CLV3肽n端两侧的序列对其在干细胞调控中的裂解和活性至关重要拟南芥

背景

虽然已知CLAVATA3 (CLV3)作为12和/或13个氨基酸(AA)分泌的肽来调节茎尖分生组织(sam)中干细胞的数量，但功能CLV3肽是如何产生的，以及是否需要任何特定的序列来进行加工，在很大程度上仍然未知。

结果

我们开发了一种基于质谱(MS)的在体外检测异种产生的CLV3融合蛋白的裂解情况。通过融合蛋白与拟南芥我们发现了两个裂解位点:先前报道的一个在Arg70之前，一个在Met39之前。利用合成肽和MALDI-Tof-MS分析，我们证明了CLV3及其同源CLE1肽n端两侧的非保守5-AA基序对其切割和最佳活性至关重要在体外。我们还发现，在融合蛋白和CLV3的合成肽中，Ala取代了Leu69，破坏了它们的裂解，导致调节茎和根分生组织大小的活性显著降低。

结论

这些结果表明，CLV3肽n端两侧的5-AA残基是干细胞调控中正确切割和最佳功能所必需的。

长期以来，人们已经知道小肽作为内分泌激素和神经递质，促进动物细胞间的通讯[1- - - - - -4]。自从20年前第一个肽激素系统素被发现以来，5]，许多小肽已被发现，调节包括花粉管引导在内的发育和防御过程[6，7]，小孢子-绒毡层相互作用[8，9]，气孔形成[10- - - - - -13]，细胞增殖[14，15]、干细胞内稳态[16- - - - - -18]和伤人反应[5，19，20.]。

CLV3是植物中研究较多的肽激素之一。的CLV3基因编码一种96-AA分泌蛋白，该蛋白在反馈调节回路中发挥作用，通过抑制s的表达来限制sam中干细胞的数量WUSCHEL（本人)转录因子[16，21]。结合遗传和生化分析表明，CLV3通过与CLAVATA1 (CLV1)和受体蛋白激酶2 (RPK2)， CLAVATA2 (CLV2)受体样蛋白和LLP1 2 (SOL2)/CORYNE (CRN)蛋白的富亮氨酸重复(LRR)受体激酶相互作用而起作用[22- - - - - -25]。CLV3与大量CLE蛋白共享保守的14-AA CLE基序[26，27]。结构域缺失分析表明，大部分位于分泌信号肽和CLE基序之间的非保守序列，以及CLE基序之后的序列都不是CLV3功能所必需的在活的有机体内［28]。在体外实验表明，合成的与CLE基序相对应的12-、13-和14-AA肽，即CLV3p12、CLV3p13和CLV3p14，在茎和根分生组织(RMs)中都具有促进干细胞分化的功能[17，28- - - - - -31]。CLV3p12和CLV1之间的直接相互作用已在烟草BY-2细胞中得到证实[32]。转基因愈伤组织过表达的MALDI-Tof质谱分析CLV3鉴定出一个12-AA羟基化肽[29]，而最近的纳米- lc - ms分析拟南芥幼苗过度表达CLV3鉴定出一种13-AA阿拉伯糖糖基化肽[30.]。这两种候选内源性CLV3肽具有相同的n端Arg70(编号为CLV3蛋白全长中的残基)和Pro73和Pro76上的羟基化修饰。虽然ala取代实验表明在SAMs中CLV3的功能不需要Pro76上的糖基化[33]，对化学合成的CLV3糖肽的分析表明，糖基化可能有助于肽的稳定性[34]。利用异源产生的gst标记的CLV3融合蛋白与花椰菜和烟草by -2细胞提取物结合，通过凝胶印迹和质谱分析检测了Met42和Arg70前的两个裂解位点[35，36]。对于线虫GrCLE1，用花椰菜和马铃薯根提取物观察到Arg130、Arg151、Arg172和Arg193之前的裂解[37]。在Medicago truncatula,MtCLE36被细胞外液中的酶加工，产生一种15-AA肽，SKRRVPNGPDPIHNR [38]。尽管这些研究提供了有关CLE肽裂解的基本知识，但涉及裂解识别的序列以及这些裂解如何促进这些肽的活性仍然难以捉摸。

