粉丝师的繁殖策略限制喜马拉雅植物，Incarvillea Mairei.（Bignoniaceae）

背景

植物可能通过生殖策略和开花授粉系统的功能方面的专门化来适应高山生境。高寒生境降低了较高比例的高寒植物异花授粉的机会，在这些不利条件下，自花授粉可能是有利的。在此，我们研究了菊芋的交配系统和授粉Incarvillea Mairei.，通常在3000到4500米之间发现的多年生喜马拉雅草本植物。

结果

对3个自然居群进行了花的形态分析、植物与传粉者的相互作用观察和人工授粉实验。利用7个微卫星标记进行子代分析，评价了45个开放授粉家族的异交率和花粉供体有效数量。Incarvillea Mairei.展示了一套明显专业的花卉特征，耻辱是敏感的，立即触摸和关闭，重新开放允许第二次机会收到花粉。该物种是完全自兼容的，但根据父母分析，采用主要的outcrossing配合系统（t_米> 0.9)。结果坐果率低(26.3%)，结实率高(67.2%)，受传粉者限制。其主要有效传粉者为哈里奇斯Sp，就诊频率较低。

结论

花的特征，如敏感的柱头和花药尖，结合传粉者的行为，共同促进了一套独特的生殖适应，提高了异交的成功。开花寿命的延长和授粉效率的提高是补偿机制，以抵消授粉者访问频率低的影响。

在授粉可能不确定的压力或可变环境中，繁殖成功是许多种子植物谱系所面临的共同问题。高山环境就是这样一种生境，生长季节短，昆虫传粉者密度低，生长季节的恶劣天气不利于有效授粉和结实率[1- - - - - -4］．因此，具有自交机制的植物在这些恶劣的条件下可能更占优势，因为它们的繁殖不依赖传粉者[5- - - - - -7］．事实上，已经证明自交率随纬度和海拔的增加而增加[8- - - - - -10］．与此相反，Wirth等人[11]在更高的海拔地区揭示了较低的自行性率Eritrichium nanum(博拉基科)，一种在瑞士阿尔卑斯山的高山垫层植物，尽管这可能是由于生长季节开始时不利的天气条件。喜马拉雅-横断山脉地区拥有多种高山生境和大量有趣的高山植物[12]然而，很少有研究已经解决了这些植物的授粉生物学[13］．

粉丝器限制是一种在高山栖息地中繁体物种的常见问题，预计将在更高的高度上增加[14- - - - - -17］．但是，这些物种已经进化了许多生殖策略来应对不利的授粉条件[18］．例如，长时间的花卉长寿可以弥补低粉碎机的呼吁[1，17，19，20.］．花卉特质也大大影响授粉成功;例如，预计疝气花将减少自我施肥，允许更多的机会拓展[21，22］．个别物种可以使用这些策略的复杂变化来确保生殖成功[23- - - - - -26］．

属角蒿是一个主要分布在喜马拉雅地区的高海拔草本植物属，属Bignoniaceae，主要是热带木本植物的一个科。本属有18种，其中16种产于喜马拉雅-横断山脉地区[27］．角蒿物种具有专门的花卉结构，具有明显的钩蛇蛋白，通常包括Bilobed敏感的耻辱和花药附件[28，29］．早在1921年，Cutting [28)观察即成为这是一种在欧洲花园中栽培的喜马拉雅物种，推测敏感的柱头和花药附属物可能有助于异花授粉。最近，花药附属物即arguta，一种低海拔物种(1300-2700米)，已经被发现在触发其花粉分配机制中发挥作用[29］．此外,I. Sinensis.在中国北部的内蒙古，已经发展了一种延迟自花传粉策略，包括风驱动花冠脱落[30.］．高山种的繁殖策略角蒿由于有关喜马拉雅-横断山脉地区植物群生殖生物学的资料普遍缺乏，尚未发现该地区特有的植物。

在这里，我们研究了繁殖生物学I. Mairei.喜马拉雅山的一种草本植物，通常生长在海拔3000至4500米之间。我们研究的目的是确定繁殖策略I. Mairei.．具体来说，我们解决了以下问题:(1)什么是I. Mairei.？(2)果座和/或种子座有花粉限制吗?(3)利用微卫星标记分析该物种的异交率是多少?(4)与传粉者相关的花的特征如何影响其繁殖成功?

