SMART -向日葵突变群体和作物改良的逆向遗传工具

背景

向日葵(向日葵L.)是一种重要的油籽作物，在世界各地广泛种植。经典的遗传研究已经广泛地用于改良这种特殊的油籽作物。为此，我们在向日葵中开发了一种“化学诱导突变遗传资源，用于通过TILLING检测SNP”，以创造新的性状。

结果

为了优化EMS诱变，我们首先进行了EMS剂量范围为0.5%至3%的“杀伤曲线”分析。根据观察到的发芽率，成活率为50%即。LD₅₀，选择0.6% EMS处理8小时，产生5000 M2群体，其中4763 M3植株结实率高。对5000 M2诱变系进行表型表征，以评估诱变质量并鉴定感兴趣的性状。在M2群体中，约1.1%的植株表现出表型变异。以endo -1核酸酶为错配检测系统，结合8倍DNA池策略，构建向日葵TILLING平台。作为概念证明，我们筛选了M2群体中与脂肪酸生物合成相关的两个基因的诱导突变，法达酰基acp硫酯酶和悲伤的硬脂酰- acp去饱和酶，共鉴定出26个突变。

结论

基于的TILLING法达而且悲伤的基因方面，我们计算出总体突变率为每480 kb一个突变率，与迄今为止该作物的其他报告相似。由于向日葵是一种种子油生物合成的植物模型，我们预计所开发的遗传资源将成为鉴定向日葵作物改良新性状的有用工具。

向日葵(向日葵l)， 2n =34，属于家族菊科，估计基因组大小为3000 Mbp，是第四大最重要的油籽作物[1］．它原产于北美[2]，在世界各地广泛种植，年产量约二千四百万公吨(http://www.fao.org)．与拟南芥(125 Mbp)、水稻(430 Mbp)、高粱(750 Mbp)、大豆(1100 Mbp)或番茄(950 Mbp)等模式物种相比，这种作物的基因组大小较大(由[3.])。这种大基因组大小的主要驱动因素主要是最近的多倍体化事件和转座元件的重要扩增[2，4］．许多野生向日葵品种越来越多地被传统育种方法用于改良栽培品种[5］．随着栽培向日葵对产量等性状的持续偏选，许多赋予有用性状的等位基因丢失了。因此，在这个全球粮食危机日益加剧和气候制度不断变化的时代，创造这种作物的多样性的方法是非常可取的。几十年来，植物育种家一直致力于通过传统育种来改良向日葵，最近，分子作图已成功地用于标记辅助育种(MAS) [6］．此外，化学诱变已被育种家用于在包括向日葵在内的作物中产生变异，但这些大都局限于显性性状。因此，许多理想的隐性突变在选择过程中被遗漏了[7］．最后，像油质这样的性状是不能通过目测植物来选择的。

向日葵是世界上主要的油料种子作物之一，人们对其油脂的合成和修饰进行了大量的研究。这项研究主要集中在(i)生产更稳定的用于生物润滑的葵花籽油(高油酸含量)和(ii)增加食品工业的健康替代品[8］．的新创植物贮藏组织脂肪酸的合成是由多酶脂肪酸合成酶(FAS)复合物催化一系列酶促反应的质内合成过程。在向日葵中，质体内脂肪酸合成的主要产物是，首先是棕榈酰- acp (16:0-ACP)，它被FAS II复合物进一步拉长产生硬脂酰- acp (18:0-ACP)。反过来，这种分子是硬脂酰- acp去饱和酶(SAD)的底物，它在碳链中引入双键以产生油酰- acp (18:1-ACP)。酰基-ACP硫酯酶使ACP与酰基分子水解后，这些产物均可从质体中导出。在向日葵等高等植物中已鉴定出两种酰基- acps硫酯酶:FatA和FatB。FatA硫酯酶优先作用于长链脂肪酸，对18:1-ACP特异性特别高，对16:0-ACP和18:0-ACP亲和力较低[9］．为了满足糖果工业对饱和脂肪酸的需求，高硬脂酸含量的油主要是通过对FatA硬脂酰- acp硫酯酶和SAD硬脂酰- acp去饱和酶进行遗传修饰而开发出来的[10，11］．硬脂脂肪酸被认为是心血管中性的，不会改变人类的血浆胆固醇水平[12］．

