乙烯与生长素的相互作用对葡萄病害的防治至关重要。葡萄l .)浆果成熟

背景

果实发育由植物激素控制，但激素相互作用在果实成熟过程中的作用尚不清楚。乙烯和生长素吲哚-3-乙酸(IAA)之间的相互作用在成熟过程中可能是至关重要的，因为这两种激素已被证明与一系列不同果实的成熟控制有关。

结果

小道消息(葡萄L.)色氨酸氨基转移酶相关(TAR)和YUCCA家族的同源物，在生长素生物合成的唯一特征途径中起作用，被鉴定和几个表达焦油基因被证明是通过在成熟前施用乙烯释放化合物乙烯利而诱导的。的感应焦油表达伴随IAA和IAA- asp浓度的增加，表明生长素生物合成和结合的上调。暴露的足底,用乙烯生物合成抑制剂氨基乙氧乙烯基甘氨酸对果实进行预熟后，IAA和IAA- asp浓度降低。因此，在乙烯处理过的浆果中观察到的成熟起始延迟可能是由生长素浓度增加介导的间接乙烯效应。在浆果发育过程中，表达三种焦油基因和一个丝兰基因在成熟起始和/或成熟过程中表达上调。生长素生物合成基因表达的增加是由乙烯生物合成基因1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的高表达引起的。

结论

在葡萄果实中，参与生长素生物合成两步途径的两个基因家族成员都表达了，这表明IAA是通过TAR和YUCCA蛋白在果实发育过程中的联合作用产生的。的感应焦油应用乙烯利的表达和生长素和乙烯生物合成基因的发育表达模式表明，在成熟开始前乙烯浓度的升高可能导致IAA的产量增加，这表明这种生长素及其结合物在葡萄果实成熟过程中具有复杂的作用。

植物的协调生长和发育依赖于广泛的控制系统，包括各种已知植物激素和糖等其他信号化合物之间相互作用的复杂网络[1- - - - - -5］．果实成熟是一个发育控制过程的例子，它依赖于一系列植物激素，但我们对这些不同类型的激素在成熟过程中的分子相互作用的知识仍然很初级(由[6，7])。研究果实中激素相互作用的一个有趣的目标是气体激素乙烯与生长素类激素的相互作用，其中吲哚-3-乙酸(IAA)是最丰富的成员。乙烯在越冬果实成熟过程中起着至关重要的作用，越冬果实在成熟初期乙烯产量和呼吸活动急剧增加(由[8])，但其与非变暖期果实成熟的相关性仍不清楚，非变暖期果实在乙烯形成和呼吸过程中缺乏与成熟相关的剧烈变化。6])。乙烯浓度和呼吸速率在非更年期草莓(草莓属ananassa杜赫)(9]，但这两个事件都发生在过渡到成熟阶段之后。乙烯浓度在非成熟期果实开始成熟前出现小峰值的唯一报道来自于荔枝比如说。［10和葡萄(葡萄l .) [11- - - - - -13］．在葡萄中，乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因的发育表达谱进一步证明了乙烯的作用，它们描述了葡萄在成熟前的表达ACS［14的转录物积累峰值华［12，14成熟前的一小段时间(在葡萄果实中称为“变种”)。

有趣的是，与已知的更年期果实相比，用乙烯释放化合物乙烯利处理早熟葡萄浆果已被证明可以延迟成熟[15- - - - - -17］．乙醚诱导的糖和花青素积累开始的延迟类似于预版本应用生长素引起的成熟延迟效应[18- - - - - -23]，这已成为影响果实成熟的另一个重要因素，无论是在成熟期的果实还是在非成熟期的果实(由[6，7])。在更年期的果实中，如番茄(茄属植物lycopersicum机。)24，25，或香蕉(穆萨paradisiacal .) [26在草莓等非更年期水果中[27，28和葡萄[29- - - - - -32成熟前和成熟过程中IAA的浓度普遍较低。在上述所有四种果实中，以及在许多其他的更年期和非更年期果实中，在果实发育的前成熟阶段使用天然或合成生长素通常被发现会导致成熟延迟(由[6])，因此生长素被广泛视为成熟抑制剂[24，26，29，33］．相比之下，据报道iaa -酰胺缀合物在成熟的香蕉中积累[26),甜瓜(Cucumis梅洛l .) [34和草莓[27］．在葡萄浆果中更详细的研究表明，与IAA降解有关的IAA- asp -酰胺共轭物的浓度[35]，由aa -酰胺合成酶(Gretchen Hagen (GH3)蛋白)作用形成[36]，在不同版本中急剧增加，并在整个成熟阶段保持高浓度[29］．在番茄中也发现了类似的IAA-Asp积累模式，这表明生长素在果实成熟过程中发挥了更复杂的作用，需要进一步研究[29］．

