非更年期辣椒乙烯途径组分的研究

背景

更年期果实在成熟过程中表现出较高的乙烯和呼吸水平，但这些水平在非更年期果实中受到限制。尽管辣椒与特征鲜明的更年期番茄(茄科)属于同一科，但它是非更年期的，不会因乙烯而正常成熟，也不会在成熟绿色时收获。然而，当辣椒果实在所谓的“破碎期”期间或之后收获时，成熟过程通常是正常的。乙烯以及乙烯途径的组分如1-氨基环丙烷-羧酸(ACC)氧化酶(ACO)、ACC合成酶(ACS)和乙烯受体(ETR)是否参与辣椒的非更年期成熟尚未得到详细研究。因此，为了阐明辣椒成熟过程中乙烯途径组分的行为，需要进一步的分析。乙烯或乙烯感知抑制剂(如1-甲基环丙烯)对辣椒果实成熟和乙烯途径组分的影响也可能揭示乙烯在非更年期成熟中的作用。

结果

的几种同工异构体的表达华，ACS和ETR在辣椒成熟的过程中，除了一种，其他都是有限的华同种型(CaACO4)。在辣椒中，尽管ACO活性在开始成熟时有所增加，但ACS活性和ACC含量也较低。乙烯对辣椒的成熟没有促进作用，但1-甲基环丙烯处理延迟了破碎果实的成熟。一些华，ACS和ETR同种异构体在乙烯或1-甲基环丙烯处理下也有差异表达。

结论

ACS活性可能是辣椒乙烯途径中限制ACC含量的限速步骤。几种乙烯途径组分在成熟过程中以及乙烯或1-甲基氯丙烯处理后的差异表达表明，乙烯途径在非更年期辣椒中的调控可能与更年期番茄不同。在非更年期成熟过程中，也可能存在不依赖乙烯的途径，这可以通过上调CaACO4尽管受到乙烯暴露的负调控，但在成熟开始期间。然而，一定程度的乙烯感知可能仍然需要诱导成熟，特别是在破胶阶段。还提出了一个辣椒成熟的模型，以说明乙烯在这种非更年期果实中的可能作用。

水果可分为两种不同的成熟行为，更年期和非更年期类型。更年期水果，如香蕉和番茄，在成熟过程中通常会出现乙烯和呼吸激增，而非更年期水果，如葡萄和辣椒则不会[1- - - - - -3.]。乙烯激素也调节更年期果实的成熟速度，但其在非更年期成熟中的作用尚不清楚[4，5]。乙烯是由1-氨基环丙烷1-羧酸酯(ACC)前体在ACC氧化酶(ACO)的作用下产生的[1]。ACC是由ACC合成酶(ACS)从s -腺苷型蛋氨酸(SAM)合成的，SAM来源于氨基酸蛋氨酸[1]。更年期果实与非更年期果实产生乙烯能力的差异可能在于更年期果实中存在两种专门产生乙烯的系统[4，6]。

在果实发育过程中，在更年期和非更年期的果实中，乙烯都是在基础水平产生的，这一过程被称为系统1 [4，6]。当更年期的水果成熟时，另一个称为系统2的过程被启动，产生乙烯的爆发以促进成熟，而非更年期的水果被认为留在系统1中[4，6，7]。这两个系统的调控与不同的表达有关华和ACS异构体，特别是在番茄成熟期间首次出现的异构体[8，9]。至少有六个华已知在番茄中的同工异构体有九种ACS同种异构体，但只有一部分在成熟过程中表达，以调节两个系统[2，10]。例如,LeACS1A和LeACS6在系统1乙烯生产过程中表达，随后LeACS2和LeACS4以及LeACO1在系统2乙烯生产过程中被高度诱导。此外，系统1也是一个自我抑制系统，而系统2是一个自我刺激系统[1，4]。在更年期番茄中，系统1相关的同工异构体(如LeACS1A)受到高乙烯的负调控，而系统2相关的同工异构体(如LeACO1和LeACS2)受到积极规管[6，8]。考虑到这些华和ACS同种异构体是由乙烯的存在调节的，它的感知也似乎是更年期成熟的组成部分。的确,乙烯受体（ETRS)在成熟和乙烯处理过程中受到不同的调控[11]。6种番茄ETR亚型也可以分为两个亚家族，亚家族I (LeETR1、LeETR2、LeETR3)和亚家族II (LeETR4、LeETR5、LeETR6)，这两个亚家族之间的差异可能是由于它们对下游蛋白组成三重响应1 (CTR1)的亲和力[12，13]。然而，这些同工异构体和两种乙烯生产系统在非更年期成熟期间的调控仍然没有充分的文献记录，因此需要进一步的研究。