研究物种和地点

Incarvillea Mairei.主要生长在岩石、草坡和草地上(图)1一种）。开花发生在冰雪后的早春。这种植物是一种无茎多年生草本植物，两到五对传单。花序是结果，个体植物产生一到四朵花。鲜花是艳丽的，每个都具有一个由位于花药前方的两个裂片组成的大，敏感的柱塞（图1罪犯)。四雄蕊二dynamous和上花瓣，花药紧贴花柱(图1每个花药有两个在相反方向的硬尖，每个裂片上各有一个，与突起的垫部相连(图)1柱头的两个裂片在开花开始后开始开放(图1f）检测触摸刺激后立即关闭（图1G）。

从5月到8月，在云南西北部连续三年（2007-2009）中，在丽江县玉龙雪山进行了实地工作。本实地许许可证是从CAS昆明植物园昆明植物园获得的丽江高山植物园。I. Mairei.是研究地点的本地稀有物种，已知种群的频率非常低。(1)甘河坝(地理坐标27°03′N, 100°15′E;3190);(2)海利古(27°00′N, 100°11′E);3290);(3)郭美洛，“GML”(27°05′N, 100°13′E;这些种群相距5-20公里。2008年，在云南昆明植物园温室(25°08′42″N, 102°44′31″E)，对采集的果实分别播种，进行遗传后代分析。

耻辱的动作

在人口HLG开花季节开始之前，每天在整个开花季节中选择并观察三十个植物。记录了开花，花药裂开和打开和打开和闭合的持续时间。在人口HLG中测试了触摸和花粉对柱头闭合的单独影响。首先，选择的花朵被袋子排除昆虫。将两种处理应用于单独的开放式柱头组：（1）机械触摸（n = 30）;（2）手粉授粉（n = 30）。对于后一种处理，花粉温和地洒在柱头上，以防止由触摸引起的立即闭合。在每次治疗中，记录是关于是否发生耻辱闭合和重新开放，如果是的话，事件的时间。

花卉长寿

对GHB和GML种群的花寿命进行了记录。每个种群的20种不同植物的每一种花蕾都被标记，并被昆虫覆盖——在其他自然条件下不包括蚊帐。每隔一天记录一次花的存活情况，直到衰老发生。

传粉者观察及传粉实验

昆虫观察在峰值开花期间连续进行，从2007年和2008年的GHB和HLG中的10:00到15:00，2009年的GML中的3d。毕业后和SEMIR [31，柱头闭合被认为是花朵被拜访和授粉的标志。观察和拍摄传粉昆虫及其觅食行为。昆虫标本由中国科学院昆明植物研究所鉴定并保存。

2007年和2008年的HLG在HLG中进行了六种授粉治疗：（1）天然授粉：不被操纵花（n = 170）;（2）自主赤霉素：耙袋，在开花前除去花药（n = 20）;（3）自治自授粉：在整个开花期间袋装（n = 20）;（4）手自授粉：袋装花是用来自同一朵花粉的手花粉（n = 21）;（5）手交叉授粉：袋装花朵在开花前阉割，与从植物的花粉散，差不多（n = 28）;（6）补充授粉：鲜花暴露于天然授粉两天，然后用十字花粉（n = 25）授粉。为了进一步研究花粉限制对种子生产的影响，2008年在GML和GHB中进行了补充授粉（分别为N = 25）。在花卉萎缩后拆除所有袋子。经过两周后，果实的数量被记录，果实套装被估计为鲜花设置水果的比例。稍后收集成熟的水果，确定成熟种子和中止或未收割的胚珠的数量评估种子组。

基因采样、DNA提取和基因分型

每群人随机选择30人。取样叶组织并保存在硅胶中。从每种人群中，收获十五天然授粉的水果（每株植物一个水果），并从每个果实中收集成熟的种子。每种果实的种子在昆明植物园的温室中分开播种。每种家庭的10个幼苗被随机选择（150个个体/人口或整体450人）并用于遗传分析。