生长素和乙烯之间的相互作用是应用生长素诱导乙烯生物合成，这是由Morgan和Hall首先描述的[37他报告说，2,4-二氯苯氧乙酸的应用导致了棉花植株乙烯产量的增加。后来发现，外源性生长素诱导的转录ACS绿豆的基因(豇豆属辐射动物(l)Wilczek) [38］．类似的归纳ACS表达式，在某些情况下也是华这种表达已经在许多其他植物中得到证实，包括拟南芥（拟南芥l .) [39- - - - - -41]，是一种更年期和非更年期的水果，例如苹果(马吕斯有明显Borkh。)42),梨(Pyrus普通的l .) [43),桃子(碧桃(l)蟠桃(44和葡萄[45］．有报道称，生长素处理可以至少部分加速某些更年期果实的成熟过程[46- - - - - -50]因此可以解释为通过乙烯生物合成诱导介导的间接生长素效应[42，44，48］．

乙烯对生长素生物合成的互补作用长期以来一直是难以捉摸的，因为人们对IAA生物合成的分子机制还不完全了解。乙烯作用对IAA生物合成、感知、信号和运输的依赖已在使用拟南芥突变体和生长素的测定[51，52］．此外，据报道，乙烯处理可诱导编码邻氨基苯甲酸合酶、色氨酸合酶亚基以及GH3蛋白的基因[53，54］．然而，直到最近才阐明了IAA的主要生物合成途径拟南芥揭示了乙烯对生长素生物合成的调控作用以及乙烯对生长素生产的依赖性。三项独立研究[55- - - - - -57]提供的证据表明IAA是通过一个简单的两步途径合成的，其中拟南芥1色氨酸氨基转移酶/色氨酸氨基转移酶相关(TAA1/TAR)蛋白[58，59]将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸，然后由YUCCA (YUC)家族的含黄素单加氧酶转化为IAA [60］．在玉米中也证实了TAR/YUC通路的存在(玉米L.)凡对正常的营养和生殖发育是必要的[61］．的表达TAA1还有一些焦油在根和顶端钩处的S拟南芥乙烯处理可以诱导幼苗生长，限制其表达TAA1 /焦油导致局部IAA产生的基因被认为是组织特异性乙烯效应的基础[58］．

以上介绍表明，生长素和乙烯参与了果实成熟过程，它们的应用可以改变果实成熟的进程。在本研究中，证据表明在葡萄果实发育过程中，生长素生物合成的TAR/YUC通路至少部分受乙烯调控。植物生长素的测定和基因表达研究表明，植物生长素处理后的葡萄成熟延迟可能是由预成熟果实中生长素浓度的增加介导的。在浆果发育过程中，乙烯生物合成基因表达的增加先于在成熟开始前后生长素生物合成和结合基因转录水平的提高，表明乙烯/生长素相互作用在控制浆果成熟过程中的作用。

变种前乙烯利处理葡萄果实导致成熟延迟和生长素浓度增加

在葡萄果实中，预版本施用乙烯释放化合物乙烯利可延缓果实成熟的开始。15- - - - - -17和生长素[18- - - - - -23］．乙烯利和生长素对葡萄成熟行为的类似影响，结合越来越多的证据表明乙烯和IAA之间的复杂相互作用(由[62，63)表明这两种植物激素在控制成熟方面存在联系。为了研究乙烯/生长素在葡萄果实成熟过程中相互作用的可能性，在连续两个季节用乙烯利或对照溶液处理预设版本的设拉子浆果。在2011年的试验中，变异前20天(变异定义为取样日期紧随着用折射计测量的总可溶性固形物(TSS)显著增加)对浆果的乙烯利处理将成熟开始推迟了13天(对照浆果的变异是2011年2月3日)。与对照组相比，喷洒后31至54天，喷洒后67天，ethrel处理的浆果TSS值显著降低(dps)1A)，浆果重量也在37至54 dps之间减少(图1B)。