考虑到辣椒属于茄科，与番茄具有遗传相似性，在非更年期辣椒中发现相同的乙烯途径将有助于我们了解两种成熟类型中乙烯产生的差异。早期的微阵列研究报道了与乙烯信号相关的转录物在辣椒和番茄成熟过程中都被上调[14，15]。我们最近的蛋白质组学分析还发现，在辣椒成熟过程中，一种ACO蛋白亚型4 (CaACO4)增加(这与ACO活性和mRNA表达相对应)，表明这种非更年期果实的成熟可能涉及保守的乙烯途径。16]。然而，这一途径的其他组成部分，如其他华亚型,ACS和ETR辣椒中的同工异构体及其调控尚未得到很好的描述。此外，辣椒在采摘时表现出独特的成熟行为;只有在破碎期或更晚收割时才成熟，而在绿期收割时则不成熟[17]。这表明成熟调节因子可能只存在于破环期以后，以诱导非更年期辣椒的成熟，可能是在一个不依赖乙烯的途径中(因为成熟可以在没有高水平乙烯产生的情况下进行)。因此，有必要在收获后进行进一步的研究，利用乙烯或1-甲基环丙烯(1-MCP)处理绿期和破期辣椒，以表征乙烯途径和/或乙烯非依赖性途径在辣椒非更年期成熟中的可能参与。

在这项研究中，我们研究了华，ACS和ETR辣椒中的异构体(甜椒简历。利用实时荧光定量PCR (qPCR)在6个不同的成熟阶段对白羊座进行催熟(Green, G;断路器,B;断路器红色1,BR1;断路器红色2,BR2;浅红色，LR;DR . Deep Red)。在成熟期检测ACS活性和ACC含量，并与更年期对照。在辣椒成熟的G和B两个不同阶段分别用乙烯和1-MCP处理，分析采后贮藏对辣椒成熟、ACO和ACS活性以及ACC含量的影响。的表达式CaACO，民航总局和CaETR还研究了直接处理后的异构体。

CaACO、CaACS和CaETR异构体在辣椒成熟过程中有差异表达

在整个辣椒成熟过程中，转录本表达量最多华异构体有限，除了CaACO4(图1一个)。CaACO4相对表达式(由。规范化CaGAPdH)在成熟开始时显著增加(与G相比，B和BR1约为7至12倍)，在整个红色阶段(LR和DR)表达最少。尽管CaACO1和CaACO3转录本在DR期显著增加CaACO2在G期有所增加，但在辣椒成熟期的相对表达量仍然很低CaACO4。的相对转录表达量CaACO5和CaACO6也非常低，但在成熟过程中保持不变。

这两个CaACS1和CaACS2在成熟过程中相对于CaGAPdH(图1B).两种亚型的基因表达在成熟过程中也没有显著差异CaACS1在六个阶段中表达得更频繁CaACS2。

基因表达无明显变化ETR在成熟过程中测量同种异构体(图2)1C)比较他们的水平;CaETR4是辣椒成熟过程中表达的主要异构体。CaETR4从G期(~0.5相对表达)到BR1期(~2.3相对表达)和DR期(~4.5相对表达)略有增加，但无统计学意义。相比之下，的表达CaETR2，CaETR3和CaETR5在成熟期各阶段的平均相对表达量均低于2.0。

在辣椒成熟过程中，ACS活性和ACC含量受到限制

ACS活性的平均水平(图2)2A)在G和LR之间的任何阶段之间均无显著差异，但在DR阶段显著增加约两倍。在辣椒中，ACS的活性大约比两个更年期对照(成熟香蕉和番茄)低2 - 4倍。ACC含量的水平(图1)2B)仅从G期到LR和DR期显著增加。成熟香蕉和番茄的ACC含量大约是辣椒成熟过程中ACC平均含量的7倍。此外，本文报告的香蕉、番茄和辣椒的ACS活性和ACC含量水平与其他先前的报告一致[18- - - - - -20.]。