在动物中，参与肽裂解的酶是丝氨酸内多肽酶亚家族枯草酶(sbt)，也称为枯草杆菌样蛋白转化酶[39]。裂解一般发生在双碱基赖氨酸/Arg-Arg残基之间或之后，或在单碱基Arg残基之后，释放出N端和/或c端碱基残基的肽[40]。然后，这些基本残基被羧肽酶E (CPE)等外肽酶除去[41]。在植物中，大多数sbt被预测在细胞外空间发挥作用，基于n端分泌信号序列的存在[42]。在拟南芥， AtSBT1.1和AtSBT6.1分别可切割PSK4和RALF23 [43，44]，表明动物和植物之间存在一种保守的肽加工机制。

研究肽裂解的传统方法是通过凝胶试验结合异种产生的肽酶[45，46]。由于该方法的灵敏度较低，通常难以检测到小的肽片段。近年来发展起来的肽组学技术有可能解决这一问题[47- - - - - -50]。例如，对小鼠羧基肽酶E (CPE)突变体与野生型的肽组学比较揭示了羧基肽酶在神经肽加工中的作用[51]。在Medicago truncatula,肽组学技术已被用于鉴定小肽，尽管大多数检测到的肽似乎是大量蛋白质(如核糖体蛋白和组蛋白)的降解产物[52]。

利用已被充分研究的CLV3，我们建立了一种基于质谱的肽组学方法来检测由完整细胞分泌的酶切割的肽片段拟南芥幼苗。利用该方法，我们鉴定了CLV3蛋白的两个内部切割位点，一个在Met39之前，另一个在Arg70之前。此外，我们证明了位于CLV3肽n端两侧的Leu69和5-AA残基对于Arg70之前的裂解和最佳活性是重要的在体外。

异源产生的CLV3融合蛋白具有活性在体外

为了产生CLV3蛋白(不分泌信号肽)，构建了一种将串联排列的Trx和His标签融合到CLV3的n端(命名为TH-ProCLV3）.构造被转换为大肠杆菌菌株BL21(DE3)产生TH-ProCLV3融合蛋白，总分子质量为23.8 kD。然后用Ni-NTA琼脂糖柱亲和层析纯化TH-ProCLV3(图2)1A)，并通过Bradford法定量[53用7-kD切断透析袋透析后。

在体外TH-ProCLV3融合蛋白在SAMs中的活性测定clv3-2和clv1-1(都是L字)呃(背景)变种人拟南芥，如前所述[28]。我们观察到的孵化clv3-21 μM TH-ProCLV3处理8天后，SAMs的大小显著减小(图2)1B、H和I)，而SAMs未见明显降低clv1-1苗(图1B、D和E)，表明TH-ProCLV3融合蛋白在大肠杆菌以依赖于clv1的方式积极限制sam。

同样的,在体外根分析[17]在L呃和clv2-1(在我呃背景)幼苗。我们观察到L呃TH-ProCLV3处理的幼苗受到明显抑制(图2)1C, F和G)，如先前在CLV3肽治疗中报道的[31]，而L呃在无融合蛋白培养基上生长的幼苗根系生长正常(图2)1C, F和G)。相比之下，未观察到明显的生长抑制clv2-1在TH-ProCLV3培养基上生长的幼苗(图1显微镜检查显示TH-ProCLV3处理导致L的RMs终止呃，但不是。clv2-1(图1J-M)。这些结果共同表明TH-ProCLV3融合蛋白产生于大肠杆菌积极调节sam和rm的大小。

CLV3融合蛋白的裂解检测

为了分析CLV3的裂解，我们开发了一种基于MALDI-Tof质谱的方法来分析产生的肽片段在体外。Pre-germinated L呃在液体培养基中接种TH-ProCLV3融合蛋白，然后在不同时间点收获培养基，直接进行MALDI-Tof MS分析。将融合蛋白接种在相同培养基中，不接种幼苗作为对照。我们观察到，分析肽裂解的最佳时间是在与L孵育24小时后呃当检测到大量不同分子质量的小肽时(附加文件)1）.

