种子发育的双向启动子及相关激素/胁迫反应

背景

双向启动子在基因组中很常见，但实验研究不足，特别是在植物中。我们描述了一种有针对性的鉴定和选择一个假定的双向启动子子集，以鉴定参与种子发育的基因，并研究基因对对种子成熟重要条件(如干燥和aba调节)可能的协调反应。

结果

我们在拟南芥基因组中搜索了100 - 600bp的基因间区域独联体-基于元素的选择，用于包含G-box基序CACGTG的多个拷贝。其中一个推测的双向启动子也包含一个CE3偶联元件，位于一个G-box下游5bp处，与之前在研究中描述的相同HVA1大麦的推动者。在拟南芥中，CE3元素的代表性和研究程度明显不足。我们进一步表征了与该启动子相关的一对基因，并揭示了两个小的、以前未被表征的植物特异性蛋白在拟南芥种子发育和胁迫反应中的作用。

结论

利用生物信息学，我们确定了参与种子发育的可能的双向启动子，并分析了一对植物特异性基因在不同组织中对激素/胁迫的表达模式。我们还提出了这些基因的初步功能分析，暗示在种子发育中的作用。

双向启动子在基因组中很常见[1最近才被发现和研究在网上包括拟南芥在内的植物完整基因组[2，3.]。这些促进剂在生物技术方面的相关性和潜力已被记录[4- - - - - -6]，特别适用于基因叠加方法，即需要多于一个基因才能以转基因方式赋予某一特定性状，或需要多于一个性状，例如对一组害虫的抵抗力[7]。虽然研究人员可以设计出双向的极性启动子[4，6]，如果我们能够描述植物中自然发生的双向启动子的特征，这些可以提供有价值的替代方案，或者至少是关于其作用模式的信息来源在足底。

除了与应用和生物技术相关外，双向启动子的存在已被认为是转录控制的一种基本和复杂的手段[8，9]。对酵母的研究表明，双向启动子不仅普遍存在，而且是生物体中大多数隐转录的来源，因此也是转录调控的手段[10，11]。

除了对双向启动子进行详细实验分析的孤立例子外[12- - - - - -15]，迄今为止发表的几乎所有工作都是以生物信息学为基础的，而这项工作无疑强调了双向启动子在从基础转录控制研究到癌症研究临床相关性等领域的普遍性和潜在重要性[8，9，16]，它仍然需要通过关注感兴趣的特定基因对的实验来探索这种基因组织的功能相关性。用于分离一组可行基因的生物信息学/基于计算的标准可能会根据分析的预期结果而变化，并且可能涉及编码和非编码特征-在这种情况下，我们使用这两种方法来确定参与种子发育的调节基因的假定双向启动子。分析与一组定向双向启动子相关的发散转录基因可能会发现参与发育和/或在共同或互补过程/反应中不同功能类别基因之间先前未描述的关系的新基因。

我们使用生物信息学来搜索和鉴定一个假定的双向启动子子集，我们预测这些启动子将调节在种子发育中起作用的基因。ABA是植物种子发育过程中不可或缺的一部分，但从机制上来说，ABA介导了种子的脱水耐受性和休眠[17]。因此，在干旱和寒冷的胁迫反应以及与发芽过程的拮抗相互作用之间存在广泛的串扰[18]。对ABA的反应是由基于ACGT核心的启动子基序介导的，称为ABREs(脱落酸响应元件)，包括G-box元件(CACGTG)。在先前发现的双向启动子中发现了该元件，该启动子调节与ABA反应和种子发育有关的基因[19- - - - - -21]，以及受光调控的基因的启动子[22，23]。ACGT两侧核苷酸的同一性已被发现是该元件特异性的重要决定因素[24，25]。的使用独联体-诸如ABREs等识别ABA和应激反应相关基因的元素已被先前描述[26]。G-box ABRE通常与其他基序和偶联元件(CE)结合，这些基序和偶联元件可以衍生于ACGT核心或与ACGT核心不同，并且还参与种子/ABA调控以及对渗透和低温胁迫的响应[qh]18，27]。此外，与寒冷和脱水调控相关的特定基序已被归类为来自CCGAC核心序列的DRE/ crt(脱水反应元件/c-repeat) [28，29]。