2012年，对照浆果的变异(2012年1月24日)比预期提前一周发生，这使得在该季节连续施用的两种处理接近变异日期(变异前的8天和1天)。在之前的研究中，在一周内的ethrell处理对糖积累和浆果重量没有影响[15］．因此，在2012年的试验中，埃思利的催熟延迟效应没有2011年观察到的那么明显。用ethrell处理的浆果只延迟了7天。然而，从第一次喷雾(dpis)后15天起，与对照浆果相比，ethrel处理浆果的TSS值显著降低(图1)1C)，当ethrell处理的浆果明显较轻时，观察到的浆果重量差异为22和29 dpis(图1D)。

对两项试验中的浆果样品进行时间序列分析，以确定乙烯利处理是否导致IAA及其最丰富的氨基酸共轭物(IAA- asp]的浓度发生变化。29］．在2011年的试验中，这是在喷雾后3-48小时(hps)完成的，在2012年的试验中，这一试验被延长，以测试从最初喷雾后1小时(hpis)到经过ethrelr处理的浆果版本的时间点上生长素浓度的差异。

与每个时间点的对照果实相比，2011年实验中的IAA和IAA- asp浓度仅与最后一个分析时间点(48小时)的ethrele处理浆果有显著差异，其中IAA浓度增加了约10倍(图2A)和IAA-Asp浓度约为2倍(图2B)对埃瑟利的回应。在2012年的样品中，当对照浆果经历变异(约3倍)时，ethrell处理的浆果中IAA浓度显著高于对照浆果(图2C)和IAA-Asp的浓度在对照浆果的变种中增加了约两倍24 hpi(图2D)。

所提供的数据提供了证据，以ethrel介导的增加积累的自由和共轭IAA在前版本葡萄浆果。生长素浓度的持续升高直到过渡到成熟阶段提出了一个问题，即ethrell诱导的成熟延迟是否可能是版本前浆果中高于正常生长素浓度的结果。

乙烯利可上调浆果中IAA、IAA- asp和葡萄生长素生物合成基因同源体的水平，而氨基乙氧基乙烯基甘氨酸则抑制生长素的水平

最近的研究在拟南芥幼苗提供的证据表明乙烯参与了局部生长素的建立，通过诱导的表达TAA1及相关基因(焦油s) (58］．与YUC蛋白TAA1/TARs一起是迄今为止描述的植物生长素生物合成唯一完整途径的组成部分[55- - - - - -57］．为了研究乙醚处理的葡萄浆果中生长素浓度的增加是否可能是由于TAR/YUC通路的刺激，葡萄的同源物拟南芥TAA1和YUC1蛋白在NCBI数据库中通过BLASTP相似性搜索得到。得到的9个TAR和10个YUC葡萄序列与各自的蛋白质家族进行了比对拟南芥并根据序列构建无根系统发育树(图3.A, B)。任何进一步的分析仅限于那些被NCBI数据库中存在的ESTs证实在任何组织中表达的葡萄家族成员。它们分别是VvTAR1(55%与AtTAA1一致)、VvTAR2(59%与AtTAR2一致)、VvTAR3(53%与AtTAR3一致)和VvTAR4(55%与AtTAR3一致)(如图所示)3.A)，以及VvYUC1(与AtYUC10的一致性为49%)、VvYUC2(与AtYUC10的一致性为51%)和VvYUC3(与AtYUC4的一致性为73%)(如图所示3.B).所有放大的企图VvYUC2来自许多不同的葡萄cdna片段(来自花、不同阶段的浆果、根、叶)的qRT-PCR标准的生成失败(数据未显示)，因此该基因不能被纳入表达分析。