为了获得这些片段的精确序列，对这些样品进行了Q-Tof MS/MS分析。通过SEQUEST搜索与CLV3蛋白匹配的肽序列，我们鉴定了20多个肽(图3)2）.其中，成熟CLV3肽的两种候选形式的主干CLV3p12和CLV3p13肽[29，30.]，纳入(图2）.将这些片段与CLV3蛋白比对后，检测到两个最常发生的末端，n端Met39和Arg70(图2)2)，表明内部裂解位点位于Met39和Arg70之前。先前有报道Arg70之前的裂解[36，然而，Met39之前的那个是新的。由于Met39位于非功能区[28，乳沟可能与功能无关。

值得注意的是，虽然检测到c端His81和His82的多肽，但没有发现n端His82和Val83匹配的多肽。相反，我们检测到具有可变c末端的肽。该区域不存在特定的内部切割位点，而羧基肽酶参与了CLV3的c端加工。最近,玉城丹尼et al。内体定位的SOL1羧肽酶负责从CLE19蛋白中去除c端精氨酸残基[54]。自从完整的L呃在我们的实验中，检测到的c端加工活性可能来自非特异性的细胞外羧基肽酶，而不是SOL1。

n端侧翼序列影响CLV3的裂解

为了检验CLV3肽n端两侧的残基是否需要内部切割，我们化学合成了CLV3p12和含有额外1、3、4或5个残基的肽，即L-CLV3p13、EEL-CLV3p15、HEEL-CLV3p16和LHEEL-CLV3p17。将这些多肽接种于含拟南芥(左呃)幼苗和培养基样品在不同时间点收获，并直接进行MALDI-Tof质谱分析。我们观察到，分析这些肽裂解的最佳时间是接种后3天，此时检测到大量的裂解片段(附加文件)2）.对于CLV3p12和L-CLV3p13，我们观察到从N端和c端逐渐去除残基(图2)3.A和B)。对于EEL-CLV3p15，观察到c端His残基被去除，但n端残基未被去除(图2)3.C). CLV3p12、L-CLV3p13和EEL-CLV3p15未检测到内部裂解。相比之下，除了HEEL-CLV3p16和LHEEL-CLV3p17的末端残基逐渐去除外，还观察到内部切割(图2)3.D和E)。特别地，对于HEEL-CLV3p16，在Thr71之前观察到切割，产生了一个11-AA肽，预计是非功能性的[28]，而对于LHEEL-CLV3p17，在Arg70和Thr71之前检测到裂解，分别产生功能性CLV3p12和非功能性11-AA肽(图2)3.E).因此，Arg70之前的内部切割可能需要至少5个侧翼残基，而外肽酶则参与去除两个末端的残基。

具有5个额外n端残基的CLV3肽与CLV3p12具有相似的活性

为了评价上述不同n端延伸的合成肽的活性，我们进行了在体外用L呃幼苗。用CLV3p12、L-CLV3p13、EEL-CLV3p15、HEEL-CLV3p16或LHEEL-CLV3p17分别在10 nM、30 nM、100 nM或1 μM的浓度下接种8 d后，测量初生根的长度4）.结果表明，CLV2p12在10 nM的浓度下具有活性，EEL-CLV3p15在100 nM的浓度下具有活性，而L-CLV3p13和HEEL-CLV3p16在1 μM的浓度下也不具有活性，说明这些附加的n端Leu、Glu-Glu-Leu或hi -Glu-Glu-Leu残基对它们的活性造成了严重的损害。值得注意的是，LHEEL-CLV3p17与CLV3p12一样具有活性，即在10 nM下具有功能。结合上述观察到的有效裂解，我们认为LHEEL-CLV3p17中额外的5个残基导致了CLV3p12的有效释放，因此具有与CLV3p12相当的活性。

Leu69对合成肽的裂解和活性起着至关重要的作用

先前的研究表明，PSK和RALF是在Leu残基被内多肽酶裂解后产生的拟南芥［43，44]。为了研究CLV3肽n端附近的Leu69是否参与裂解，我们合成了ala取代肽LHEEA-CLV3p17，并在接种幼苗后使用MALDI-Tof质谱检测其裂解情况在体外。有趣的是，虽然观察到c末端残基被去除，但没有检测到内部切割(图2)3.F)，表明Leu69Ala的取代破坏了肽的内部切割。我们还在根试验中检测了LHEEA-CLV3p17肽的活性，并观察到取代导致终止RMs的活性显著降低(图2)4）.这些结果共同表明，n端两侧的Leu69对内部切割至关重要，随后对肽的活性至关重要。