TILLING (Targeting Induced Local lesions IN Genome)是一种检测植物中诱导和自然多态性(SNP)的技术[13］．TILLING过程的关键步骤包括种子材料的纯度、诱变质量和突变体收集的大小。TILLING依赖于一组酶，即内切酶，检测特定基因中的错配([14])。随着高通量TILLING技术的引入([15])，甚至可以检出罕见的隐性突变[16，17］．TILLING方法在创造和发现新性状方面的显著优势是，与转基因作物相比，它的产品开发成本显著降低。这使得它成为一种有吸引力的作物改良工具。随着测序技术的发展，破译snp等在物种适应反应和进化中起重要作用的微小变化成为可能[3.］．

向日葵，作为植物油和蛋白质的来源，是研究种子油质量的一个有吸引力的模型。为了研究这一性状，我们在受控条件下建立了EMS突变参考群体，并建立了TILLING平台。作为概念验证，我们筛选了两个基因的突变，法达而且悲伤的，参与了短链到中链脂肪酸的积累，并鉴定出26个诱导突变。

EMS诱变

利用BBS-1品种开发了一个由5000 M2家庭组成的相对较大的耕作资源，用于向日葵作物改良。寻找在不引起广泛不育和致死性的情况下产生最大突变密度的EMS的最佳剂量;在8小时内，对100个种子进行了不同EMS剂量(0%至3%)处理的批次的“死亡曲线”分析(表2)1)．在0.5%和0.6% EMS条件下，种子发芽率分别为54%和50%。EMS剂量大于1%时，观察到种子的严重致死率，当EMS剂量为3%时，观察到种子的总致死率。最后，0.6% EMS处理8小时，对应LD₅₀在大量种子上保留和测试。

总共有25000颗种子经过诱变并播种在花盆中，以培育培育TILLING向日葵遗传资源的苗圃。获得M1株约12500株，苗期致死率为50%。移栽后死亡率进一步提高，M1株共6500株结子，其中M1株结子良好的有5000株。M2种子采自M1单株。总共收获了5000 M2的种子库，并生产了相应的M3种子。

M2植物表型

每个M2家族在花盆中播种10粒种子，以培养苗圃并筛选视觉发育表型。4周后移栽到田间，M2植株回收率约95%。表型评分基于对每株植物的观察，以未经处理的向日葵表型为参考。表型筛选包括矮化、株高、花型、叶结构和不育性。收集的数据如表所示2。每隔一段时间拍摄照片作记录之用1)．观察到一系列表型，其中一些描述如下。与未处理的向日葵相比，分别有10株和4株表现为矮型和高型(表2)2)．其中一些矮秆植物可用于培育产量和矮秆较高的杂交种。对于花的表型，我们鉴定了12株大花头(具有增产潜力)，13株双花，8株融合和/或闭合花，3株直立花(表1)2和图1罪犯)。3个植株花色变异，1个植株种子小，3个植株盘状小花和放射状小花均缺失，不育。在57株M2植物中，占总数量的1.1%，至少表现出一种变异性状。

通过TILLING发现突变

检测这两个基因的突变，法达而且悲伤的，被用作概念证明，以确定向日葵突变集的质量和估计突变密度。这两种基因都控制短链至中链脂肪酸的产生[18，19］．SAD(硬脂酰- acp去饱和酶)控制硬脂酸的生成而不是油酸，抑制这种酶会导致硬脂酸合成增加和油酸生成减少[18］．酰基- acp硫酯酶有两种异构体FatA和FatB，它们决定了中链脂肪酸产生的长度。FatA在脂肪酸合成链终止中的控制作用[19]在本研究中使用。

我们筛选了整个外显子和启动子区域的突变法达而且悲伤的基因。如前所述，使用错配特异性内切酶ENDO1在扩增的靶标中检测到突变(图2, (20.，21])。耕作的法达产生12个独立的点突变，对应6个沉默突变，3个错义突变，1个终止密码子突变和2个启动子区突变(表3.)．耕作的悲伤的共产生14个独立的点突变，其中对应8个沉默突变和6个错义突变(表2)3.)．所有鉴定的突变均经测序确认(图3.)，正如预期的EMS诱变一样，在编码区和非编码区都发现了单核苷酸取代，并诱导了经典的EMS突变G到A和C到T(数据未显示)。