先前的研究发现两个基因在成熟的种子中高度表达[30.，31]。这些基因是从411bp的基因间区(起始密码子之间)转录而来，该区域包含三个参与aba调控种子发育的G-box (CACGTG)基序拷贝[20.，30.，31[附加文件1:图S1A)。这些基因At4g16155和At4g16160编码一个质体外包膜蛋白OEP16-S和一个脂酰胺脱氢酶ptLPD2，也定位于质体(在这种情况下是基质)[31]。最近的功能分析揭示了这些基因分别在代谢波动和砷酸盐敏感性中起作用[32，33]。此外，种子表达的油蛋白基因的不同排列，OLE1和一种缩氨酸亚砜还原酶，PMSR，分别为At4g25130和At4g25140芸苔属植物显著然后在拟南芥(21，34，35]。这个499 bp(起始密码子之间)的启动子包含两个G-box基序的拷贝(附加文件)1:图S1B)。PMSR蛋白是质体定位的，当PMSR蛋白发生突变时参与氧化应激反应OLE1赋予耐寒性[36，37]。

我们结合ABRE和相关基因的双向排列搜索独联体-元素在拟南芥基因组中，随后集中在一对未知功能的植物特异性基因，我们详细描述了。在生物信息学搜索中鉴定的基因的身份和定位表明，这种基因排列可能能够对压力或环境刺激(如干旱或激素)做出协调或互补的反应，而基因产物在不同细胞器上的定位可能反映了一种协调应激条件诱导的复杂细胞内相互作用的手段。

生物信息学分析

拟南芥从ENSEMBL植株17中下载基因，标题包括基因ID、转录本ID、编码序列、染色体名称、转录本起始、转录本末端和链。假定的双向启动子是使用内部Perl脚本确定的，该脚本在同一染色体的相反链上搜索转录本的头信息，这些转录本的起始位点彼此在100 - 600bp之间。(将逆转录本的起始位点作为ENSEMBL的“转录本末端”位置)。从ENSMBL植物的17条染色体中检索假定的双向启动子序列，寻找CACGTG基序的存在。

我们使用了AtGenExpress可视化工具(AVT;http://jsp.weigelworld.org/expviz/expviz.jsp)提取基因表达数据(如有需要，可使用发育、非生物应激、激素和光数据集)[38- - - - - -40]。

序列分析

利用BLAST标准检索工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。用于氨基酸比对的同源序列的加入编号显示在附加文件中2:表1)。使用CLUSTALX和BioEdit进行比对[41，42]。使用的定位预测程序有PSORT [43]和TargetP [44]。启动子基序的搜索使用PLACE [45]，使用TMHMM Server v2.0进行跨膜预测[46]。

植物材料和生长条件

拟南芥野生型(Col-0)和T-DNA插入植株在对照环境中生长，光周期为16 h, 120 ~ 140 μmol/m²光照强度/秒，相对湿度40-50%，温度21±2℃。对于花药开裂的杂交，在授粉前48 ~ 72 h，闭合的花蕾被阉割。

为了进行硅片分析，从每株植物(野生型、T-DNA插入系或两者杂交)中收集5个最长的绿色硅片，在解剖显微镜下切开，测定正常种子、早期和晚期流产种子以及未受精胚珠的数量。

压力治疗

拟南芥幼苗在含0.5 xms盐、0.5 xms维生素、0.5 gl的培养基上，22°C垂直培养3周¹4- morpholineethanes磺酸(MES)， 0.5% (w/v)蔗糖和0.7%琼脂，pH 5.7。每个处理将幼苗转移到有无菌滤纸的培养皿中，培养皿分别浸泡在MS液体培养基、10 μM ABA(0.1%甲醇)或0.1%甲醇中。每个处理分别在3 h和24 h后收集3株幼苗进行进一步分析。对于脱水胁迫，将幼苗置于室温下的开放式培养皿中放置1.5 hKIN1和RD29基因是从金身上提取的et al。(47]。