乙烯或1-MCP处理的效果

未经处理的b采收果实在28天后成熟正常并发展为DR，而未经处理的g采收果实成熟不完全(图2)3.A)。无论储存期间的采样时间如何，乙烯或1-MCP处理对成熟行为没有显著影响(图2)3.A，左)和彩色显影(图3.B，左)g收获的辣椒。在处理后28天(DAT)，与早期采样时间相比，所有处理和对照的g收获辣椒的可提取颜色都略有增加(图2)3.B，左)，但仍低于未经处理的B收获对照果实的全红色辣椒(20dat时约140个ASTA单位，图3.B,对吧)。这种可提取颜色的数量也被其他[17]，证实了我们目前的结果。相比之下，与乙烯或对照处理相比，1-MCP处理的b收获果实的成熟行为被证明是延迟的，特别是从3到20个DAT(明显的绿色/黑色组织，图3.右)。对照和乙烯处理的水果的可提取颜色在20个DAT达到140个ASTA单位，而1-MCP处理的水果直到28个DAT才达到140个ASTA单位3.B,对吧)。无论取样时间如何，乙烯处理对B果的可提取颜色没有显著影响，但1-MCP处理在12和20 DAT时显著降低了可提取颜色(图2)3.B)。就重量损失百分比而言，无论处理方式或收获时间如何，都没有显着差异，但在整个采样过程中，重量损失百分比明显增加(G和B处理的水果在28个DAT时重量损失高达30%)，这表明水果随着时间的推移而脱水(数据未显示)。

在我们之前的报道中，与其他成熟阶段相比，辣椒在B-BR1阶段的ACO活性显著增加[16]。事实上，在0 DAT时，未经处理的b采对照果实的ACO活性也显著高于未经处理的g采对照果实(图2)4)。此外，在0 DAT下，经乙烯处理的G果实的ACO活性并不显著高于对照，而1-MCP处理的果实的ACO活性则显著低于对照(图2)4A)。另一方面，经乙烯或1-MCP处理的b采收果实的ACO活性显著低于未处理的b采收对照果实。在整个贮藏过程中，无论处理方式如何，g采收果实的ACO活性在20 DAT时达到峰值，而b采收果实的ACO活性总体呈下降趋势(图2)4)。

g收获果实和b收获果实的ACS活性(图2)4无论取样时间和处理，B左和右均无显著差异，且显著低于香蕉阳性对照(水平见图)2A，数据未显示)。

在贮藏过程中，无论取样时间如何，g采收水果和b采收水果的ACC含量(图2)4C左和右)始终低于香蕉阳性对照(与图中水平相似)2B，数据未显示)。在0 DAT，与对照和乙烯处理的果实相比，1-MCP处理的g收获果实的ACC含量显著增加。此外，在28个DAT时，g收获的乙烯处理果实中ACC含量高于未处理的对照和未处理的对照反之亦然b采摘的水果。然而，与1- mcp处理的果实相比，G和B收获的辣椒的ACC水平(对照和乙烯处理的果实在28个DAT)没有显著差异。在任何其他数据点，对照组和治疗组之间没有观察到其他显著变化。

经乙烯或1-MCP直接处理(0 DAT)后CaACO、CaACS和CaETR亚型的差异表达

六个CaACO辣椒同种异构体在乙烯或1-MCP处理下表现出差异表达(图2)5A).当比较g收获水果的对照和乙烯处理样品时，CaACO1无统计学意义。然而，的相对表达CaACO2和CaACO4在乙烯处理的样品中，与相应的对照相比，显着降低(大约两倍)。此外，其他同工型的相对表达，如CaACO3，CaACO5和CaACO6乙烯处理与对照G果样品间无显著差异。相反，用1-MCP处理的g收获的果实，其含量显著降低CaACO2, CaACO3, CaACO4和CaACO5与对照组相比。在这些同工异构体中，CaACO5受1-MCP影响最大(表达量比对照组低约52倍)，而其他细胞只有约2至11倍的差异。然而，1-MCP治疗没有显著变化CaACO1或CaACO6g收获辣椒的表达。对于b收获的辣椒，乙烯处理后的样品的相对表达量显著高于CaACO1但是对于CaACO4比较各自的控制。乙烯对其表达无影响CaACO2，CaACO3, CaACO5和CaACO6而1-MCP对CaACO1，CaACO2，CaACO3,和CaACO6在b收获的水果中。另外，1-MCP处理对B果造成CaACO4显著低于对照组的三到五倍CaACO5(处理过的样品减少约33倍)。当比较跨越不同华在一个特定的处理/控制的同种异构体，CaACO4相对表达量最高。

对于孤立的人民航总局亚型(图5B)，两种亚型在处理后也表现出差异表达。CaACS1乙烯处理的G果(与未处理的G果对照相比，相对表达量减少了约2倍)和1- mcp处理的G和B收获的果实样品(与各自的对照相比，相对表达量减少了约7倍)的表达显著降低。无显著的相对表达差异CaACS2在处理过的样品和对照之间，果实在任何一个成熟阶段收获。