我们计算了突变频率法达而且悲伤的基因(表3.)根据Dalmais的说法et al。［20.］．我们估计SMART的平均突变密度为每480 kb一个突变。这种突变率与其他二倍体作物中报道的突变率相似(由[3.])。

在TILLING筛选中发现的大量突变，即。26个独立突变，证实开发的遗传资源是高质量的。感兴趣突变系的背景突变可以通过与亲本非突变系回交去除，清洗后的系可以作为一个品种试验后释放。由于突变已知，释放的品种可以通过标记辅助选择(MAS)在田间跟踪。本研究发现，导致STOP密码子和外显子-内含子边界剪接结点的突变具有很大的潜力。目前，生物信息学工具可用于预测非同态突变的严重程度[22］．同义替换有可能通过折叠变化来改变蛋白质的生成和功能，尽管这种事件的确切机制和频率仍然是一个谜[23］．

随着世界人口继续快速增长，未来需要具有新性状的作物品种，如改善生长和产量潜力。植物育种是一门古老的科学，在绿色革命中为提高作物产量发挥了重要作用。目前，人们对种植转基因作物和转基因技术持怀疑态度，主要是因为由于漫长的监管障碍，创造一个品种的成本很高，而突变育种几乎不存在这一点。TILLING提供了一种方法来克服与植物改良中使用的其他技术相关的问题，如RNAi、基因过表达、反义技术、锌指定向诱变、T-DNA敲除和转座子标记[3.，24］．

在自然作物群体中存在的许多涉及定性和定量参数的有用等位基因已在针对目标性状的无数轮选择中被淘汰。因此，利用诱变技术创造新的遗传资源是作物改良的有效手段。本研究采用EMS化学诱变法获得向日葵TILLING遗传资源。为了建立向日葵TILLING平台，我们在受控条件下开发了一个EMS突变体集合。对5000 M2的突变株进行表型分析，从突变株中制备基因组DNA，并将其组织在池中用于批量筛选。突变体集合表型分析表明，1.1%的突变株至少有一个性状发生了改变，证实了诱变的质量。向日葵突变体集合可用于正向遗传和反向遗传。

由于向日葵的基因组大小较大(约3000 mbp)，目前还没有对其进行测序。然而，截至今天，NCBI提供了443,858种ESTs。查普曼的研究等。［25]对栽培向日葵进行了基因组扫描，以预测参与现代栽培品种进化的基因。赖等。［26]从基因库中提交的EST信息中鉴定出的已发表的snp。因此，通过比较来自其他已测序物种的已知遗传信息，比较基因组分析可以成功地确定与该物种各种性状相关的关键基因信息。

为了验证诱变种群的质量，我们在法达而且悲伤的参与石油生物合成的基因。今天有许多其他已发表的关于作物品种中种子油成分变化的报告。例如，编码Δ12脂肪酸去饱和酶(FAD2)．筛查FAD2增加油酸的变种已在大豆中得到证实[27]和小说FAD2等位基因在花生[28]和向日葵[24］．在SMART突变群体中，突变频率估计为1/480 kb，与最近发表的向日葵突变频率报告相似(1/475，[24])和其他作物(拟南芥1/300 kb，大豆1/250 kb，水稻1/265 kb，番茄1/322 kb;由[3.])。

化学诱变和TILLING方法可以一起用于植物的开发，不仅可以提高生产力和质量参数，还可以用于植物修复[29］．耕作法已成功应用于许多作物，以获得有用的等位基因，例如在瓜和番茄中获得较长的货架期[13，30.- - - - - -33]，以改善马铃薯的淀粉品质[34]，番茄和胡椒的病毒抗性[35- - - - - -37］．目前正在对一些作物进行测序，目前已有30多种作物的序列信息，100多种作物植物正在测序(NCBI基因组计划数据库;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi)．利用候选基因多态性可以获得向日葵的许多关键增值性状。

为栽培向日葵开发了TILLING基因组资源。本文所述的高通量ADP (Allele Discovery Platform，等位基因发现平台)技术可以在人群筛选中发现具有有用突变的新突变体。通过筛选两个概念验证基因获得的结果非常有希望，并证实该群体具有良好的诱变效果。可以从开发的资源中筛选出额外的候选基因。该方法也可用于向日葵育种中MAS (Marker assisted selection)策略的标记开发。