蛋白质的定位

用Gateway兼容引物从SALK orf修饰的pUNI克隆(u23027)中扩增出At3g03150的全长编码区，并克隆到pDONR207进入载体(Invitrogen)中。这被用于在GFP- c - bin中进行c端GFP融合，并随后在烟草细胞中进行瞬时转化。烟叶(烟草benthamiana)用饱和的农杆菌属用10mm MgCl重悬₂， 10 mM MES, 100 μM乙酰丁香酮至OD₆₀₀0.4)，浸润后10天观察GFP定位。线粒体跟踪器CMX Ros red (Molecular Bioprobe)在水中400 nM下使用45 min，水洗3次，水洗5 min。采用40倍油浸透镜对倒置SP2共焦(徕卡)进行观察。用氩气离子激光器在488nm处激发GFP，用绿色氦氖激光器在543nm处激发Mito跟踪器进行顺序扫描。

RT-PCR和qRT-PCR转录本分析

从插入系的花组织和野生型拟南芥的花、硅油、根、莲座和茎生叶和茎组织中提取总RNA，并按照制造商的说明使用BioScript试剂盒(Bioline)制备cDNA。从cDNA中扩增At3g03150的引物分别为150f和150r;用于At3g03160, 160f和R;At5g17165、165 F和R和At5g17190、190 F和R用Actin作为对照，引物为Actin2F和Actin2R。

从ABA/胁迫处理的幼苗中提取总RNA答:芥根据制造商的说明，使用TriSure™(Bioline)和DNase I (NEB)处理。每个样品取700 ng RNA，用Tetro cDNA synthesis Kit (Bioline)进行20 μl的cDNA合成反应，按照制造商的说明进行。通过实时PCR定量At3g03150和At3g03160转录物水平，使用1 ul 1:20稀释的cDNA模板，在20 ul反应中含有SYBR Green JumpStart™Taq ReadyMix™(Sigma-Aldrich)和引物150 qF和150 qR，或160 qF和160 qR，终浓度为0.5 uM。每个反应在PTC-200 Peltier热循环器(MJ Research)中进行三次，使用以下条件:在95°C变性3分钟，然后在95°C变性30秒，在55°C退火30秒，在72°C延长30秒。18S使用内参基因，引物18S F和18S R。所有引物均在附加文件中列出3.表S2。

启动子的克隆

利用引物AtPromF和AtPromR从Col-0基因组DNA中扩增出At3g03150-At3g03160启动子序列(位于两个ATG起始密码子之间)3.(表S2)和校对DNA聚合酶(Velocity, Bioline)。利用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Scientific)将扩增的基因组片段克隆到pJET1.2载体上，并测序确认。从pJET1.2载体两个方向上扩增启动子片段，并将其克隆到Gateway®入口载体pDONR221 (Invitrogen)中。At3g03150的引物为150promF和R, At3g03160的引物为160promF和R。利用单位点重组将每个启动子克隆导入pKGWFS7目的载体中，以利用基因间区驱动GUS在两个方向上表达的能力。

植物转化

拟南芥Col-0植株用根癌土壤杆菌GV3101菌株携带两个启动子pkgwfs7质粒中的任何一个，使用标准的花浸渍法[48]。从转化植株中收集T1种子，将其镀在卡那霉素选择板上。存活的幼苗转移到土壤中，用于进一步分析。

GUS染色

在受精后和胚乳细胞化前的阶段采集硅油，在- 20°C的90%丙酮中固定，用GUS染色液(50 mM Na)真空浸润1分钟₂HPO_4，50mm NaH₂阿宝₄， pH 7.0, 2 mM铁氰化钾，2 mM亚铁氰化钾，2 mM EDTA, 1 mg/ml X-Gluc)， 37℃孵育过夜。用相同的染色液浸润幼苗、叶片和花序的新鲜组织。染色后，用70%乙醇清除组织，4℃保存。

显微镜

gus染色的胚珠和用于表型分析的胚珠安装在水合氯醛中，并用Boisnard-Lorig中描述的DIC光学进行分析et al。, (49]。使用数码相机拍摄图像，并使用Adobe Photoshop软件(Adobe Systems, Mountain View, CA)进行组装。