使用改性的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方案提取基因组DNA [32］．七对引物对：IM6，IM7，IM26，IM48，IM73，IM75和IM78用于基因型所有成人个体以及开放授粉的后代，使用I. Mairei.微卫星基因座[33］．正向引物用荧光染料(HEX, TAM或FAM)标记。PCR反应的反应体积为15 μl，每个引物0.6 μM, 7.5 μl 2 × Taq PCR Master Mix(天根;0.1U Taq聚合酶/μl, 0.5 mM dNTP每个，20 mM Tris-HCl (pH 8.3)， 100 mM KCl, 3 mM MgCl₂)．在以下条件下进行PCR扩增:94°C 3分钟,30-36周期94°C的30年代,primer-specific退火温度为30年代,1分钟和72°C,和最后一个扩展步骤8分钟的72°C。PCR反应扩增DNA进行基因Amp 9700热循环(美国应用生物系统公司,CA),PCR产物用ABI PRISM 3100全自动测序仪检测。采用Gene Mapper 3.2版本进行基因型分析。

统计分析

所有分析均在Windows的SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)中进行。所有参数估计均以平均值±SE(标准误差)值计算。采用双向方差分析比较了自然授粉和套袋条件下低海拔和高海拔群体的花寿命。以授粉处理、种群和年份为固定效应，采用方差分析方法对其坐果和结实率进行分析。由于坐果和结实率可能是相互关联的，因此这个MANOVA最初被用来控制I型误差[34］．显著的MANOVA之后是单变量方差分析，使用Bonferroni方法进行多重比较。治疗与人群或年份之间的相互作用均不显著(P > 0.05) in both cases, these interactions were removed from the final models.

计算的微卫星位点的统计摘要，包括每个位点的等位基因数(一个），观察和（H_O）预期的杂合性（H_E)，固定指数(F)和近交系系数(F_是)。使用FSTAT 2.9.3.2软件进行分析[35]及GenAlEx版本6.2 [36］．

使用MLTR版本3.4程序进行分析遗传数据[37］．在本分析中，我们利用后代的基因型，利用期望-最大化方法估计野外母本交配系统参数[37］．用多位点估计和平均单位点估计分别计算异交率t_米和t_年代)，基于Ritland的混合交配模型[38］．两个异交估计值的比较(t_米- - - - - -t_年代）通过与相关人员展开的结果，提供估计次数近亲繁殖，即近亲繁殖[39］．所有交配系统参数均在种群水平上进行估计。配对系统参数估计的标准误差(SE)和95%置信区间(CI)是从1000次bootstrap重复数据中获得的。引导的估计t_米与1相比，对应严格的交叉，和t_米- - - - - -t_年代估计结果为零。

这里呈现的相关父亲是每种水果中兄弟关系的分配过程。Sibship的分配可以估算花粉捐赠者及其后代的数量。亲子关系相关（C_p)与异交亲本的数量成反比C_p= 1 /N_EP.,在那里N_EP.是提供花粉的有效人数[39］．为了确认分配程序的可靠性，基于以下方法进行了两项相关父权估计:r_p估计额外的速度率固定在94％，F和r_tRITLAND的混合配合系统模型固定为零。2φ_FT.还估计了两种分析。

耻辱的动作

两个柱头裂片在花期开始后立即开放，一直开放到花衰老。接触反应的闭合速度很快，仅在6.86±3.06 s (SE, N = 30)内完成，而花粉沉积反应的闭合需要0.5-1.5 h (N = 30)。当花粉粒数较低时，多数柱头(>80%)在8-15 h后重新开放，而未接触花粉的柱头在19.15±2.28 min后重新开放(SE, N = 30)。在自然条件下，HLG群体中只有26% (N = 100)的柱头是闭合的，而人工授粉的花的柱头大部分(92.5%，N = 80)在花的剩余寿命中是闭合的。为了排除传粉者而装袋的花是完整的，没有释放花粉，双叶柱头保持开放直到花凋谢。