植物生长素合成基因的表达焦油而且YUC家庭，以及前面所述的小道消息GH3基因(GH3-1而且GH3-2)参与浆果中aa - asp的形成[19，29，64]，在用于IAA和IAA- asp定量的相同样品中进行分析(见上图)2模拟)。为了验证乙烯处理浆果中乙烯反应的激活，乙烯生物合成基因的表达ACS1而且ACO1以及乙烯受体基因的表达ETR2也进行了分析。在之前一项关于葡萄浆果的研究中，ACS1变异前3 ~ 1周，ethrl处理未改变其表达ACO1而且ETR2在版本发布前的三至两周内，是可诱导的[15］．ETR2通常用作乙烯反应的标记，已在营养组织的研究中使用[65以及水果[66］．

在2011年的实验中，对乙烯利的强烈反应通过诱导被证明ETR2在喷雾剂喷洒3-48小时后，最多可稀释20倍(附加文件1A)ACS1(9和24小时)和ACO1(9-48 hps)也被上调(2到13倍)(附加文件1A)YUC3在所有分析的样品中都检测不到。的转录TAR2在3-24 hps之间，ethrell处理的浆果中增加了30倍(图4)．也有一个归纳(二到三倍)TAR4在24 HPS和48 HPS时，而TAR1而且TAR3在所有时间点，对照组和乙烯利样本之间没有显著差异(图4)．至于TAR1而且TAR3的表达差异无统计学意义YUC1在任何一个测试时间点，在ethrell处理的浆果和对照浆果之间(图4)．类似于TAR4，GH3-124 h和48 h后，乙烯利处理显著上调了表达(高达4.5倍)。的转录GH3-2在3小时(5倍)和9-48小时(最多4倍)时也可诱导(图4)．的增加GH3表达以及TAR4在48 hps的浆果中，与较高的IAA- asp和IAA浓度相关的表达(图2A, B).高度提升的表达TAR2这可能是由于转录水平的增加和活性酶的产生之间存在滞后，但也可能反映了IAA和/或IAA- asp的分解，IAA被隔离成IAA- asp以外的共轭物，或生长素被运输出浆果。

在2012年的实验中，只观察到处理过的浆果的成熟有轻微的延迟，表达分析ACS1，ACO1而且ETR2也反映了对ethrl的弱响应(附加文件1B).所有三个基因都只在一个时间点上被发现有显著的转录增加。因此，IAA生物合成和结合基因的表达变化也较前一季不明显。像2011年一样,TAR1在对照组果实和处理过的果实中表达相似。然而，在TAR1在处理过的浆果6 hpis和处理过的果实的版本(图5)．表达无明显变化TAR2ethrel处理的浆果和Control浆果之间的差异(图5)．有两倍多TAR3在浆果经过变异和表达的过程中，在ethrell处理的果实中，转录本也发生了变化TAR4在对照组浆果版本的时间点，通过24 hpis的乙烯利处理增加了(两倍)(图5)．升高的表达TAR4与对照果实中游离IAA浓度的轻微增加相一致(图2C)。YUC1ethrl处理后表达减少48 hpis(图5),YUC3无法检测到表达。两者的表达GH3初喷乙烯利1 h后，基因增加约3倍。还有一个归纳GH3-1表达48hpi和转录本积累GH3-2在对照组和ethrell处理的果实进行变异时，在ethrell处理的果实中增加了(图5)．