插入线特性

SALK T-DNA系SALK_121507和SALK_025090 [50]通过诺丁汉拟南芥库存中心(NASC)获得，并按照推荐使用LBb1.3引物和基因特异性引物507 F和R进行PCR分型;262f和R(附加文件3.表2)。

通过雄性和雌性配子的遗传传递

为了确定T-DNA的配子体传递效率(TE)，将野生型Col-0与SALK_121507或SALK_025090植株进行反向杂交。从单株中收集种子，筛选F1代是否存在T-DNA插入。TE通过每个配子(TE)_男性和TE_女)是根据Howden计算的et al。(51]。

花粉分析

用DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色野生型和T-DNA插入系的花粉;1 mg/ml)，并检查有无形态学差异。采用FDA(双醋酸荧光素)染色(10%丙酮/0.3 M甘露醇溶液)测定细胞活力。花粉萌发试验按Boavida和McCormick [52]。

鉴定拟南芥中aba调控/种子表达的双向启动子

我们执行了一个启动子独联体基于种子生物学各方面双向基因对具体实例的-元素生物信息学搜索[20.，21，30.，31，33，34，36]。我们确定了拟南芥基因组中蛋白质编码基因预测TSS(转录起始位点)之间100-600 bp的推定双向启动子，并进一步选择了含有多个(两个或更多)CACGTG基序的启动子。这就产生了一个包含70对基因的列表(表1)1)。G-box ABRE通常与其他基序、偶联元件(CE)结合，这些基序或偶联元件可以基于G-box或与G-box不同，也参与种子/ABA调控。因此我们搜索PLACE [45]，所有70个基因间区都集中于基于CCGAC核心的DREs和非来自ACGT核心的CE3s。这些元素在哪些地方也被确定在表1。

每个基因产物的细胞定位是根据使用TargetP工具和TAIR上可用的单个基因谱的预测来记录的。据预测，蛋白质存在于所有主要的细胞区室中，不同的基因对可能位于相同或不同的位置。然而，预计25%定位于质体，20%定位于膜/分泌系统，14%定位于线粒体，其余40%定位于细胞质和细胞核等其他成分。在功能或活性水平上，33%编码酶。先前的研究已经注意到人类基因组中酶/代谢和细胞器定位的富集[53，54]，种子发育过程自然伴随着广泛的代谢波动[33，55，56]。24%的基因可能直接参与基因表达调控、DNA/RNA结合和加工。已鉴定的一些基因已被证明参与胚胎/胚乳发育(At1g04630和At2g20490被鉴定为MEE4和EDA27，分别由Pagnussatet al。(57]和其他基因更明显地与某种形式的光调节有关(At4g21280，PsbQ亚基)[58]。有趣的是,MEE4与AtPOP5共享其双向启动子，在RNase P/MRP复合体中，AtPOP5被证明与参与雌性配子体发育的AtPP30物理相互作用[59]。的TORMOZ和极光基因(At5g16750和At2g25880)参与胚胎发育[60，61];SYN1(At5g05490)对减数分裂至关重要[62];SD3和DWF5是参与幼苗发育的膜蛋白[63，64]。其他基因也被实验证明对干旱或ABA有反应，如LEA4-1和OEP16-S (At1g32560和At4g16160;(33，65];额外的文件1:图S2B和附加文件1:图S1A)。使用AtGenExpress可视化工具检测基因对的共表达程度[38- - - - - -40这表明，虽然在某些情况下，基因表现出非常相似的表达模式，但也有一些情况下，两种基因的表达模式在时间和空间模式以及它们对各种压力的反应方面存在显著差异(附加文件)1:图S2)。在评估基因对产物是否在功能上直接关联时，可以考虑几个参数，例如基因对产物的共表达程度和亚细胞共定位。只有三个基因对的产物被预测为针对相同的细胞器(不包括细胞质预测)。At1g52230和At1g52220分别编码PSI亚基H和未知蛋白，根据AtGenExpress(附加文件)具有相同的表达模式1:图S2A)，并定位于质体的类囊体系统。此外，我们发现先前对叶绿体蛋白相互作用网络的分析[66]预测了这些蛋白质之间的相互作用，并证实了未知的At1g52220产物定位于类囊体，以及与PSI的D亚基的物理相互作用。