对于四个人CaETR亚型(图5C)，观察到不同的表达模式。首先，无论果实的成熟期和处理方式如何，都没有显著的变化CaETR2。然而，乙烯或1-MCP处理g收获的水果确实导致显著降低CaETR3相对表达量(2 ~ 4倍)，而两种处理在b收获的果实中未观察到显著差异。的相对表达CaETR41-MCP处理后，G期的产量显著提高，约为对照的两倍CaETR4与g收获的对照相比，相对表达量降低了约17倍。然而，在CaETR4乙烯处理与对照果实在B期的表达情况比较。然而，在收获b的水果中，CaETR4与对照相比，1- mcp处理的果实的相对表达量显著降低了约14倍。为CaETR5在G和B果实中，对照和乙烯处理样品的表达量无显著差异。然而，1-MCP处理引起了CaACO5与对照相比，两个成熟阶段的转录水平显著下降约三到五倍。总结和比较时不同ETR在一个特定的处理/控制的同种异构体，CaETR4仍然有最高的相对表达量(除了用1-MCP处理的g收获样品，它们的相对表达量相似CaETR4和CaETR2)。

辣椒成熟的分子机制还不完全清楚，特别是对非更年期行为。由于与模式果实番茄具有遗传相似性，辣椒可能成为阐明非更年期成熟分子调控的有用资源，特别是在乙烯途径方面。在本研究中，我们证明了在辣椒中，ACS活性和ACC含量是有限的华，ACS和ETR同种异构体在成熟和乙烯处理时受到不同的调控。此外，在成熟开始(B期)时，1-MCP处理显著延迟了成熟，并降低了几种同工异构体的表达，这表明乙烯感知可能在一定程度上需要非更年期果实成熟的发生。

辣椒成熟过程中限制速率的ACS活性影响其产物ACC的水平

ACS蛋白的存在似乎是辣椒乙烯途径的限速步骤。尽管B果的ACO活性高于其他成熟期(图2)4一个,16])，辣椒中的含量似乎与成熟期的更年期番茄相当[21，22];辣椒的ACS活性大约比作为阳性对照的更年期水果(番茄和香蕉，图2)低2 - 4倍2A).此外，…的模式CaACS1其表达与G - LR期间ACS活性的基础水平以及DR期间ACS活性的增加相吻合(图2)2A)可能是由于两者CaACS1和CaACS2同时表达(图1B)项较早的研究CaACS1还表明，它的表达量很少，但在辣椒的整个成熟阶段都是恒定的[23]，从而证实了我们目前的发现。此外，ACS在更年期果实中的活性已被证明在成熟开始时增加[24，25]，但其在辣椒中的含量在大部分成熟阶段保持不变(图2)2A)，表明ACS是这种非更年期果实的速率限制步骤。

ACC是由SAM在ACS作用下形成的产物，在辣椒中的含量也很低，与更年期的番茄和香蕉相比，在辣椒成熟过程中ACC的含量平均减少了7倍(图2)2B).辣椒中ACC含量的水平先前已被证明是有限的[26]以类似于其他非更年期水果(包括草莓)的方式[27]和葡萄[28]。在LR和DR阶段观察到的ACC水平显著增加进一步证实了这一点(图2)2B)可能是为了回应有限的ACO活动[16防止其转化为乙烯。此外，通过在G期(0 DAT)施用1-MCP显著降低ACO活性的量也增加了ACC含量(图2)4A和C，左)。这证实了ACC不仅在辣椒中是有限的，而且它也可能是持续需要的基础水平的乙烯生产。然而，在1-MCP处理后的B果中，虽然ACO活性降低，但ACC含量并没有直接增加，这可能是因为与g处理的果实相比，B处理的果实中ACO活性水平仍然很高(图2)4)。这表明，与本研究中作为对照的香蕉和番茄的1.5-3 nL/g FW/h乙烯产量相比，辣椒的乙烯产量较低(约为0.1 nL/g FW/h);数据未显示)可能是由于限制ACS活性造成的乙烯生产前体的缺乏。

系统1和系统2相关异构体在非更年期辣椒成熟中的差异表达

更年期番茄的成熟通常伴随着由系统2引起的乙烯产量的骤增。果实发育过程中系统1的负反馈机制向成熟果实成熟过程中系统2的正反馈机制的转变可以通过乙烯通路中特定同工异构体的差异表达来调节[j]。1]。例如,LeACS1A和LeACS6被认为是系统1成分，因为它们在未成熟果实中表达，并受到乙烯处理的负调控[8，9]。一旦水果成熟，LeACS2和LeACS4在成熟和乙烯处理过程中高度表达，表明它们是系统2相关的异构体[8，22]。在系统2期间，乙烯产量的急剧增加也得到了华亚型特别LeACO1，在某种程度上LeACO4［9，29，30.]。在成熟G期施用乙烯不仅显著提高了这些指标华亚型(22，31也诱导了…的表达ETR亚型,主要LeETR3，LeETR4和LeETR6［11]。然而，在非更年期水果中，两种乙烯生产系统的调控仍未完全描述，但系统1通常被认为在整个成熟过程中都在运作[4，7]。