Leu69对于CLV3融合蛋白的最佳活性至关重要

为了评估Leu69是否对TH-ProCLV3融合蛋白也很重要，我们进行了Ala替换以产生TH-ProCLV3_Leu69Ala融合蛋白大肠杆菌。TH-ProCLV3的活性_Leu69Ala在限制地对空导弹的规模方面进行了研究在体外。结果表明，TH-ProCLV3中的sam_Leu69Ala治疗clv3-2幼苗明显大于TH-ProCLV3处理的幼苗(图2)5B, C，和E)，当然和未治疗的相比clv3-2苗(图5A，他们仍然更小。结果表明，TH-ProCLV3中的Leu69Ala取代_Leu69Ala部分削弱了其在地对空导弹方面的活动。

通常已知的枯草酶识别位点是Lys/Arg-Arg [40]。尽管在大多数CLE成员中拟南芥位于12-AA CLE基序保守Arg之前的残基为Lys(附加文件)3.)，对于CLV3，残基为Leu。我们检测了Leu69Lys的替换是否阻碍了融合蛋白的活性。TH-ProCLV3_Leu69Lys制作于大肠杆菌并应用于clv3-2幼苗在体外。正如预期的那样，经TH-ProCLV3处理的SAMs大小之间没有观察到显著差异_Leu69LysTH-ProCLV3治疗组(图2)5B, D，和E)，表明取代Leu69Lys不影响活性。此外，我们还进行了在体外SAM测定clv1-1，经TH-ProCLV3、TH-ProCLV3处理的样品间无显著差异_Leu69Ala, TH-ProCLV3_Leu69Lys,和未经处理的(图1)5E)，说明TH-ProCLV3的功能_Leu69Ala和TH-ProCLV3_Leu69Lyssam中的融合蛋白依赖于clv1，因为CLV3肽[34]。

为了确定这些融合蛋白是否能够抑制本人用不同融合蛋白处理后的茎尖cdna进行qRT-PCR分析。如图所示5F，表达水平本人th - proclv3处理的茎尖中clv3-2幼苗减少到未处理的10%左右。中得到了类似的结果clv3-2TH-ProCLV3处理的幼苗_Leu69Lys(图5F)，证实了Leu69Lys的替换不会损害融合蛋白的活性。的表达水平则相反本人TH-ProCLV3中_Leu69Ala治疗clv3-2仅为未经处理的50%左右(图2)5F).被Ala取代而不是被Lys取代的Leu69破坏了CLV3的活性这一事实表明，尽管Leu69不是成熟CLV3肽的一部分，但它对抑制CLV3的最佳活性很重要本人sam中的表达。

Leu69对CLV3融合蛋白的裂解至关重要

检测融合蛋白TH-ProCLV3中是否存在Leu69Ala和Leu69Lys的替换_Leu69Ala和TH-ProCLV3_Leu69Lys对这些融合蛋白与野生型幼苗共培养后收集的培养基样品进行Q-Tof MS/MS分析。的TH-ProCLV3_Leu69LysTH-ProCLV3的肽谱与TH-ProCLV3相似(图2)2和图6A)，产生预期的CLV3p12和CLV3p13，以及含有c端Lys69的肽。然而，对于TH-ProCLV3_Leu69Ala虽然检测到了CLV3p12和CLV3p13，但没有检测到c端Ala69的肽片段(图2)6B)，表明Leu69Ala的取代可能降低了融合蛋白的切割效率或降低了所产生肽的稳定性。这些结果共同表明Leu-Arg和Lys-Arg连接都可以被释放的酶识别和切割拟南芥幼苗。

5-AA n端侧翼序列是CLE1正常切割所必需的

为了解决CLV3正确切割所需的5- aa残基是否与其他CLE肽具有共性，我们合成了具有0、1或5个n端侧翼残基的CLE1肽:CLE1p12、M-CLE1p13和FNESM-CLE1p17。之所以选择CLE1，是因为它与clv3-1CLV3调控元件在转基因植物中表达时的突变表型[35]。在5-AA n端侧翼序列中，只有Glu (E)残基在CLV3和CLE1之间保守(附加文件)3.）.经L呃在CLE1p12和M- cle1p13中，末端残基逐渐修剪，而在FNESM-CLE1p17中，Met (M)和Arg (R)之间发生了内部断裂，释放出CLE1p12(附加文件)4）.这表明5-AA基序是CLE1正确切割所必需的。如所料，当在体外活性测定在clv3-2FNESM-CLE1p17在限制sam大小方面表现出与CLE1p12相似的活性，而M-CLE1p13的活性约为CLE1p12的100倍(附加文件)5）.