在最近一项关于乙烯对葡萄果实成熟影响的研究中，发现乙烯生物合成抑制剂氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)在转基因前3至1周施用时，对果实具有催熟作用[15］．AVG长期以来被认为是ACS蛋白的竞争性抑制剂[67，68]，从而阻断s -腺苷-蛋氨酸向1-氨基环丙烷-1-羧酸的转化[69］．当Capitani等人[70]解析了苹果ACS蛋白的晶体结构，发现该酶的活性位点与相关的氨基转移酶家族的活性位点高度相似[71］．根据这一发现，AVG最近被描述为植物生长素生物合成的抑制剂拟南芥以TAA1/TAR家族为目标[72］．独立于乙烯，AVG处理导致游离IAA浓度迅速降低拟南芥番茄和烟草的幼苗和叶片(烟草L.)植物以剂量依赖的方式。这项研究的结果证实了早期关于IAA生物合成速率降低50-60%的报道拟南芥暴露于AVG的幼苗[52］．在此基础上，研究了AVG对设拉子果实生长素产量的影响例足底实验。浆果暴露于AVG、乙烯利和对照处理0.5 ~ 24 h，然后提取和定量IAA和IAA- asp。在第一个分析时间点(处理开始后0.5小时)，已经发现ethrell处理的浆果中IAA的浓度增加了两倍，而avg处理的果实中IAA的浓度减少了三倍(图)6A).乙醚诱导的IAA积累的增加是短暂的，仅持续1小时，之后IAA浓度恢复到对照组观察到的水平，甚至在24小时后略有下降。然而，AVG在接触6-24小时后导致IAA浓度显著降低(图6A).在IAA-Asp浓度的变化中观察到类似的，但延迟的趋势(图6B).暴露于乙烯利导致在1小时和3小时后IAA-Asp积累显著增加，而AVG处理导致在6小时后IAA-Asp浓度降低(2倍)。植物生长素浓度的快速变化对乙烯利和AVG的反应例足底与田间喷洒浆果的数据进行比较(见上图)2)，很可能是由于在例足底条件和持续暴露在高水平。因此可以推断，生长素生物合成和结合的变化发生在暴露的前30分钟内，这就解释了焦油，YUC而且GH3在暴露0.5至24小时之间分析基因(图6C).的表达也没有差异ACS1而且ACO1Control, ethrel处理和avg处理的浆果之间(附加文件1C)ETR2乙烯利暴露3小时后出现表达(增加两倍)(附加文件1C)ACO1而且ETR2暴露20小时后AVG的表达已在类似的葡萄浆果中报道过例足底实验(15］．因为这两个基因都对蔗糖有反应[15]，这一明显矛盾的结果很可能是由于之前研究中使用的蔗糖浓度(0%或12% (w/v))与本研究(3% (w/v))不同。

由此可见，葡萄果实中生长素生物合成的TAR/YUC通路是活跃的，乙烯浓度的增加可以刺激该通路。因此，乙烯利的成熟延迟可能是通过提高浆果组织中的生长素形成介导的。还需要更多的研究来确定AVG的应用是否导致浆果成熟的提前是乙烯或生长素浓度下降的结果，或可能两者都有。

生长素和乙烯生物合成基因在发育过程中的表达变化表明这两种激素在葡萄果实成熟的起始过程中都起着作用

先前对葡萄浆果和其他非更年期水果的研究报告称，在成熟开始时，游离IAA和乙烯的浓度很低(由[6])。然而，乙烯浓度的细微增加与成熟阶段的开始相一致羊草和葡萄10- - - - - -13]，以及成熟葡萄和番茄中IAA-Asp积累的急剧增加[29]，表明这两种激素可能对从早熟到成熟阶段的过渡都很重要。为了进一步研究乙烯和生长素在葡萄果实成熟过程中的作用，研究了乙烯和生长素的表达TAR1-4，YUC1，YUC3以及ACS1而且ACO1对西拉子浆果从开花后3周(wpf)到16 wpf收获期间进行分析。Veraison定义为TSS水平显著增加之前的最后一个时间点，被发现为8 wpf(图7A).它也标志着第二生长阶段的开始和花青素的积累(图7B, C)。TAR1在变异前的浆果中表达水平较低，但拷贝数在10-12 wpf之间迅速增加，并在16周后收获时保持较高水平(图7D)。TAR3在变异前浆果中表达，而TAR2而且TAR4的特征是在版本(TAR4)或版本后一周(TAR2)(图7D).表达也观察到类似的峰值YUC1(8 - 10 wpf)(图7D),而YUC3被发现在幼浆果(1和2 wpf)中表达量很低，但是YUC3在浆果3-16 WPF中无法可靠地检测到转录本(数据未显示)。表达的增加YUC基因,类似于YUC1，最近有报道在草莓，其中的转录积累法YUC1和足总YUC2瘦果在大的绿色果期达到顶峰[73］．在葡萄果实中，乙烯生物合成基因的高表达先于假定的生长素生物合成基因的表达增加ACS1(3 - 7 wpf)和ACO1(峰值为7 wpf)(图7D)证实了先前结果的表达ACS /算法在培育葡萄浆果时[12，14，15］．从赤霞珠3-16 wpf浆果系列中记录了所有8个基因的相似表达模式2)．