EMS剂量的标准化及LD的测定₅₀价值

采用EMS(乙基甲烷磺酸乙酯)诱变处理的标准化方法测定LD₅₀值(导致种子萌发率降低50%的致死剂量)对向日葵品种BBS-1 (BenchBio向日葵-1)的影响。用不同EMS浓度(去离子水中0 ~ 3%)处理100颗种子8小时，进行了致死曲线分析。然后将种子彻底清洗，转移到湿纸巾上，并在22°C的生长室中保存，光周期为12小时。该分析共进行了三次。

最后选择最优条件(0.6% EMS, 8小时)，用EMS诱变25000颗M1种子。种子在BenchBio 1-3田播种，间距为60 cm × 45 cm。M1植株的种植遵循了标准的栽培方法。开花前用布袋覆盖花序，鼓励自花授粉。成熟的种子头被仔细标记，并从单株植物上收集。M2种子采收，包装，冷藏(8°C, 45-50% RH)。

基因组DNA提取

每M2科在温室内的小盆中播种10粒种子，每M2科从8株单株的第3和第4叶中收集叶片材料，发芽3周后，在96孔板中，每孔含有2个钢珠(4毫米)。使用定制的珠磨机研磨组织[38］．使用Dneasy 96 Plant Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取大约100 mg基因组DNA。提取的基因组dna在1%琼脂糖凝胶(HiMedia，印度)上运行以检查质量。基因组DNA样品的数量和纯度由1770紫外分光光度计(岛津株式会社，日本)确认。将单个DNA浓度归一化至40 ng/ul，然后用于制备用于TILLING筛选的8倍池化板。

PCR扩增和突变检测

PCR扩增基于巢式PCR。第一次PCR扩增是使用目标特异性引物的标准PCR反应(表1)4)和4 ng向日葵基因组DNA。第一次PCR取1 μl作为模板，用IRD700和IRD800红外染料分别在5 '端和3 '端标记特异性引物，进行第二次嵌套PCR扩增(表2 - 1)4),分别。突变检测如前所述[31］．通过测序确定突变的身份。TILLING要求应提交给通讯作者。

正向遗传筛选(FGS)

每个M2家族中有5颗种子在发芽后4个月在田间成熟并进行了与产量和植株结构相关的性状的表型分析。从每株M2植物中收集M3种子并进行包装。并对M2可育株数进行了评价。

我们要感谢Shroff家族，以及Shroff家族基金的财政支持和鼓励。作者要感谢JRF董事、Sudhansu Gupta先生和Bipin Parmar先生的行政支持。拉尔曼·保罗先生和桑杰·帕玛尔先生感谢他们在培育变异种群和照顾植物方面的支持。

作者指出

从属关系

1. Bench Bio私人有限公司，c/o Jai研究基金会，Vapi，古吉拉特邦，396195，印度

   Anish PK Kumar, Anjanabha Bhattacharya, Seema Parikh, Nirali Desai和Manash Chatterjee

2. INRA, UMR1165 Unité de Recherche en Génomique Végétale URGV，埃弗里，F-91057，法国

   Adnane Boualem & Abdelhafid Bendahmane

3. UEVE, UMR Unité de Recherche en Génomique Végétale URGV，埃弗里，F-91057，法国

   Adnane Boualem & Abdelhafid Bendahmane

4. CNRS, ERL8196 UMR Unité de Recherche en Génomique Végétale URGV，埃弗里，F-91057，法国

   Adnane Boualem & Abdelhafid Bendahmane

5. 生物技术研究中心，Nutrisun事业部- Advanta Semillas SAIC, Belcarce，阿根廷

   Andres Zambelli & Alberto Leon

6. 爱尔兰戈尔韦国立大学(NUIG)，爱尔兰戈尔韦

   Manash Chatterjee

相应的作者

对应到Manash Chatterjee。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

PKAK启动EMS诱变和标准化实验，TILLING和维持TILLING种群(MTP);ABo协同实验，发起正向遗传筛选，参与生物信息学分析，认真编辑稿件;ABh起草MS，参与突变体集合表型分型;SP、ND进行TILLING和生物信息学分析;AZ和AL为待TILLed基因提供了关键输入;MC, AB构思了这项研究，协调了实验，并仔细编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Anish PK Kumar, Adnane Boualem对这项工作做出了同样的贡献。

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