采后热处理增强柑橘果实抗病性的比较蛋白质组学和代谢组学分析

背景

从田间收获到消费者的餐桌，新鲜柑橘水果在运输和储存上花费了相当多的时间。在此过程中，生理性疾病和病理性疾病是导致果实损失的主要原因。在采后贮藏过程中，热处理已被广泛用于维持果实品质;然而，目前在系统生物学水平上与这种治疗相关的分子信息有限。

结果

成熟的“龟井”萨摩柑(柑橘unshiu选择Marc.)果实进行采后贮藏过程中HT诱导的抗病性机制研究。基于二维凝胶电泳(2-DE)进行蛋白质组学分析，基于气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱四极杆飞行时间质谱(LC-QToF-MS)进行代谢组学研究。结果表明，高温处理后果皮抗性相关蛋白如β - 1,3 -葡聚糖酶、III类几丁质酶、17.7 kDa热休克蛋白和低分子量热休克蛋白均上调。热处理后果皮氧化还原代谢酶，包括异黄酮还原酶、氧化还原酶和超氧化物歧化酶均下调。初步代谢分析显示，热处理后果皮有机酸和氨基酸水平下调;但代谢产物，包括十四羧酸，油酸，鸟氨酸，2-酮-d-葡萄糖酸，琥珀酸，松糖，蔗糖，半乳糖，肌醇，葡萄糖和果糖的显著积累被检测到。值得注意的是,小时₂O₂与对照相比，热处理果皮中木质素含量降低，而木质素含量增加，这可能提高了果实对外界胁迫的抗性。此外，黄酮，一种众所周知的有效减轻外部压力的物质，在热处理的果皮中被上调。

结论

本研究为采后柑橘果实蛋白质和代谢物的差异积累提供了一个广泛的图景，并为HT改善“龟美”萨摩柑贮藏期间的果实抗病性提供了新的见解。对蛋白质和代谢产物的分析表明，活性氧(ROS)和木质素在热处理诱导果实抗病性和生理紊乱中起重要作用。

新鲜的柑橘类水果，从收获到人类消费，需要很长一段时间的运输、储存和销售。在此期间，水果的主要损伤来自生物疾病和物理损伤。储存前处理，如生物或非生物类型学处理，可用于抑制疾病和延长货架寿命。在现有的各种治疗类型中，热处理以前曾被报道诱导苹果、柑橘、葡萄、桃子、梨和芒果对多种病原体的抗病能力[1- - - - - -3.］．

在水果工业中，热水处理是另一种物理处理方法，自1922年以来一直用于柑橘类水果的储存[4］．最近，一些国家已广泛采用热风和热水系统，以抑制水果采后腐烂和减轻贮藏期间的冷害。热处理(HT)的优点是最大限度地减少果皮表面感染，而不会留下任何化学残留物[5］．HT可以通过热杀死致病生物或抑制病原菌丝生长、清除表面昆虫和改变表皮蜡质结构来防止植物病原体和疾病的发展[6］．HT还可增强冷敏感品种果实的抗寒性，有助于果实在冷藏过程中保持品质，延长保质期[7］．除了控制致病生物外，HT还可以通过改变内部果皮的物理特性来减少疾病。例如，HT不仅延缓了果实的成熟和着色，抑制了果实的软化，还减缓了乙烯的产生[3.]，增加果实硬度，增加多酚类物质、类黄酮和多巴胺含量[6- - - - - -8］．然而，对在应对微生物攻击中活跃的调控基因了解较少，也没有详尽的代谢组学资料详细描述热处理果皮的变化。

在过去的几十年里，研究人员越来越重视热处理水果基因表达的研究。Sapinitskayaet al。［9]报道了高温激活应激基因和脂质修饰基因以应对冷胁迫，如谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶、脱氢酶、热休克蛋白(HSP)、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、脂肪酸去饱和酶和脂质转移蛋白。一些科学家发现高温诱导苯丙氨酸解氨酶，积累苯丙类化合物，这些化合物在热诱导的水果抗性中起着至关重要的作用[2］．迪克森et。［10]研究了苯丙类化合物在植物中参与防御基因诱导的局部和系统信号传导的功能。然而，关于哪一类苯丙类化合物在防御功能中起核心作用的信息很少，关于在对HT的反应中协调苯丙类防御快速诱导的调节基因的信息就更少了。蛋白质组分析揭示了热休克蛋白、过敏原蛋白、脱氢蛋白和其他参与应激反应的蛋白质的诱导。高温胁迫对桃多酚氧化酶的抑制可能是桃果实抗低温胁迫的分子基础[3.］．然而，很少有与HT有关的蛋白质能诱导果实，特别是柑橘类果实，抵抗变质。