事实上，非更年期辣椒中乙烯途径组分的表达和调控与更年期番茄有所不同。例如,CaACS2在成熟过程中表达不高(图1B)和乙烯处理后(图5B),而CaETR4和CaACO1对乙烯有反应，但在G或b收获的水果中分别只有一定程度的反应(图5A和C)。CaACO1在整个辣椒成熟过程中，表达也受到限制(图2)1A)证实了早先的报道[14，32]。的失败CaACO1和CaACS2在成熟和乙烯暴露时受到高度刺激，如在更年期番茄中，这可能表明缺乏系统2，因此与该系统相关的乙烯产生的爆发在非更年期水果中不可能被诱导。此外,CaACO4可以被认为是辣椒成熟开始(B-BR阶段)表达的主要异构体华isoform表现出类似水平的上调(图2)1A)，这与我们之前关于……的报告一致CaACO4半定量RT-PCR表达及辣椒成熟过程中ACO总体活性水平的研究[16]。有趣的是,CaACO4被乙烯负调控(图5A)特别是在b收获的果实中，这表明乙烯处理后的负调控可能导致与未经处理的对照果实相比，乙烯处理后的总体ACO活性较低(图2)4右)。其他同工异构体如CaACO2，CaACS1和CaETR3也在乙烯处理下下调，特别是在G期(图5)，这意味着系统1可能主要在这种非更年期水果成熟过程中运作，而不是系统2。

乙烯处理下几个转录本的下调也表明在辣椒成熟过程中可能有其他成熟调节因子控制它们的表达。这些成熟调节因子也可能只存在于B期，因为g收获的果实没有正常成熟，即使乙烯处理也不能将g收获的辣椒的ACO活性诱导到B期辣椒的水平(图2)4一个)。CaACO4这可能被认为是与System 1相关的亚型，在成熟开始时被上调(图2)1A)这表明它的上调可能以不依赖乙烯的方式与这些成熟调节因子密切相关。有两种途径，乙烯依赖途径和独立途径，被认为在更年期果实中起作用，但只有后一种途径可能在非更年期果实中保存以诱导成熟。6，33]。乙烯非依赖性途径的主要调控因子，特别是在非更年期水果中，目前尚不清楚勒MADS-RIN转录因子(RIN)被认为是调控因子之一[1，34]。研究表明，RIN甚至在番茄更年期乙烯产生之前就控制了番茄的成熟，这表明该转录因子可能位于乙烯途径的上游[33，35]。事实上，RIN已被证明可以直接或间接地调节几种乙烯途径组分的表达，包括LeACS2和LeACO1［1，36- - - - - -38]。有趣的是，这两种异构体同源物在辣椒中的表达，CaACS2和CaACO1，数量有限(图2)1)。此外,LeACO4可被认为是与系统2相关的异构体[22与系统1相关的CaACO4(图1A).这种差异可能是由于辣椒与番茄相比发生了大量的基因重排[39]，因此上游启动子调控在这些(可能还有其他)茄科成员之间不再相似。因此，需要进一步的研究来比较两种果实的异构体启动子区域，以及RIN或其他成熟调节因子在辣椒成熟的乙烯非依赖性途径中的可能参与。

在辣椒成熟过程中，特别是在成熟初期，乙烯感知可能是部分必需的

尽管在非更年期成熟中可能存在不依赖乙烯的途径，但我们的研究结果也强调，在某种程度上，辣椒成熟可能仍然需要乙烯感知。阻断乙烯感知的1-MCP处理将辣椒的成熟速度推迟了大约7天(图2)3.A和B)。1-MCP在其他非更年期水果(如葡萄和草莓)上的应用也被证明可以减缓某些成熟方面[28，40，41]。此外，亚家族II受体，CaETR4和CaETR5与对照组相比，1- mcp处理的样品中5C)，这可能因此影响其他下游乙烯途径组分的下调，如CaACS1，CaACO4和CaACO5(图5A, B).亚族IICaETR4也可以被认为是主要的ETR由于其在成熟过程中总体相对表达量较高，因此在辣椒中表达的同种异构体(图2)1C)有趣的是，在草莓中，FaETR2哪个是密切相关的LeETR4也是表达的主要异构体[12]。由于CaETR4和FaETR2都属于与CTR1蛋白结合较弱的II亚家族ETRs [13]，非更年期果实中乙烯的基础水平可能足以引起下游乙烯反应的相当大的变化，乙烯感知的抑制也可能严重影响成熟。