花卉长寿

花分器持续了8.25±1.69天（范围从6到12）（SE，n = 40）。在天然条件下，GHB开花的持续时间为7.40±1.23和9.45±1.36（SE，n = 20）天，分别在GML天然和袋装花朵中绽放9.10±1.68和13.5±1.93（SE，N = 20) days, respectively. The effects of altitude and treatment on floral longevity were significant (F= 66.634,P< 0.001,F = 83.845,P分别为< 0.001)。

传粉者的观察

在三个研究地点观察到少量昆虫。在高海拔GML种群中，仅观察到3只大黄蜂蜂王访花I. Mairei.．大黄蜂访问的频率太低，无法允许可靠的量化。耻辱闭合似乎是一种迹象，鲜花已被访问和授粉[31］．在100朵花中，只有23、26和27朵花的柱头在GML、HLG和GHB中被封闭。我们记录了哈里奇斯发现蜜蜂在树上觅食和授粉I. Mairei.在低海拔GHB和HLG种群中，他们是有效访花者，平均访花次数分别为0.007次/花/小时和0.005次/花/小时。授粉过程的具体步骤如下:首先，黑尾蜂沿着花冠管前部的两条有标记的脊线进入花，并与柱头裂片接触。这导致花粉粒从传粉者身体的背面被移走(图)1H)，柱头随后立即闭合。更准确地说，当蜜蜂进入花时，它的背部压住了外部花药裂片上的一对“触发”附属物，使花药裂片紧密闭合，阻止花粉释放。随后，对不同的花药附属物施加反向压力，导致内部的花药裂片打开，将花粉排出到蜜蜂的背表面(图)1当蜜蜂离开花时，这一顺序反过来发生，导致外部的花药裂片打开并脱落额外的花粉粒(图1)1j）。耻辱仍然关闭（图1K)蜜蜂离开后。

繁殖系统

通过MANOVA分析，我们发现授粉处理对雌蜂的生殖成功有显著影响(即坐果和结实率;表格1)．天然水果套装（24.38％）明显低于用于手工自信，交叉和花粉补充治疗的水果套装（F= 751.5, P < 0.001)(表1)，后三种处理本身没有观察到显著差异(图2A).然而，自然授粉的结实率与人工授粉的结实率没有显著差异(F = 0.591,P=(图0.622)2B,表1)．这些结果表明I. Mairei.是高度self-compatible。然而，在自主无融合生殖和自合生殖处理中，两年内都没有开花结果(N = 20)。因此，该物种不能自主无融合和自花授粉，完全依赖传粉者的雌性繁殖成功。

花粉限制

MANOVA和单因素方差分析显示，授粉处理和年份对花粉限制和繁殖产量均有显著影响1和图2)．在2007年和2008年，与自然授粉相比，补充授粉大大提高了坐果率(F= 185.07,P< 0.001)(图2A)，虽然在HLG中，自然授粉和补充授粉的结实率没有显著差异(F = 0.11,P=(图0.733)2B)。接下来，比较了2008年3个群体自然授粉和补充授粉的果集和结实率(表)2和图3.)．在所有群体中，自然授粉的平均坐果率为26.3%(24% ~ 28%)，而补充授粉显著提高了坐果率，分别是自然授粉的83.8%和3.2倍(F= 918.6,P< 0.001)(图3.一种）。然而，平均天然授粉花的种子百分比为高，平均值67.2％，距离62.1％至70％，虽然人口无显着差异（F= 1.152,P = 0.323). The mean percentage seed set was even higher for supplementarily pollinated flowers than for naturally pollinated flowers among three populations, but the difference was not statistically significant (F= 1.448,P = 0.485) (Figure3.B).不同海拔的居群间果实和种子结实率均无显著差异(F= 7.207,P= 0.063,F= 2.486,P= 0.0882和图3.)．