尽管它已经在拟南芥CLV3作为肽配体调节SAMs中干细胞的数量[21，29，30.]，肽是如何从蛋白质中产生的，以及切割是否需要特定的序列基序在很大程度上仍然未知。在本研究中，我们利用质谱分析鉴定出了产生于大肠杆菌一个在Met39之前，另一个在Arg70之前。在CLV3p12的n端两侧有1、3或4个额外的AAs的合成肽，其终止RMs的活性大大降低在体外,而含有5个额外AAs的肽则完全恢复了活性。肽组学研究表明，CLV3及其具有5-AA n端延伸的同源CLE1肽具有正常的裂解，而较短的延伸阻碍了裂解。

在CLV3中发现了两个内部切割位点

肽激素是动物内分泌和神经信号转导的重要信号分子[1- - - - - -4]。它们通常由较大的蛋白前体通过SBT家族内肽酶的翻译后加工而产生[39，40]。在拟南芥基因组中鉴定的56种SBT内肽酶中，有46种携带分泌信号肽[42];其中AtSBT1.1和AtSBT6.1分别参与PSK4和RALF23的处理[43，44]。CLV3编码96-AA前蛋白，作为12-和/或13-AA肽，羟基化和糖基化修饰[29，30.]。我们推测，如果CLV3是由分泌酶处理的，应该可以检测到这种酶的活性在体外。我们生产TH-CLV3融合蛋白大肠杆菌并证明了它在恢复clv3地对空导弹缺陷在体外通过clv1依赖的途径一个在体外随后进行了裂解实验，证明TH-ProCLV3融合蛋白在接种24小时后被有效地裂解拟南芥同时释放CLV3p12和CLV3p13肽。在对CLV3融合蛋白释放的所有片段进行比对后，我们证实了先前报道的位于Arg70之前的切割位点[36并在Met39之前发现了一种新的乳沟。由于Met39位于CLV3功能不需要的区域[28，乳沟可能与功能无关。

n端结区是CLV3解理的关键

先前的研究表明，Leu69残基在CLV3的功能中是中等的，而Arg70对CLV3的功能非常重要在活的有机体内［33]，虽然Leu69不是CLV3成熟肽的一部分[29，30.]。Arg70参与CLV3的处理在体外据报道[36]。为了评估Leu69在切割中的重要性，我们在TH-ProCLV3融合蛋白中引入了Leu69Ala或Leu69Lys替代，并检测了它们在切割中的效率以及随后限制sam大小的活性。我们观察到TH-ProCLV3_Leu69Lys裂解方式与TH-ProCLV3相似，而TH-ProCLV3_Leu69Ala表明由拟南芥幼苗可以同时切割Lys-Arg和Leu-Arg连接。值得注意的是，到目前为止，在动物的肽加工中还没有报道过Leu-Arg结的切割。在CLE家族成员中，尽管CLE基序的n端Arg残基高度保守，但紧靠Arg之前的残基保守性较低(附加文件)3.）.在Medicago中，在保守的Lys-Arg结之前的上游位点有裂解的报道[38]。对于PSK4和RALF23，在上游的双碱基Arg-Arg位点，分别在Leu-His和Leu-Ala连接处检测到切割[43，44]。植物中的内肽酶可能比动物中的内肽酶具有更多样化的裂解位点。

CLV3的n端侧翼序列是有效切割的关键

Furin是第一个在哺乳动物中发现的SBT [55]。位于胞外异常plasin-A n端两侧的4-AA序列Arg-Asn-Lys-Arg是furin加工胞外异常plasin-A所必需的[56]。在拟南芥结果表明，AtSBT1.1对6个PSK成员的裂解效率不同[43]。对于CLV3，先前的研究表明，在CLV3肽中添加c端His82对其终止rm的活性没有显著影响在体外，而n端Leu69的加入大大降低了活性[31]。在这项研究中，我们检测了在CLV3肽的n端添加不同数量的AA残基的影响，并观察到含有1、3或4个额外残基的肽在终止RMs方面的活性降低。然而，具有5-AA扩展的LHEEL-CLV3p17表现出与CLV3p12相同的活性。进一步的肽组学分析表明，带有1-、3-或4-AA延伸的肽段没有被正确处理，而带有5-AA附加残基的肽段则没有被正确处理。LHEEL-CLV3p17中肽活性与有效切割之间的正相关表明，n端侧翼的5-AA基序是识别和适当切割以释放功能性CLV3肽的必要条件。与这一假设一致，我们发现LHEEA-CLV3p17肽和TH-ProCLV3中的Leu69Ala取代_Leu69Ala融合蛋白导致终止RMs的活性降低和内部切割受损。