此外，蛋白质组学分析和代谢谱分析方法使蛋白质组和代谢组水平的整体变化的比较并行分析成为可能，有助于理解特定蛋白质的变化和代谢产物在响应HT时的后续变化之间的关系。在本研究中，“龟井”萨摩柑(柑橘unshiuMarc.)收到HT。采用双向电泳(2-DE)、气相色谱-质谱(GC-MS)和高效液相色谱/电喷雾电离飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS)进行蛋白质组学分析和代谢谱分析(初级代谢组和次级代谢组)。完成全面的生理生化分析。研究结果为提高热处理果皮的抗病性提供了新的理论依据。

萨摩柑是中国、韩国和日本等东亚地区的主要柑橘作物之一。然而，该品种的耐贮藏性较差，主要原因是它容易受到生物胁迫和物理损伤。HT有效地提高了果实的抗逆性和抗逆性，抑制了果实采后腐烂。在本研究中，HT水果在52°C的温水浴中浸泡2分钟，对照水果在25°C的水浴中浸泡2分钟。处理后的果实存放在通风的仓库中(储存温度:12-16°C;相对湿度:90-95%)。分别于处理(DAT)后2 h和1、2、3、4、6、9、12、16、20、24、28、32、38、44、50、60天采集样品，用于进一步分析。

HT对果实质量的影响较小，但对果实质量无显著影响

水果的品质直接决定其商业价值。研究了HT对果实质量的影响，包括失重、呼吸速率和可溶性固形物含量。与对照果皮相比，热处理果皮在贮藏期间的失重显著增加(图1A)，但在整个贮藏期间，HT与对照果实的呼吸速率和可溶性固形物含量均无明显变化(图1B, C)。可溶性固形物含量是衡量水果内部品质的一个众所周知的标准，而呼吸作用是衡量水果耐贮藏性的重要标准，可溶性固形物含量和呼吸作用的微小变化说明热处理对果肉品质没有影响。

HT抑制青霉菌果皮萌发

采用蓝模进行人工接种试验青霉菌italicum以评估HT对水果对生物胁迫的反应的影响。接种4 d后，HT果实果皮上萌发的孢子很少，但约90%的对照果实在接种部位表现出典型的蓝霉病发展症状(图2)2A).从发病率来看，接种后4 ~ 7 d，对照果实的发病率显著高于HT果实(图2B);接种后4 ~ 7 d，对照果实的病变直径显著高于HT果实(图2C).基于以上实验，HT有效地抑制了青霉菌果皮。

HT柑桔果皮蛋白质差异积累

为了探究HT与对照在同一时期蛋白表达的差异，我们在1、6、12和32天后对“龟美”萨摩柑果皮进行了分析。经过2-DE分析，可重复检测到600多个蛋白点(图3.)．蛋白质相对丰度用PDQuest 2-D软件version 7.4获取。只有在四个独立重复中重复观察到蛋白斑点时，才对其进行评分。数据归一化为相应凝胶上所有点的总密度的百分比。采用1.5倍比较分析和单因素方差分析(ANOVA)进行比较分析。结果表明，在同一贮藏时间内，HT处理与对照相比，只有50个蛋白斑点的丰度发生了至少1.5倍的变化。其中37种是使用Applied Biosystems 4800基质辅助激光解吸/电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF MS)基于胰蛋白酶肽序列确定的(图3.、表1)．根据之前报道的这些蛋白质的功能，将它们分为五类(表1):糖酵解和TCA循环(9种蛋白质，24%)、氧化还原调节(9种蛋白质，24%)、应激反应(7种蛋白质，19%)、其他代谢(6种蛋白质，16%)和蛋白质折叠(6种蛋白质，16%)。