乙烯结合与控制番茄中乙烯受体的周转率有关[11]，而在非更年期的水果中，乙烯的基础水平可能需要维持一定的受体水平，从而维持正常成熟过程中的乙烯感知。我们的研究结果进一步证实了这一点，即乙烯处理不会导致任何显著的成熟变化(图2)4A, B)，以及所有四个测量值的表达式ETR与对照相比，暴露于乙烯后辣椒B期同种异构体也保持不变(图2)5这意味着可能没有更多的受体可以接受乙烯(因为它们可能是饱和的)，特别是在成熟开始时，因此对乙烯的感知和成熟反应没有影响。这进一步表明，成熟过程只需要一定水平的乙烯受体和感知，以及前面描述的不依赖乙烯的途径。因此，可能不需要高乙烯水平，节省的能量可以用于其他成熟相关的事件，如颜色和质地改性。然而，任何mRNA表达的变化(特别是对于ETRS)需要通过相应的蛋白表达试验来证实，因为翻译后调控已被证明会严格影响受体蛋白的丰度[11]。另外，考虑到辣椒对基因CcGH3,它已被证明会影响果实的成熟，是由乙烯和生长素共同调节的[42]，是否有可能出现类似的情况CaETR需要调查。

总的来说，非更年期辣椒产生的乙烯水平有限可能是由于限制速率的ACS活性限制了ACC的含量。此外，在辣椒中，乙烯相关基因的几种同工型存在差异表达，这表明在非更年期成熟过程中，乙烯的产生主要由系统1调控，而系统2缺失(如图所示)6)。在辣椒成熟过程中也可能存在不依赖乙烯的途径，但仍需要一定程度的乙烯感知来诱导非更年期果实成熟(图2)6)。

乙烯或1-MCP对辣椒成熟组织及G、B采收果实的处理

在不同的成熟阶段，制备了6个辣椒阶段(G、B、BR1、BR2、LR和DR)的组织，Aizat等人对此进行了描述。[qh]16]。对于乙烯和1-MCP处理，辣椒植株按照Aizat等人的方法生长。[qh]16]，从开花后27天开始每周测量果实长度，并于2013年1 - 2月(夏季)收获，果实达到G (43 DAA)或B (50 DAA)期。成熟阶段的平均长度约为85毫米(数据未显示)。每个阶段收获的水果用纳米纯净水清洗，在室温(22-23°C)下干燥约1小时，称重并随机分配到9个10升的塑料容器中，每个容器有隔膜(每个容器5个水果)。每个容器底部都有一条强力毛巾和大约100克Ca(OH)。₂作为文书主任₂洗涤器。每种处理分配3个容器:对照(未处理)、乙烯(终浓度100 μL/L, Coregas)或1-MCP(终浓度500 μL/L，与Moradinezhad等人的制备方法相同。43])。在RT下黑暗处理24小时后，水果在层流中晾晒30分钟，从容器中取出，分别放入铝箔托盘中。然后将果实与高锰酸钾和Ca(OH)一起在室温下黑暗保存。₂分别去除残余的乙烯和二氧化碳[43，44]。在处理后0(直接处理后)、3、12、20和28天(DAT)，对每个处理的3个果实称重、拍照并在液体氮中取样₂根据Aizat等人。[16保存在- 80°C，以待进一步分析。

cDNA和基因组DNA库存

对于不同的成熟阶段，所有cDNA砧木都按照Aizat等人的方法制备和描述[j]。16]。采用Karakousis和Langridge的方法，在没有扩增产物的情况下，从B果中提取基因组DNA进行基因组终点PCR [45]。辣椒组织(250 mg)用0.5 mL DNA提取缓冲液(pH 8.0)匀浆[100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 1% (w/v) n -月桂酰肌氨酸(sarcosyl)， 1% (w/v)聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)]。加入苯酚:氯仿:异戊醇溶液(25:24:1 v/v) (0.5 mL)，在4°C的轨道激振器上短暂旋转，混合15min。样品离心(6000 rpm, 15 min, 4°C)，上水溶液加入氯仿(每1.0样体积加入0.5体积)。然后将样品混合物旋转，离心(13000 rpm, 10 min, 4°C)，并再次重复氯仿提取。每1.0 mL的最终水样中加入90 μL的3m醋酸钠和900 μL的异丙醇。然后将样品在4°C的轨道振动机上混合10分钟，并在4°C下(13000 rpm, 10分钟)离心至颗粒。用70%乙醇(500 μL)洗涤DNA颗粒，风干后用30 μL无菌纳米纯水重悬。按照制造商的说明，使用NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA)对提取的基因组DNA进行定量。