数据表明，生长素生物合成的峰值与葡萄果实成熟的开始相一致，这种生长素产量的升高可能是由乙烯引起的。的后版本表达TAR1进一步表明IAA的合成贯穿于果实成熟的全过程。在变异前后IAA生物合成的增加似乎与成熟果实中这种生长素的低浓度以及变异前果实中高水平生长素的延迟成熟作用相矛盾。然而，在Böttcher等人报道的版本后，IAA-Asp积累急剧增加。[29]可能表明在成熟开始前后的短时间内产生的所有IAA，可能在整个成熟过程中都通过共轭途径被隔离。这个提议得到了增加的表达的支持GH3-1在浆果发育的这段时间里。此外，在番茄中，在成熟过程中也显示出IAA-Asp浓度的增加[29，辣椒的过度表达(辣椒l .)GH3基因在乙烯刺激下刺激早期过渡到成熟阶段[74的RNAi抑制APETALA2，是成熟的负调节因子[75]，导致早熟和积累增加GH3成绩单(76］．长期以来认为aa -氨基酸结合物仅仅是储存或降解游离生长素的手段[77]受到了一些研究的挑战，这些研究为IAA-Asp和其他结合物在植物发育和疾病反应中的积极作用提供了证据(由[78])。因此，可以想象的是，IAA-Asp共轭物可能在葡萄中代表了一种成熟信号，也可能在其他水果物种中也是如此，可以在果实的某个发育阶段通过一种未知的机制被感知到。从目前的数据来看，乙烯在葡萄果实成熟过程中的作用可能是在上述关键发育阶段触发IAA合成并随后形成IAA- asp。乙烯触发器的去除会导致成熟抑制。Chervin等人的研究支持了这一假设。[12，79]，在这种情况下，乙烯感知的阻断导致浆果尺寸减小，花青素和糖的积累延迟。

尽管乙烯和IAA参与果实发育的知识越来越多，但关于这两种激素在果实中相互作用的信息却很有限。本研究提供了葡萄果实中生长素生物合成的功能性两步途径的证据，并证明了乙烯释放化合物乙烯利对其的激活作用。因此，在乙醚处理的果实中观察到的成熟延迟可能是由于在未成熟的果实中增加了生长素浓度。果实发育过程中生长素和乙烯生物合成基因的表达模式进一步表明，成熟开始前乙烯产量的增加刺激了成熟开始时IAA的生物合成。乙烯对生长素生物合成的发育控制诱导可能是所提出的成熟因子IAA-Asp的快速积累所必需的。

植物材料

乙烯利处理使用葡萄L. cv设拉子果实连续两年在同一地点(南澳大利亚州汉多夫，-35.018223,138.838220)。2011年，以300 μL L剂量(2011年1月14日，变种前20天)喷施1次^－1乙烯利(144毫克L^－1乙烯利;Bayer CropScience, East Hawthorn, Australia)在0.1% (v/v) Chemwet 1000 (Nufarm, Laverton, Australia)中，溶液pH 3.1。对照水果喷0.1% (v/v) Chemwet 1000溶液。喷雾后48 h降水量为0.2 mm，期间平均最高气温为29.5℃。该试验采用随机三重复设计，每个重复的样本量和处理为30个组。在喷药后3、6、9、24和48小时，每个重复随机采集60个浆果样本。称重，立即去籽，在液氮中冷冻，在- 80°C保存直到使用。在整个开发过程中，每个重复每周随机采集60个浆果样本，用于测量浆果重量和TSS。