HT柑桔果皮代谢产物积累差异

研究了HT与对照果皮代谢组成的差异积累代谢物。用GC-MS和HPLC-QTOF-MS测定生化变化。使用甲醇萃取对非极性和极性提取物进行平行分析，可以检测出大量不同类别的化合物。

使用GC-MS在相同的样本集中监测了62种确定的代谢物，主要包括醇、氨基酸、糖、有机酸和脂肪酸。在用方差分析进行显著性分析后(P<0.05)，在热处理果皮中检测到45种代谢物，主要是有机酸、糖和氨基酸，与相同贮藏期的对照组果皮相比，有显著的上调/下调(表2)2)．

GC-MS代谢物分析(初级代谢物)使用HPLC-QTOF-MS分析主要是次级代谢物。对大量信号数据进行统计滤波，估计热处理果皮中上调/下调代谢物的数量。经MS/MS分析，共发现58种代谢物被显著调控(2倍;P与对照果皮相比，热处理果皮在同一贮藏期间的代谢产物含量< 0.05)，并鉴定出27种这些代谢产物(表53.)．HPLC-QTOF-MS技术检测到的代谢物主要为多酚类和类黄酮类物质(表1)3.)．

HT可上调柑橘果皮应激反应蛋白

在疾病反应中，HT诱导β - 1,3 -葡聚糖酶(H25)和III类几丁质酶(H20)在果皮中积累(表2)1)，这些蛋白质参与降低植物的抗逆性。在胁迫响应中，高温胁迫上调了果皮中17.7 kDa的热休克蛋白(H22)和低分子量热休克蛋白(H24)的积累，尤其是在贮藏早期(表2)1)．此外，与对照果皮相比，热处理果皮在同一贮藏期间积累了更多的其他蛋白质，这些蛋白质可能间接参与了果实的应激反应，包括丙酮酸脱氢酶E1 β亚基异构体2 (H7)、叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶(H18)、ATP合成酶β亚基(H36)、无机pyro磷酸酶、异黄酮还原酶相关蛋白(H10)和细胞质苹果酸脱氢酶(H4)。表1)．

HT下调了柑桔果皮活性氧代谢相关蛋白

HT下调活性氧代谢相关蛋白，特别是在贮藏后期(表2)1)，包括氧化还原酶、锌结合脱氢酶家族蛋白(H11)、推定的NAD(P)H氧化还原酶、异黄酮还原酶(H12)、aldo/keto还原酶家族蛋白(H13)、铜/锌超氧化物歧化酶(H16)和推定的NAD(P)H氧化还原酶、异黄酮还原酶(H17)。此外，热处理果皮中其他蛋白质(相对于对照)也下调，如三磷酸异构酶、胞质(H5)、脱落胁迫成熟样蛋白(H19)和噻唑类生物合成酶、叶绿体前体(H30)。此外，一些蛋白质在热处理果皮中(相对于对照组)仅在实验中期出现上调，包括磷酸甘油酸激酶，推测的(H2)，丙酮酸脱氢酶E1 β亚基异构体2 (H7)，多酚/酮还原酶家族蛋白(H13)，线粒体加工肽酶(H15)，推测的无机焦磷酸酶(H29)。假设ATP合酶β亚基(H36)在热处理后的心包中(相对于对照组)最终上调，但在开始时下调。

HT增加了柑橘果皮中糖和类黄酮的含量

HT和对照果皮的主要代谢物分析显示，在整个储存阶段，一组代谢物发生了显著变化(表2)2)，主要包括糖和脂肪酸。有趣的是，在高温处理后2 h，果皮中多种糖的含量(相对于对照)增加，但在贮藏后期下降到与对照相同的水平，如半乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和4-酮-葡萄糖。在整个贮藏过程中，热处理果皮的一些初级代谢产物(相对于对照)含量增加，包括油酸、十四酸和鸟氨酸(表2)2)．

对HT和对照果皮的次生代谢物分析显示，在贮藏的某些时期，热处理果皮中的一组代谢物(相对于对照)增加，包括槲皮素-二己糖-脱氧己糖、橘皮素、羟基苯甲酸己糖、柚皮素、柚皮素查尔酮己糖、香草酸、diosmin、芦丁和异樱草素，这些都可能在应激反应中发挥重要作用。