根据目前获得的证据，我们认为n端侧翼序列的长度比AA的身份更重要，原因如下:1)我们之前在CLV3侧翼残基上进行的丙氨酸取代实验表明，该区域的单个AA对CLV3功能的贡献很小在活的有机体内［33];2)所有CLE蛋白编码的序列拟南芥基因组在5-AA侧翼区域显示出很少的保守性(附加文件3.);3) CLE1在5-AA基序中与CLV3只共享一个AA (Glu)，并且能够互补clv3-1在CLV3规管要素下表达时[35];4)合成的具有5-AA n端延伸的CLE1肽在接种时被正确地切割拟南芥幼苗。最有可能的是，5-AA侧基序作为CLV3和CLE1切割的内多肽酶识别和/或结合结构域。

我们开发了一个在体外幼苗试验平行分析茎和根分生组织中肽的裂解和活性。通过实验，我们发现CLV3的最大活性需要在Leu69和Arg70之间进行适当的切割，并且切割需要在其n端两侧至少有5-AA的识别结构域。这些发现可能有助于阐明其他肽激素的裂解和功能，并确定参与肽加工的酶。

分子克隆

的编码区CLV3[GenBank: NM_001124926.1]用PCR方法扩增了不含该信号肽的黄花苜蓿的cDNA拟南芥(哥伦比亚-0)使用引物5 ' -GGGGTACCCCCATGCTCA CGTTCAAG-3 '和5 ' -GGAATTCCTCAAGGG AGCTGAAAGTTGTTTCT-3 '。将PCR产物克隆到pEASY-T1vector (TransGen, Beijing, China)，用EcoR我和KpnI，并在帧内进行子克隆pET-48b（+(Novagen，德国)与Trx-His串联标签融合产生TH-ProCLV3。

采用Fast Mutagenesis System试剂盒(TransGen，北京，中国)将点突变引入TH-ProCLV3使用引物5 ' - ttaggactacatgaagagcaaggactgtt -3 '和5 ' -GCCTCTTCATG TAGTCCTAAACCCTTCGTC-3 '，以及5 ' -TTAGGACTACATGAAGAGAAAA GGACTGTT-3 '和5 ' -TTCTCTTCATGTAGTCCTAAACCCTTCGTC-3 '生成TH-ProCLV3_Leu69Ala和TH-ProCLV3_Leu69Lys，分别按照制造商的协议。

融合蛋白生产和多肽合成

构造的TH-ProCLV3, TH-ProCLV3_Leu69A和TH-ProCLV3_Leu69Lys都变成了大肠杆菌用0.1 mM异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷在16℃下诱导融合蛋白表达16小时。通过离心收集细菌，通过超声波裂解，然后根据制造商手册使用Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN，德国)亲和纯化融合蛋白。洗脱后的蛋白使用7-kD保留透析袋透析，并使用Bradford蛋白定量试剂盒(Biomed，北京，中国)进行定量。

本研究中使用的所有肽均以超过80%的纯度合成(AuGCT，北京，中国)，溶解于50 mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中，并使用0.22 μm过滤器(Millipore，德国)进行灭菌。

在体外活性测定

的种子clv1-1, clv2-1和clv3-2(全英文)呃背景)，颜色-0和L呃是否如先前报道的那样经气体灭菌[33]，在无菌蒸馏水中浸泡2天，温度4℃，避光。在体外根和SAM测定按描述进行[17，28]。