根据Aizat等人的研究，在不同的处理条件下，分别从对照和处理辣椒组织中提取RNA。16]除了所有的离心步骤都是在13000 rpm下进行20分钟(4°C)，并且辣椒材料以及使用的缓冲液按比例缩小到1:10。根据Aizat等人的方法，对RNA进行定量、dna处理并合成cDNA。[16]。

端点PCR

所有终点PCR均使用附加文件中所示的引物进行1:表S1，根据Aizat et al. [16但做了一些修改。使用的模板是来自所有六个成熟阶段(G, B, BR1, BR2, LR和DR阶段的cDNA)的一个生物重复的cDNA混合物，所有引物对都在55°C下退火30秒，所有引物对都在72°C下延伸30秒。PCR产物转化为pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA)，并根据Aizat等人从至少四个独立菌落中测序。16]。系统发育分析使用分子进化遗传学分析(MEGA)程序版本5.05，使用Khoo等人所述的条件进行。[46]。

对于基因组终点PCR，除了基因组DNA模板，退火温度为55°C, 60°C或65°C，延伸步骤为1.5分钟，以考虑可能的内含子外，其余步骤均执行上述标准PCR程序。

辣椒中CaACO、CaACS和CaETR亚型的鉴定

番茄全长同种异构体序列华（LeACO1，LeACO2，LeACO3，LeACO4，LeACO5，LeACO6)，ACS（LeACS1A，LeACS1B，LeACS2，LeACS3，LeACS4，LeACS5，LeACS6，LeACS7，LeACS8),ETR（LeETR1，LeETR2，LeETR3，LeETR4，LeETR5，LeETR6)，首先从NCBI资料库([47]，于2013年1月21日访问)，然后使用NCBI数据库中的BLASTn搜索以及辣椒EST数据库([48]， 2013年1月21日查阅)，根据Aizat等人。[16]。附加文件中列出了加入号1表S1，相应的系统发育分析见附加文件2:图S1辣椒的同种异构体是根据番茄的同源物命名的，以便于参考和比较。为华同种异构体，只有辣椒的部分序列CaACO1源自Garcia-Pineda和Lozoya-Gloria [32和全长的CaACO4源自Aizat等人。[16]在NCBI数据库中可用，而所有六种可能的辣椒异构体都是使用辣椒EST数据库识别的，该数据库编码全长蛋白，除了CaACO5。为ACS亚型,只有CaACS1和CaACS2鉴定出编码全长蛋白和一个EST转录物(部分)密切匹配的片段LeACS3。为了辣椒ETR同种异构体中，未发现与任何番茄密切相关的NCBI基因ETR同种型。然而，使用辣椒EST数据库，一个EST与LeETR3(名为CaETR3)和两个与LeETR4和LeETR5(名为CaETR4和CaETR5(均为部分)。

为了进一步隔离任何其他可能的ACS和ETR简并引物的设计基于高保守区域的一致序列LeACS3，LeACS4，LeACS5，LeACS6，LeACS7和LeACS8为ACS和I亚族(LeETR1，LeETR2，LeETR3)，以及II亚族(LeETR4，LeETR5，LeETR6)受体ETR。在设计这些简并引物时，还考虑了现有辣椒EST序列。然而，没有检测到PCR产物(使用来自六个成熟阶段的cDNA作为模板)ACS简并引物，但两组引物ETRs产生了一个单波段(附加文件)3.:图S2)，测序后含有两种不同的产物。系统发育分析表明ETR亚族I引物产生的产物与LeETR2和LeETR3而ETR亚族II引物产生匹配的产物LeETR4和LeETR5(附加文件2:图S1)。其中三个序列与之前的三个EST序列相匹配(CaETR3，CaETR4和CaETR5)而是一个与之相关的序列LeETR2(因此命名CaETR2)与搜索的任何数据库中的任何注释都不匹配。

设计了辣椒各异构体的特异引物，并在终点PCR中运行。所有引物对都使用汇集的cDNA作为模板扩增单个PCR产物(附加文件)3.(图S2)，并且基于测序和单个qPCR熔融曲线对每个亚型特异性(数据未显示)。然而,CaACS3未表达，因为其引物能够扩增基因组DNA，但不能扩增其cDNA转录物(附加文件3.:图S2)。此外,ACS4引物来自Osorio等人。[14]甚至不能从基因组PCR中扩增任何产物(附加文件)3.:图S2)，没有其他资料CaACS4可在NCBI和EST数据库中找到。CaGAPdH引物来自Ogasawara等人。[49]并用于Aizat等人。[16也一样。