CE3偶联元件在拟南芥基因组中很少见[26，67]而类似ce3的元素已被描述[47，68]，这是首次报道在拟南芥中一致发现CE3元素。因此，我们选择将重点放在唯一一对同时包含DRE和CE3元件的基因上(在表中突出显示)1)。此外，这对At3g03150-At3g03160在编码区有SALK T-DNA插入线，可以对基因进行初步的功能分析。

At3g03150和At3g03160是从一个假定的双向启动子转录的，并编码新的植物特异性蛋白质

对启动子区域的分析显示，不同的orf (At3g03150和At3g03160)相隔518 bp，这表明两个基因可能共享同一个启动子，并且表达可能受到共同调控。该启动子包含几个ACGT元件，并且与dna中CE3 ABA响应元件100%匹配HVA1大麦促进剂[69];(图1一个)。

At3g03150的蛋白质序列没有熟悉的结构域或指示功能的基序。使用PSORT和TargetP程序的定位预测显示(分别为75%和91%的概率)线粒体定位。预测的裂解位点与共识位点一致，靶区富含丝氨酸。总的来说，120个氨基酸的蛋白质由近15%的丝氨酸和苏氨酸残基组成。超过37%是PEST残基，其中16%是单独的丝氨酸。高PEST含量表明蛋白质具有高周转率，表明蛋白质可能不稳定。该基因的结构特别引人注目，显示出一个超过1.2 kb的内含子的存在，并且第一个外显子离散地编码目标序列。为了验证At3g03150定位预测的有效性，我们构建了一个与该蛋白c端GFP融合的翻译蛋白来检测其线粒体定位。附加文件中的结果1图S3A证实了该蛋白在线粒体中的定位。

分化基因At3g03160的功能也未知，但包含三个跨膜结构域(TMHMM Server v2.;(46];额外的文件1(图S3B)，并且与来自复活植物的脱水诱导转录物同源Xerophyta云淡的(70)(图1C)。基因间启动子包含一个共识DRE(图2)1A). TargetP预测信号肽，因此该蛋白很可能是分泌途径的一部分。

此外，At3g03150仅在维管植物中有同源物，而At3g03160在卷柏和Physcomitrella金属盘(图1B, C)。即使在开花植物出现之前(以松树序列为代表)，在Genbank中鉴定的At3g03150和同源物之间的某些序列块也被强烈保存，这表明这些假定的活性位点在广泛的进化时间框架内被很好地保存了下来(图2)1B)。在整个胚胎植物(陆地植物)中，At3g03160同源物之间的氨基酸同源性水平是惊人的(图2)1C)。

这两个基因在第5号染色体上都有旁系物，似乎是先前发现的基因组复制的结果[71，72]。5号染色体上的相应区域保留了基因的不同排列，但有另外两个基因At5g17170和At5g17180介入1:图S3C)。这些干预基因是单拷贝的。At3g03160与At5g17190同源。在At5g17165的情况下，基因结构的模块化性质与编码靶向肽的第一个外显子保持不变。

对水稻和芸苔属植物基因组的BLAST分析表明，这两个基因的双向排列只保守于芸苔属植物拉伯。At3g03160/At5g17190和At3g03150/At5g17165对应的重复之前已经发生过芸苔属植物/拟南芥分裂和进一步的复制芸苔属植物生产了两个At3g03150和两个At3g03160平行(图1B, C)。