存在分析

用Plant Total RNA Isolation Kit (TIANGEN, Beijing, China)从8 d龄苗中提取约30个茎尖，然后用First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α (TOYOBO, Japan)反转录为cDNA。在Rotor-Gene 3000热循环仪(Corbett, Australia)和SYBR Premix ExTaq II试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)中进行qRT-PCR本人[GenBank: NM_127349.3]根据内控进行归一化EIF4A1[GenBank: NM_001084679.1]，使用Rotor-Gene 6软件v 6.0 (Corbett, Australia)根据2^{——∆∆CT}方法(57]。引物为5′-GCTCCTCTTAACCCAAAGGC-3′和5′-CACACCATCACCAGAATCCAGC -3′，引物为5′-TTCTCTGCGACAATGCCTC-3′和5′-GCTTCCAGTCTTCTTTC TCCAC-3′本人和EIF4A1,分别。

在体外劈理分析

气体灭菌和冷处理的种子在半强度Murashige和Skoog基础盐培养基(Sigma-Aldrich, USA)上预发芽36小时，pH为5.8，加1%蔗糖，0.5 g/L MES (Merck, Germany)和1.5%琼脂。将5株幼苗移栽到含有200 μL培养基、10 μM融合蛋白或肽的Eppendorf管中。然后将这些试管放置在滚轮架上，在22°C下进行16小时光照/8小时暗循环培养。在不同时间点采集10 μL培养基。

质谱分析

对于Q-Tof MS/MS分析，介质样品使用Triple TOF™5600 Q-Tof Micro MS/MS (AB SCIEX，美国)和CapLC高效液相色谱(Waters，美国)进行分析，使用内径为75 μm的熔融石英微毛细管柱(10 cm)。色谱柱用C18反相树脂填充(GEAgel C18 SP-300-ODS-AP;粒径:5 μm;孔径，300 Å;基诺雅，北京，中国)。采用梯度从溶液a(4%乙腈(ACN):96%水，含0.1%甲酸)到50%溶液B (80% ACN:20%水，含0.1%甲酸)，在70分钟内实现分离，在10分钟内达到100% ACN，流速为300 nL/min。泵A和泵B的流量从2.5 μL/min降至300 μL/min左右。质谱在正离子模式下工作，源温度为80℃，锥形气流量为10 L/hr。在纳米流探针尖端施加3 kV的电压。MS和MS/MS谱以自动化的数据依赖模式获取，所有数据均使用MassLynx 4.0版本软件处理，生成“。DTA”文件。 The instrument was calibrated with a multi-point calibration using selected fragment ions that resulted from the CID of Glu-fibrinopeptide B (+2 ion, m/z 785.8, Sigma-Aldrich, USA). Sequences of peptides were obtained from Turbo SEQUEST searching with Bioworks version 3.2 software (Thermo, USA) using individual peptide databases made for TH-ProCLV3, TH-ProCLV3_Leu69Ala和TH-ProCLV_Leu69Lys后滤波Xcorr值> 1.5,DeltaCn值> 0.01。

对于MALDI-Tof质谱分析，在使用AXIMA-CFR™plus (SHIMADZU, Japan)进行337 nm脉冲氮激光操作之前，将2 μL的培养基样品直接在不锈钢板上进行标记，用基质溶液冲洗，然后风干。每个光谱对每个点进行100到150次拍摄。蛋白裂解实验采用ACN/0.1%三氟酸(TFA) 3:2 (v/v)饱和sinapinic酸作为基质溶液，采用线性延迟提取模式获得正离子质谱。对于多肽，以ACN/0.1% TFA 1:1饱和的α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质，采用反射模式获取数据。仪器外用醛缩酶(Sigma-Aldrich, USA)和缓激肽片段1-7 (Sigma-Aldrich, USA)、P₁₄R (Sigma-Aldrich, USA)和ACTH片段18-39 (Sigma-Aldrich, USA)。

我们感谢庄璐(中国科学院植物分子生理重点实验室)和王丽(中国科学院光生物学重点实验室)分别支持Q-Tof MS/MS和MALDI-Tof MS分析，并感谢John Hugh Snyder对本文的批判性阅读。国家自然科学基金项目(31121065)和国家科技部项目(2013CB967301)资助。

从属关系

1. 中国科学院植物研究所植物分子生理重点实验室，北京香山南新村20号，100093

   徐婷婷，宋秀芬，任世超，刘春明

2. 中国科学院大学，北京，100049

   徐婷婷，任世超

相应的作者

对应到Chun-Ming刘。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

TTX设计并执行实验并撰写稿件;SCR辅助一些实验;CML和XFS指导研究并修改稿件。所有作者都阅读并认可了稿件。

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