qPCR分析

按照Schaarschmidt等人的描述进行qPCR。[50]。简要地分析了每个成熟期和不同处理在0 DAT下的3个生物重复。所有cDNA原液用双重消毒的纳米纯净水1:10稀释，并在qPCR仪(ViiA™7,Life Technologies, USA)中运行。在每个10 μL qPCR反应中(每个样品3个技术重复)，将稀释后的cDNA模板(1.5 ng逆转录总RNA)和引物(正向和反向各5 pmol)与SYBR®Green试剂(iQ™supermix, BioRad, USA)混合。qPCR运行条件为95°C 15 s, 95°C 15 s和55°C 30 s 40个循环，然后95°C 15 s, 60°C 1 min, 95°C 15 s一步生成熔体曲线。阳性对照(使用1:1000稀释纯化质粒转化CaGAPdH以PCR产物为模板及相应引物)和无模板的阴性对照在所有qPCR板上运行。使用内置的ViiA™7 version 1.2软件(Applied Biosystems)评估每个反应的Ct值，并导入Microsoft Excel程序。相对基因表达分析按标准对比Ct法进行(2)^{——∆∆Ct})，在将感兴趣的基因归一化之前，将每个基因的Ct值校正为阳性对照CaGAPdH内生控制。此外，在所有三个技术重复中没有任何显著熔体曲线的样品被认为不表达特定的同种异构体，并设置相对表达值为0。

酶分析和颜色(ASTA)测定

ACS活性测定法改编自Kato等人。[51做了一些修改。简单地说，研磨组织[0.2 g FW]用1.8 mL冰冷的EPPS缓冲液A (0.1 M EPPS- koh pH 8.5, 10 mM 2-巯基乙醇，10 μM吡哆醛磷酸)均质。样品在4°C下以13000 rpm离心20分钟。在装有橡胶塞(9.5 mM亚密封)的试管(12 × 75 mM)中加入冰冷的EPPS缓冲液B (0.5 mL 0.1 M EPPS- koh pH 8.5, 0.2 mM SAM)的透明样品(0.5 mL)。所有反应混合物在30°C下孵育30分钟，然后按照Kato等人的方法测量ACS活性。[51]。根据Bulens等人的研究，同样制备了另一种含有峰值溶液(0.5 mL含0.01 μM ACC的EPPS缓冲液B)和0.5 mL样品(用上述EPPS缓冲液a提取)的反应，以计算测定的效率。[52]。ACC含量按照Tan等人的方法测定。[20.]。对于ACS活性和ACC含量的测定，商业成熟香蕉的一个生物复制的地面组织(根据CSIRO的第5阶段[53])和红番茄也同样作为阳性对照。ACO活性测定详见Aizat等人。[16]。

根据美国香料贸易协会(ASTA)的标准方法测定可提取颜色[54]。将1.5 g的组织在40°C下干燥24小时。称量干燥后的材料至约43 mg，在含有50 mL无水丙酮的瓶中孵育，并在黑暗中摇摇18小时。使用UV/VIS分光光度计SP 8001 (AdeLab Scientific, Thebarton, Australia)在460 nm波长处测定提取颜色的吸光度，并根据标准公式计算ASTA单位[54]。

统计分析

使用Genstat 14 (Hemel Hempstead, UK)进行统计。最小显著差异(LSD)P除非另有说明，否则采用方差分析(ANOVA)中的< 0.05来确定显著不同的方法。不同处理在每个采样时间的统计显著性采用Duncan 's多元极差检验P< 0.05(附加文件4表2)。

ACC:

1-aminocyclopropane 1-carboxylate

华:

ACC氧化酶

ACS:

ACC合酶

ETR:

乙烯受体

旅客:

绿色

B:

断路器

BR1:

断路器红色1

BR2:

断路器红2

LR:

光红

博士:

深红色。

我们要感谢Ismail A. Ismail、Wei-Chun Tu和Mamoru Okamoto对qPCR分析的有益讨论。我们也要感谢澳大利亚孟山都公司提供的辣椒种子。WMA由阿德莱德大学研究生费奖学金支持。

从属关系

1. 阿德莱德大学Waite研究所农业、食品和葡萄酒学院，格伦奥斯蒙德，SA, 5064，澳大利亚

   Wan M Aizat, Jason A Able和Amanda J Able

2. 弗林德斯大学生物科学学院，贝德福德公园，SA, 5042，澳大利亚

   James CR Stangoulis

相应的作者

对应到阿曼达·杰布尔。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

WMA进行了实验。WMA、JAA、JCRS和AJA参与了研究的设计和解释，所有作者阅读并批准了最终稿件。

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