这两个基因具有相似的总体表达模式，但并不完全相同

一般的RT-PCR调查表明，这两个基因的转录空间模式相似(图2)2R)和杨et al。(73先前已经将这些基因列为共同表达的不同基因。然而，来自AtGenExpress的数据显示，At3g03150-At3g03160基因对之间存在更细微的差异。因此，利用基因间启动子在两个方向上与GUS报告基因进行转录融合，并详细监测其表达模式(图2)2)。在苗期，GUS在两个方向上的表达量都很高且普遍存在，但在老年幼苗中，At3g03160的表达似乎更多地集中在主根和侧根的尖端以及侧芽的萌发中。在成熟叶片中，At3g03150在脉管系统中表达明显，而At3g03160在水柱中表达非常明显。这两个基因在花蕾、开放花和果实组织中广泛表达，但在发育过程中存在显著差异。这两个基因在发育早期都在外轮表达，但随着花的成熟，At3g03160高度定位于脱落区和花梗。此外，在At3g03150取向中，在柱头组织以及花药和花粉中的表达要强得多。在At3g03150取向的球囊中也观察到非常强的GUS表达(图2)2)。

用RT-PCR检测At5g17165和At5g17190的表达模式。At5g17165产生了跨越两个外显子的转录本，其检测水平显著低于At3g03150，但在花组织中除外(附加文件)1:图S3D)。与At3g03160一样，At5g17190也在根和发育中的种子中高度表达1:图S3D)。

这些基因对压力的反应不同

基因间区的一致性和邻近ABRE和CE3元件的存在强烈提示At3g03150可能受到ABA的调控。此外，At3g03150的AtGenExpress谱也表明该基因在ABA实验中被上调。为了证实这一点，我们用RT-PCR检测了添加外源ABA的3周龄幼苗中At3g03150的表达。已知对ABA有反应的基因，KIN1和RD29作为阳性对照，图3.A表明At3g03150对ABA处理有反应。相比之下，我们没有检测到At3g03160对ABA处理有任何明显的反应，也没有使用标准的RT-PCR对脱水处理有任何反应。基于At3g03160与干旱诱导转录物的同源性，我们期望检测到At3g03160对脱水的一些反应[70]和启动子中存在假定的DRE元素(图2)1A)。因此，我们使用qRT-PCR重复分析(图2)3.B)两个基因归一化到18S内参基因。这显示了在At3g03150中已经看到的ABA反应，但也表明At3g03160的反应较弱。此外，这两个基因在脱水条件下均上调。

有关应激和激素治疗的数据也从AtGenExpress提取(图2)3.结果表明，At3g03150对ABA具有明显的响应性，而At3g03160对10 μM ABA的响应较弱。At3g03150对干旱处理3和6小时有反应，但At3g03160没有明显的反应，然而，At3g03160对种子吸胀的表达明显减少，这表明在这种情况下，该基因可能对水化反应消极。

这两种基因都在种子发育中发挥作用

获得了At3g03160的纯合子SALK T-DNA插入系(SALK_025090)并进行分析。基因分型和测序证实T-DNA插入位于编码序列起始密码子下游119bp处，RT-PCR显示该插入线中未表达At3g03160基因(图2)4A)。为了确保该基因的表达水平在At3g03160插入系中不受影响，我们也检测了相邻的发散型At5g03150的表达(图3)4A).表型分析显示，单株的结实率明显较低(表2)2,图4B).具体来说，未受精的胚珠和流产的种子的数量都增加了。

获得SALK T-DNA系并分析At3g03150。对SALK_121507进行基因分型和测序，证实该插入位于ATG密码子下游3bp处，这是唯一一条在该基因编码区有插入的T-DNA(图2)5A)。该株系不能作为纯合子繁殖，但杂合子株系分离后具有角蕊和胚珠表型(图2)5罪犯)。杂合子的角力比野生型短。58.21%的胚珠未受精(野生型为3.22%)。与野生型相比，晚期流产种子的比例也高于正常水平(6.97%)2)。数字5C表示杂合子植物的角蕊中有白色的大胚珠与正常的绿色胚珠相邻。清除样品的显微镜分析表明，这些胚珠甚至在真正的球形阶段之前就停止发育了(图2)5D)相邻胚珠发育到手杖期。合点端胚乳发育似乎也有缺陷。母体组织发育正常，胚胎和胚乳的异常不影响胚珠的生长和大小。在两个插入系中都存在未受精的胚珠，这促使人们对花粉进行分析，以确定这是否可能导致受精失败。SALK_025090纯合子和SALK_121507杂合子的花粉用DAPI染色评估颗粒形态，用FDA检测花粉活力，同时进行花粉萌发试验。结果表明，与野生型相比，SALK_025090的花粉是正常的，而SALK_121507的花粉是缺陷的，产生的花粉粒塌陷和不发芽的比例相对较高(30%)(图2)6)。这与基因的表达模式有关，因为在花粉中仅检测到At3g03150启动子的GUS表达(图3)2F, G)。