2012年，用上述Control和ethrl溶液喷洒了2次(2012年1月16日，版本前8天和2012年1月23日，版本前1天)。喷洒后48 h无降水，期间平均最高气温为34.5℃。2012年试验设计和取样制度的其他变化如下:每个重复和处理的样本量增加到400个，60个浆果样品在初次喷洒后1、6、24和48小时，以及在对照和ethrell处理的浆果版本对应的发育阶段进行脱水和冷冻，每个重复使用80个浆果进行重量和TSS测量。

用于分析基因表达的发育变化葡萄L. cv赤霞珠和设拉子浆果来自3-16 wpf(2010年11月22日- 2011年3月15日)，每隔一周从一个商业葡萄园(南澳大利亚州威伦加-35°)收集一次。26, 138°.55)在2010/2011赛季。在09:30 - 11:30之间完成采样，浆果(每个时间点采样60-200个浆果)立即去籽，组织冷冻在液氮中，并在- 80°C保存直到使用。

为例足底浆果实验:10株葡萄40束(葡萄L. cv设拉子)在19天(2012年1月05日)前(09:00 - 10:00)从阿德莱德山(南澳大利亚的汉道夫，-35.018223,138.838220)的葡萄园中取样，并在冰中保存直到使用。

花青素和TSS含量的测定

使用RFM710数字折光仪(英国滕布里奇韦尔斯的贝灵汉斯坦利)对2011年和2012年Ethrel实验中采样的浆果进行了单独的TSS(白度)测量。根据Böttcher等人的描述，对发育系列浆果进行TSS分析和花青素测量。[20.］．

系统发育分析

通过非冗余NCBI蛋白数据库(e值≤10)的BLASTP检索，鉴定与TAR-和yuc相关的葡萄序列^-20年)使用拟南芥TAA1或YUC1蛋白序列作为查询。用于系统发育分析的所有序列的NCBI登录号都列在图中3.或在附加文件中3.．使用ClustalW(2.0.12版本)程序对序列进行对齐[80]，使用PHYLIP 3.67生成邻域连接无根树[81］．

RNA提取，cDNA合成和qRT-PCR

根据Davies和Robinson的方法，从葡萄浆果组织中提取总RNA [82，并按照Symons等人的描述进一步纯化。[83］．用转录逆转录酶(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)用1 μg RNA和Oligo (dT)合成qRT-PCR的第一链cDNA₁₈引物的反应体积为20 μL，按照制造商的说明。在使用之前，cDNA样本被稀释20倍。qRT-PCR分析采用Roche LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒，反应浓度为15 μL，引物最终浓度为0.5 μM。使用Roche LightCycler 480系统进行扩增，参数如下:95°C 5分钟，95°C 20秒，58°C 20秒和72°C 20秒(45个循环)，72°C 5分钟，然后熔体循环(95°C 15秒，50°C 45秒，持续加热至95°C, 0.11°s^－1)．所使用的基因特异性引物对和相应的登录号Gh3-1, gh3-2, ac1, aco1, etr2以及ACT2(内参基因)已发表[15，19］．用于假定生长素生物合成基因的引物为TAR1[GenBank: XM_002274511]， 5 ' -CATCTATTCAAGATACTATTGG-3 '和5 ' -ATATTGCAGCTACTCTCAAT-3 '，用于TAR2[GenBank: XM_002281372]， 5 ' -CAGCAATGAAGCATATTGAAGG-3 '和5 ' -GAGTGAGAGCACCAGGAAATG-3 '，用于TAR3[GenBank: XM_002265837]， 5 ' - cccaagatgactttgatgctg -3 '和5 ' -TGATCAACTGATTGTTGATTCCACT-3 '，用于TAR4[GenBank: XM_002266102]， 5 ' -CAGCCTCATCAAGACCCAAGAT-3 '和5 ' -TGACGGTTGATTTCATTCTTCG-3 '，用于YUC1[GenBank: XM_002269808]， 5 ' - caggaaactgtcgcaataggg -3 '和5 ' -CAAGAACTATGTTGGGTATTGAGAGG-3 '，用于YUC2[GenBank: XM_002269727]， 5 ' -TACACTTTGGAAGCATCACAGC-3 '和5 ' -GGTTTGTACTGTGCTGGACTGG-3 '和forYUC3[GenBank: XM_002282321]， 5 ' -ATGCCCAAAACGCCATTTCC-3 '和5 ' -ATGTCCCGGGCGATATTGAC-3 '。每次PCR均重复3次。为了计算每个反应中基因的拷贝数，使用PicoGreen (AGRF，阿德莱德，南澳大利亚)对用于标准曲线的纯化基因片段进行量化，并根据惠兰等人的研究确定每个标准稀释剂中的分子数。[84］．通过熔体曲线分析和琼脂糖凝胶分离确认了反应的特异性，并通过测序(AGRF，阿德莱德，南澳大利亚)验证了每个产物的身份。