成虫遗传多样性

7个微卫星位点产生56个等位基因，每个位点有效等位基因数为8个。观察到的杂合度(H_O）和预期的杂合子（H_E)的变异范围分别为0.267 ~ 0.967和0.242 ~ 0.8813.)．人口水平的固定索引（F）范围为-0.119至0.115，而近亲繁殖系数（f_是)的变异范围为−0.502 ~ 0.225。遗传多样性在研究群体之间没有显著差异[平均值]H_O（SE）= 0.669（0.060）;意思H_E0.662(0.047)]。

outcrossing率和花粉供体组成

在三个自然人中，交叉率（t_米)的范围为0.970 ~ 0.988(表4)．由双亲近交引起的表观自交的最小估计值(t_米-t_年代）45母植物中的平均值为0.058至0.180，平均值为0.128±0.136。这t_米-t_年代值显著偏离零(在95%置信区间)，表明双亲本近亲繁殖的数量显著(表4)．

在Ritland混合交配模型中，GML的父系相关系数从0.488±0.086变化到HLG的0.999±0.164，而在TWOGENER中，GML的父系相关系数从0.432±0.051变化到HLG的0.602±0.0265)．根据Ritland混合交配模型，HLG的有效花粉供体数为1.001 ~ 2.049，而TWOGENER模型，HLG的有效花粉供体数为1.661 ~ 2.3145)．

Self-compatiblity

在热带的Bignoniaceae中，大多数物种是乔木、藤本植物和灌木，而只有三个组采用了草本习性。由于这些群体主要分布在喜马拉雅山脉的高海拔地区(角蒿)和南美洲的安第斯山脉(Argylia，Tourrettia) [40，似乎这两个地区的草本植物习性的进化是对共同环境的响应而独立进化的。电流分布角蒿很大程度上是由喜马拉雅山脉的隆起形成的[27］．迄今为止，在Bignoniaceae的大约800个物种中，只有38个物种进行了生殖生物学研究，其中31个物种被发现自交不亲和[31，41，42］．我们的研究表明I. Mairei.是完全自兼容的，这结果与最近发现的研究结果一致（I. Sinensis.和即arguta）两者都是自相互态的[29，30.］．由于这些物种从自交不亲和到自交亲和性的转变，确定它们的交配系统将是很有意义的Argylia和Tourrettia另外两种草本属于贝加马伊的两只高原Andean。

传粉者限制和花的寿命

共有共识，即高山植物面临严重的传染案限制[2]，从而减少异花传粉的可能性[3.］．作为回应，这些植物通常通过增加自交亲和性、无融合生殖和营养生殖来确保繁殖成功[43，44］．另一方面，与专性异交种相比，自交亲和种的花粉限制较小[45］．在这种情况下，传粉者的不可预测性可能会导致对自交和异交授粉策略结合能力的选择[7］．在本研究中，果套I. Mairei.暴露于天然授粉的花朵（20-30％）远低于接受补充花粉（> 80％）的花朵，以及自相容植物的平均值（72.5％）[46］．然而，花朵坐果和种子坐果在开放授粉和人工授粉之间没有显著差异(图3.B).这表明自然种群的坐果失败主要是由于传粉者的缺席，而不是访花期间花粉沉积不足。

增加高山植物的花寿命是一种进化策略，用于克服稀疏或不可预测的传粉者服务，以便接收异交花粉[1，17，25，47］．I. Mairei.高山生境(海拔3000 ~ 4500 m)是研究区开花最早的植物之一，5月初融雪后不久即开始开花，持续到6月下旬。相比之下,I. Mairei.，其他两个被研究的物种有不同的栖息地。即arguta在干燥和热的山谷中生长（1300-2700米），同时I. Sinensis.在中国北部发生，在低海拔（1100-1300米），其花持续1-3天和5-9小时，花卉长寿I. Mairei.非常长，在自然条件下的7至12天。此外，粉丝器排除大大增加了花卉长寿I. Mairei.．最近的一项研究表明，粉尘者的曝光时间较长的花卉有更多的机会，比通过实验缩短的曝光时间的鲜花获得更高的生殖成功[19］．在I. Mairei.，大型五颜六色花的寿命的敏感剂响应灵活性可能适应不可预测的授粉条件。此外,we found that the number of flowers decreases with increasing altitudes, in the higher altitude population (GML), most individual plants have single flower, which may tend to reduce geitonogamous selfing, i.e., transfer of pollen between flowers of the same plant.