HT降低了有机酸、氨基酸和苯丙类化合物的含量

初步代谢分析显示，与对照果皮相比，热处理果皮的有机酸、脂肪酸和氨基酸下调，特别是在热处理后2小时。与对照组相比，热处理后2 h果皮中5种有机酸(柠檬酸、苹果酸、4- n -三甲基硅甲基氨基丁酸、草酸和GABA)水平均有所下降(表2)2)，但在32 DAT时，10种有机酸的水平在热处理果皮中(相对于对照组)有所增加2)．热处理后2 h, 10种氨基酸含量在热处理果皮中低于对照，32 d时只有5种氨基酸含量在热处理果皮中低于对照，而32 d时有2种氨基酸含量在热处理果皮中高于对照(表2)2)．与有机酸相比，热处理2 h后果皮中4种脂肪酸含量均较对照降低;与对照组相比，在32 DAT时，热处理果皮中三种物质的含量增加(表2)2)．这是常有的事;高温处理2 h后，果皮中多种有机酸、氨基酸和脂肪酸含量较对照组下降，而32 DAT时，果皮中多种有机酸、氨基酸和脂肪酸含量较对照组升高。与糖浓度的增加相比，似乎在HT的驱动下，有机物、氨基酸和脂肪酸突然转变为糖;此外，在贮藏后期，与对照相比，经过热处理的果皮中多种类型的有机、氨基酸和脂肪酸的水平有所增加。

利用HPLC-QTOF-MS对诱导热处理果皮耐药的化学物质进行了进一步的代谢表征。木质素合成的前体物质阿魏酸、辛酸、肉桂酸和咖啡酸在热处理后的果皮中含量明显低于对照果皮，特别是在热处理2 h和12 d时。另外，热处理后果皮中羟基化柚皮素己糖、苦参黄素、对香豆酚基奎宁酸、阿魏酰奎宁酸、泛酸己糖、槲皮素-二己苷、碘二醇-二己苷、茉莉酸等次生代谢产物的含量也有所下降，尤其是在2 h或12 d时。

HT降低H₂O₂柑橘果皮含量

H的含量₂O₂在贮藏阶段，热处理果皮中H₂O₂在对照果皮中增加(图4A).这说明HT降低了H的含量₂O₂果皮中H₂O₂与对照果皮相比，热处理果皮在贮藏过程中含量较低。

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)在脱氧过程中起重要作用₂O₂．在本研究中，POD活性在HT和对照之间没有明显变化(图4C). 6 DAT时，热处理果皮中SOD活性高于对照组，但12和32 DAT时，热处理果皮中SOD活性低于对照组(图4D).因此，与对照组相比，热处理果皮中SOD活性在整个贮藏期间波动较大(图4D)。

在氧化还原调控方面，与对照果皮相比，热处理果皮中大部分蛋白质下调，尤其是在贮藏后期(表2)1)．这表明热处理果皮在贮藏过程中氧化还原反应较弱。

高温处理提高了柑橘果皮硬度和木质素含量

果实在贮藏过程中硬度逐渐降低(图5一个);然而，HT增加了果实的硬度，特别是在1dat时(图5A)，这导致热处理后的水果在整个贮藏期间都比对照的水果更紧实。木质素是影响果实硬度的重要成分。因此，用处理后2 h和1、6、32 DAT的样品检测木质素含量随时间的变化。结果表明，HT显著诱导木质素在果皮中的积累(图5B).另外，木质素合成的关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)在热处理果皮1 DAT时活性开始升高，但随后降至与对照相同的水平(图4B).此外，与对照果皮相比，热处理果皮中木质素合成前体阿魏酸、辛酸、肉桂酸和咖啡酸的水平下降(表2)3.)．这说明高温处理后的果皮中阿魏酸、辛酸、肉桂酸和咖啡酸迅速向木质素转化。