SALK_121507杂合子的自交在后代群体中产生的野生型与杂合子的比例一致为1:7 .7，表明它是一个配子体突变体。通过将杂合子作为花粉供体和受体与野生型植物杂交进一步验证了这一点。对野生型的互异交F1群体进行T-DNA插入的筛选表明，通过雄性和雌性(TE)的传播效率略有降低_男性= 70.5%_女= 88%，附加文件4表S3)。事实上，尽管通过两个配子体进行了显著的传播，但插入T-DNA的纯合子植株在自交后从未恢复，这表明这种突变导致合子致死。

基于生物信息学分析，双向启动子被认为是动植物基因组中的一种普遍现象，但目前文献中还没有针对相关基因的相关功能特征对双向启动子进行针对性分析的例子。在此，我们利用有限的文献样本对可能参与种子发育的双向启动子进行了有针对性的搜索，并详细描述了其中一个启动子及其相关基因对，包括初步的功能分析。这种方法可以补充传统的筛选方法，以寻找参与种子相关过程的基因[57，74- - - - - -77]和/或受激素和压力调节的基因[26我们的数据集也包含了一些在这些筛选中发现的基因[26，57]。双向启动子结构表明了表达的协调，事实上，迄今为止的许多生物信息学分析都包括基于大量可用转录组学数据的不同基因共同表达的证据。对70个双基序侧翼基因的AtGenExpress分析显示，一些基因相互镜像，另一些则非常不同(附加文件)1:图S1;额外的文件5:文件S1)。生物信息学分析倾向于关注氧化石墨烯的共表达甚至共同分类。有了大数据集，这是可以理解的，但如果专注于特定的子集，可能会梳理出蛋白质功能或表达模式不明显相似的其他情况。共表达并不一定意味着空间和时间表达的相似性，但也可能涉及对压力的协调反应，这种反应可能是组织不同的，甚至是细胞器不同的。这些协同反应可能通过启动子介导独联体元素。已经发现，通过积分已知独联体-共表达的元件增加了相关基因功能预测的可靠性[78]。虽然表中40%的基因1被预测为线粒体或质体定位，只有三种情况下，两个基因被预测定位在同一个细胞器上。在油质蛋白和PMSR基因的情况下，AtGenExpress的表达谱差异很大，油质蛋白是种子特异性的，而PMSR是普遍表达的1:图S1B)。此外，油蛋白是aba诱导的——通常是成熟种子中高度表达的基因的特征——而PMSR对氧化应激有反应，这是种子成熟的自然结果。36，56]。虽然At3g03150-At3g03160基因间区包含两个ABRE回语型CACGTG六聚体，但相邻的核苷酸在两个方向上都不同(这已被证明是结合特异性的重要决定因素;(24，25])， CE3元素是单向的。正如预期的那样，这种差异反映在表达模式和功能上，尽管两种基因似乎都影响种子发育的各个方面。

这种双向排列可能是一种特别有效的方式来调节对压力或环境刺激(如光或激素)的协调或互补反应。邦迪诺和瓦莱[12指出植物无根可能需要复杂的手段来协调基因表达对各种胁迫的反应。除了启动子协调对不同胁迫和发育信号的反应外，基因产物在不同细胞器上的定位反映了一种协调细胞内相互作用的手段。干旱、寒冷和盐度等胁迫具有共同和独特的信号通路，其中一些是aba依赖的[18]。在At3g03150-At3g03160的情况下，前者受到ABA的强烈调节，位于线粒体中，而后者对ABA的反应较弱，并且是膜结合的(尽管可能受到干旱的调节，基于DRE元件的存在和与a的同源性x云淡的干燥诱导转录本)[70]。以表中At1g07645为例1它也类似于干燥诱导的x云淡的干旱条件下拟南芥幼苗金属酶的表达不受影响[j]79]。张et al。(26搜索ABRE独联体-启动子中的元件来识别参与相关应激反应的基因，但没有包括启动子中潜在的双向性的任何选择。尽管如此，在本研究预测的前40个ABA/应激反应基因中，有4对基因和另一个基因(23%)也在我们的表中1另外还包括两对不同的基因(由于基因之间的距离稍大，并且ABRE搜索并不局限于CACGTC基序，因此这些基因不在我们的列表中)。