促进异交的花的特征

Incarvillea Mairei.根据父母分析采用主要的outcrossing配合系统（t_米> 0.9)。我们的研究表明，在所有取样的高海拔种群中，异交率都很高。似乎传粉者限制在抑制种子结实率方面没有多大作用I. Mairei.，因为与自然授粉相比，补充授粉并不能提高单个花的种子产量。此外，这些结果表明，每个种子科几乎都是由1或2次传粉者访问的结果(1次在HLG;结果表明，访花率极低，但授粉效率高。这些结果表明I. Mairei.是一种“全有或全无”的现象，这个物种可能已经进化出了花的特征，最大限度地适应单一授粉者访问，以应对低密度的授粉者和随机授粉。

除了长寿，花生物学的其他特征I. Mairei.似乎非常适合对抗花粉限制。在Bignoniaceae中，永久性柱形封闭尤其是常见的，特别是由于自我不相容的花粉沉积而导致[48，49］．的耻辱I. Mairei.对传粉者的触摸很敏感柱头的闭合I. Mairei.(6.86±3.06 s)Jacaranda Rugosa.［49),坎波斯·拉迪斯［48触碰后柱头通常闭合>40s)。耻辱关闭在I. Mairei.通常在传粉者访问花朵后迅速发生，并在传粉者离开前保持完全闭合。因此，羞耻感的闭合在I. Mairei.可以有效地防止自我授粉，这是我们对授粉过程的田间观察和高倒置率的支持。此外，耻辱闭合降低了耻辱的花粉损失[50这可能会导致在喜马拉雅夏季常见的降雨事件。

的耻辱I. Mairei.如果接受花粉不足，无论是自我还是交叉花粉如何重新打开。如FETSCHER所提出的[51，重新揭开了耻辱的面纱I. Mairei.可以有第二次机会接收花粉，使额外的胚珠受精。这一功能在种子生产受到限制的群体中尤其适用，即使经过两次访问(如GHB和GML)。

在觅食阶段的探访期间，其独特的花粉载荷对花粉载荷的花粉分配效率促进。在I. Mairei.，每个花药有一个刺，以一个直角向花药表面，向下进入花冠筒。结果表明，传粉者刺激对生花药的花药刺激引起花药开裂和花粉扩散。花粉与传粉昆虫的相互作用将大大减少花粉的浪费，并增强雄性的功能[29］．另一方面，由于传粉者的访问率低，该物种通过雄性功能的植物适合度似乎受到限制。

植物的花生物学I. Mairei.包括一套机制，似乎促进高授粉效率，尽管传粉者的可用性低。敏感柱头的移动、花药尖的移动和传粉者的行为是一个非常有效的繁殖系统，并使其有可能确保在严酷的高山环境中成功繁殖。认识这一机制对我们理解喜马拉雅-横断山脉地区高山植物的适应、物种形成和多样性具有重要意义。

作者在此感谢中国科学院重点研究计划(NO. 5)的资助。国家重点基础研究发展计划(NO. KJZD-EW-L07);基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO. 2014CB954100);31200289)。我们感谢昆明植物研究所的拉尔森-拉宾博士和南佐治亚大学的沃尔夫教授阅读早期版本。在此，我们也要感谢张士生博士和中国科学院昆虫鉴定研究所朱朝东教授的现场帮助。

作者笔记

从属关系

1. 中国科学院昆明植物研究所东亚植物多样性与生物地理学重点实验室，昆明

   艾红莲，周伟，王红，李德柱

2. 中国科学院昆明植物研究所野生植物种质资源库植物种质与基因组学中心，昆明

   周伟，李德柱

3. 中国科学院昆明植物研究所丽江高山植物园，中国丽江

   库恩徐

相应的作者

对应于洪王或Dezhu李．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

HA, HW和DL设计了本研究。HA进行了实验。WZ和HA分析了数据。WZ和KX提供试剂/材料/分析工具。手稿由HA, WZ, HW和DL撰写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

艾洪莲、周伟对这项工作的贡献是一样的。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0.）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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