对山药农业生物多样性的启示

像其他几种块根和块茎作物一样，山药采用无性系繁殖栽培。由于没有有性繁殖，很容易假设这些作物只通过突变和漂变进化。然而，在过去的20年里，很明显，传统耕作也使用有性繁殖，即使不是直接播种，而是通过选择在田间或田间自发生长的幼苗(山药、木薯、红薯、芋头、[19，24- - - - - -27])。这样的系统是非常有利的，因为最好的基因型可以保持相同，而新的基因型可以通过有性繁殖而产生[19，28]。由于遗传标记的使用，毫无疑问，原始基因型已通过修饰引入山药种质[28]。然而，我们知道，今天很少有农民继续这样做，而且，即使他们这样做，这种做法往往不能生产出可种植的植物。17，29]。因此，不可能知道在山药种质中发现的原始基因型是以前实践的遗迹还是动态正在进行的进化过程的证据。在这项研究中，我们发现老品种和新品种共存，这意味着农民仍然能够通过高贵培育出新品种。我们的研究是在广泛使用的品种上进行的[16]。因此，本研究表明，山药栽培是一个动态和持续的过程:新的基因型经常被引入并成为广泛使用的品种。这样一个动态的过程可能会引入更好地适应新的生物或非生物环境的新品种。然而，新克隆的选择优势尚未得到证实。另一个有待回答的重要问题是，这样一个系统能否在全球范围内维持快速变化。

我们开发并测试了一个模型，使用近似贝叶斯计算来估计克隆的年龄。该模型使我们能够估计山药品种的相对年龄，并区分老品种和新品种。我们的调查有力地支持了在山药农业系统中定期引进新品种的假设。我们开发的框架可以用于任何无性繁殖的生物体，并且应该有助于理解在广泛的生物体中克隆的产生和传播。

植物材料和基因分型

2010年在贝宁北部的一个村庄共采集了820份样本。对15个农民的田地和7个品种进行了抽样调查。每个品种在两到四个不同的田地里取样。记录各品种的种群大小数据(表2)4)。在田间随机采集叶片样品，用硅胶干燥。

DNA提取和基因分型按照[30.]。我们使用了12个微卫星基因座:Dab2D06、Dpr3F10、Dab2D08、Dpr3B12、Da3G04、Dpr3D06、Dab2C05、Da1D08、Dpr3F12、Dpr3F04、Da1F08和YM13。31，32]。使用ABI Prism™3100基因分析仪(应用生物系统公司，福斯特城，CA, USA)进行迁移。使用GeneMapper软件对等位基因进行评分。在少于5个样本中观察到的基因型进行了两次基因分型(新PCR、新迁移、新评分)，以确保它们不是错误的结果。

多样性分析

对每个品种，记录观察到的基因型的数量和频率。用最小跨越网络(MSN)表示基因型之间的关系。

品种年龄的估计

我们使用了近似贝叶斯计算方法[33]通过研究品种内部和品种之间的多样性来估计品种的年龄。

进化模型

他们编写了一个自制的程序来模拟种群通过无性繁殖的进化。我们使用了一个种群，分为k个亚种群，进化了T代。N表示子种群的大小。k个子群体中的N是相同的。创建后，每个子种群是独立的，即子种群之间不发生迁移。在T = 0时，我们将相同的基因型分配给每个群体中的每个个体。然后从上一代中随机选择kxN基因型来创建每一代。在这个过程中，一个基因型可以被选择几次，也可以由于漂移而消失。然后根据突变率μ将突变添加到每个微卫星位点。微卫星重复次数随机增加或减少。 At the end of the simulation, n samples are selected in each sub-population and summary statistics are calculated. The program is set to perform X independent simulations. Parameters n and μ are fixed at the beginning of the simulations, i.e. they are the same for X simulations. Parameters N and T are drawn from a discrete uniform distribution for each simulation.

摘要统计信息

在X次模拟结束时，计算四个汇总统计量来描述群体的遗传多样性和结构:K_k为每个亚群中等位基因的平均数量;注_k为每个亚群中基因型的数量;置_{k_k”}是对两个亚种群之间等位基因频率差异的估计;和凯_{k_k”}是两个亚群之间基因型频率的估计差异。CLst与Fst相似，但是以基因型频率而非等位基因频率计算[15]。

近似贝叶斯计算(ABC)

利用自制程序生成X个模拟数据，并对模拟汇总统计量进行估计。观察数据用于估计观察的汇总统计量。我们使用模块ABCestimator从ABCToolbox包(34]，计算参数N和t的ABC估计。选择用于估计一般线性模型(GLM)的模拟次数设置为总模拟次数(X)的1%，其他参数设置为默认值。

使用学生t检验检验汇总统计量与参数之间的相关性。在1000个随机选择的模拟的子集上估计相关性。对保留的1%模拟使用Kolmogorov-Smirnov检验来比较品种间T参数的估计。

测试方法

为了检验我们的方法是否能够有效区分新旧品种，我们模拟了具有已知参数的人工品种，并根据上述方法对这些参数进行了估计。我们模拟了30个N = 1500、T = 500、μ = 0.00001的新人工品种和30个N = 1500、T = 3000、μ = 0.00001的旧人工品种。对每个人工品种进行汇总统计。然后，我们计算了新旧品种的平均汇总统计量。采用均值汇总统计量计算参数N和T的ABC估计。

进化模型参数设为X = 100,000;μ = 0.00001;N = [100-5000]， T =[0-5000]。我们进行了48次独立模拟，以测试k = 2, k = 4, k = 6, n = 10, n = 20, n = 30, n = 50以及四种不同数量的位点(6,12,24和36)的所有组合。

山药品种的应用

进化模型参数设为X = 250000;N = [100-5000]， T =[0-2500]。突变率设为4个不同的值:μ = 0.0005、μ = 0.0001、μ = 0.00005和μ = 0.00001，分别对应4个独立的模拟集。每个子总体的数量k和模拟结束时选择的样本数量n都被设置为适合采样(表2)4)。

支持数据的可用性

支持本文结果的数据集位于附加文件(附加文件)中1表S3)。

作者感谢B. Khadari(蒙彼利埃INRA)，他帮助改进了手稿的最初版本。

从属关系

1. 法国蒙彼利埃Cedex 5号，34394，法国蒙彼利埃，1111avenue Agropolis, BP 64501, UMR DIADE, institute de Recherche pour le d发展研究所(IRD)， DYNADIV团队

   诺拉·斯卡切利，玛丽·库德克和伊夫·维古鲁

2. 巴西帕拉库大学农学院，BP 123，巴西帕拉库

   Mohamed N Baco和Janvier Egah

相应的作者

对应到诺拉Scarcelli．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

NS和YV设计并进行了研究，分析了数据并撰写了论文。NS、MC、JE和MNB进行了研究。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

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