多个基因表达的协同调节或协调已经在其他安排和背景下被描述。曾经被认为是原核生物独有的操纵子结构，已经在植物的生物合成途径中被发现(由DellaPenna和O ' Conner总结)。80])在一个共同的生物合成途径中协调具有不同功能的基因的表达。双向启动子可能构成真核生物中协调表达的另一种手段[53]。

对跨越假定的双向启动子的基因对的分析也可能有助于揭示大量未知基因的功能，这些基因仍有待表征[53]。一种最初“未知”的基因，在上游200 bp的TSS上被鉴定出来，并与之分化帕金基因(决定帕金森病各方面的泛素E3连接酶)，PACRG帕金共调节基因;(81])，有一个共同的分子途径[82]。我们很感兴趣地发现，在At1g52230和At1g52220基因对的情况下，分别编码PSI亚基H和未知蛋白，在这里鉴定(表1)1)，先前叶绿体蛋白相互作用网络的构建预测了这些蛋白之间的相互作用，并证实了At1g52220与PSI亚基的物理相互作用[66]。

仍然有成千上万的基因没有明确的功能，这只能通过在实验室对单个基因在多个层面上的仔细实验检查来完成——基因序列、表达和功能。在拟南芥基因组中至少有40%的基因仍然没有确定的功能[83]和20%的线粒体蛋白质组由未知蛋白质组成，许多是植物特异性的[84]。对线粒体At3g13150和跨膜At3g03160等先前未被表征和植物特异性基因的分析有助于加速这些潜在的发现。虽然我们不知道编码蛋白的活动是什么，但我们已经描述了在种子发育方面共同参与的初步证据。

双向启动子是基因组序列中常见的启动子，但实验研究不足，特别是在植物中。以G-box启动子基序CACGTG为研究对象，我们对一组假定的双向启动子进行了定向鉴定，以确定参与种子发育的基因，并研究基因对对种子成熟重要条件(如干燥和aba调节)可能的协调反应。我们进一步描述了一对基因共享一个基因间区域，也包含一个CE3元件，并描述了初步的功能数据，涉及两个小的，以前未被描述的植物特异性蛋白在拟南芥种子发育和胁迫反应中。

作者要感谢莱斯特大学B/BASH生物信息学单位的其他成员Richard Badge和Matthew Blades。SD小组的工作得到了莱斯特大学、Leverhulme信托基金和BBSRC的支持。TP是莱斯特大学的理学硕士。分子遗传学项目学生。我们也感谢安娜贝尔·斯特吉斯(Annabel Sturgess)的工作，该工作由遗传学学会的暑期实习资助。

从属关系

1. 英国莱斯特大学生物系，莱斯特大学路，le17rh

   Sofia Kourmpetli, Thaleia Papageorgiou和sinacimad Drea

2. 英国莱斯特大学医学、生物科学和心理学院生物信息学和生物统计学分析支持中心(BBASH)

   凯特•李

3. 现地址:英国伦敦w1t4tp托特纳姆法院路97号网络大厦UCL Business PLC

   瑞秋Hemsley

4. 耶鲁大学分子、细胞与发育生物学系，康涅狄格州纽黑文，06520，美国

   帕斯卡尔Rossignol

相应的作者

对应到辛妮迪亚。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SK进行基因表达和T-DNA系鉴定;KL进行了基因间区鉴定的生物信息学工作;RH启动了T-DNA系和基因序列分析;PR进行蛋白定位实验;TP有助于RT-PCR基因表达和T-DNA细胞系分析;SK和SD设计了这项研究并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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