例足底贝瑞归纳分析

从样本串中随机选取浆果，在含有一半米尔顿抗菌片L的0.1% (v/v) Chemwet 1000中杀菌^－1(米尔顿澳大利亚，拉弗顿北，维多利亚)10分钟，并用无菌纳米水清洗三次。以下所有步骤均在无菌条件下的层流中进行。通过水平切割刷区，从每个浆果的底部取下薄薄的一片，以促进化合物的吸收，并将改性的浆果放在琼脂上。20个浆果被放置在装满25 mL甘堡培养基，0.025% (w/v)水解酪蛋白，0.8% (w/v)琼脂，pH 5.7-5.8和一种或多种以下添加剂(最终浓度)的培养皿中^－1AVG，过滤器消毒)，乙烯利(72毫克L^－1乙烯利)，3% (w/v)蔗糖。每个平板构成一个重复，每个处理和时间点使用3个重复。

浆果放在盘子上，切面面向琼脂，用parfilm密封，室温下避光保存。所有含有乙烯利的盘子都分开存放。在0.5-24小时后收获果实，去籽，冷冻在液氮中。

标记IAA-Asp的化学合成

[Indole-D₅如前所述，合成了IAA-Asp [29使用[]indole-D₅标记的IAA作为起始基板。

LC-ESI-MS/MS分析IAA和IAA- asp

为了进行LC-MS/MS定量，从100 mg葡萄浆果组织中提取IAA和共轭物并进行定量，如Böttcher等人所述。[29］．

统计数据分析

样本间差异的显著性用Student 's测试t-检验(未配对)或与邓肯的方差分析事后测试，使用IBM SPSS Statistics ver。20 (IBM澳大利亚，悉尼，NSW，澳大利亚)。

华:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate氧化酶

ACS:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶

AVG:

Aminoethoxyvinylglycine

Dps:

几天后喷

dpi:

初喷后天数

简历:

控制果的版本

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

电动汽车:

艾塞尔处理过的水果的变种

GH3:

格雷琴Hagen3

现病史:

初喷后数小时

国际宇航科学院:

Indole-3-acetic酸

TAA:

拟南芥色氨酸氨基转移酶

沥青:

色氨酸转氨酶相关

TSS:

总可溶性固体

YUC:

丝兰。

作者要感谢Angela Keulen的技术支持。我们也感谢Chalk Hill Wines和Nepenthe Wines为本次研究提供的水果。该项目的部分资金由澳大利亚葡萄种植者和酿酒师通过他们的投资机构葡萄和葡萄酒研究与发展公司(批准号:)提供。CSP 09/05)和澳大利亚联邦政府提供的配套资金。CSIRO工厂工业是葡萄酒创新集群的合作伙伴。

从属关系

1. CSIRO工厂工业，信箱350，格伦奥斯蒙德，SA, 5064，澳大利亚

   Christine Böttcher, Crista A Burbidge, Paul K Boss & Christopher Davies

相应的作者

对应到克里斯托弗•戴维斯．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

所有作者都对来自实地的浆果样品的采样和处理做出了贡献例足底实验。CB参与了研究的设计，进行了系统发育分析、引物设计和生长素测量，并起草了手稿。CAB进行了qRT-PCR分析，并参与了生长素提取。PKB参与了研究的设计并进行了统计分析。CD构想了这项研究，并参与了它的设计和协调。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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