HT提高了果实的抗病性，但对果实品质没有负面影响

物理处理经常用于保持水果新鲜，包括微孔膜、贮藏前处理(出汗)、紫外线照明、射频处理、热处理(热疗法)和其他贮藏技术。采后热处理，如热水处理和热风处理，提供了一种检疫，抑制病原体的发展，提高果实对冷敏感品种的抗寒性，并有助于保存贮藏期间的果实质量和延长保质期[7］．本研究中，HT能有效抑制病原菌的生长。此外，高温(52°C, 2分钟)在统计学上显著降低了冷伤的发生率[9，11］．一个lso, postharvest HT had no obvious negative effects on fruit flesh quality during subsequent storage. This suggests HT increased the ability of fruit to tolerate storage stress without affecting their commercial qualities, and shows strong potential application in the citrus industry.

HT诱导应激反应蛋白

HT可有效抑制水果冷藏过程中的冷害[12］．HT后，部分蛋白表达上调，部分蛋白表达下调。这些上调的蛋白质可能是热诱导的果实抗性的原因。有趣的是，在贮藏期间，部分蛋白质在高温处理后1 d上调，而降低到之前的对照水平。这些类型的蛋白质可能只是参与了对HT的反应，但在水果抗病性中起不到至关重要的作用。这些蛋白在整个贮藏期都处于上调状态，可能直接参与了果实抗病性的形成。

在本研究中，热处理果皮的热休克蛋白(HSP) 17.7、假定的HSP 70和低分子量HSP在整个贮藏期间均高于对照组(表2)1)．热休克蛋白由一个多基因家族编码，位于不同的亚细胞区室[13］．这些分子伴侣通过重建正常的蛋白质结构来保护植物免受胁迫，从而帮助维持细胞内稳态，发挥着至关重要的作用[14］．非生物应激通常会导致蛋白质功能障碍;因此，维持蛋白质的功能配置并防止非原生蛋白质的聚集对于细胞在应激下的生存尤为重要[14］．HSPs在细胞过程中负责蛋白质折叠、组装、易位和降解。热休克蛋白还可稳定蛋白质和细胞膜，并可在应激条件下协助蛋白质重新折叠[15］．我们的结果表明，HSPs在降低HT果实对生物和非生物胁迫的敏感性方面起着至关重要的作用。

HT显著抑制贮藏过程中病原菌的发育和果实腐烂[16］．热处理果实几丁质酶和β- 1,3 -葡聚糖酶均有上调;长期以来，人们一直认为这些酶在水果抗真菌防御中很活跃。发病相关(PR)蛋白被分为五类，其中两类含有β- 1,3 -葡聚糖酶和几丁质酶[17］．几丁质酶催化几丁质水解，几丁质是n -乙酰d -葡萄糖胺的β- 1,4连接聚合物，是大多数植物致病真菌细胞壁的主要成分[18］．几丁质酶和β- 1,3 -葡聚糖酶粗蛋白提取物可有效抑制真菌活性[19］．此外，β- 1,3 -葡聚糖酶和几丁质酶被认为有助于提供的抗性水平，并已知抑制多种真菌病原体的菌丝生长[20.］．这说明β- 1,3 -葡聚糖酶和几丁质酶直接参与了高温诱导的果实抗病过程。

HT增加了应激反应代谢产物的含量

初级代谢产物直接参与正常的生长、发育和繁殖。在本研究中，热处理果皮在贮藏过程中鸟氨酸、油酸和十四羧酸含量较对照增加，热处理果皮在贮藏2 h后7种糖类含量较对照增加(表1)2)．在植物中，鸟氨酸是合成多胺和生物碱所必需的，这些多胺和生物碱有助于植物在严重水分胁迫下的抗氧化应激[21］．

类黄酮是一种重要的防御性化合物，可以作为植物原素或植物抗毒素，保护水果免受病原体的侵袭[22］．经热处理的果皮中黄酮类化合物(与对照组相比)被观察到上调，包括槲皮素-二己糖-脱氧己糖、橘皮素、柚皮素、柚皮素查尔酮-己糖、羟基苯甲酸-己糖、异樱素、diosmin和芦丁，它们可能在应激反应中发挥重要作用[23］．芦丁是一种具有较强抗氧化活性的生物类黄酮，对病原菌具有抗菌作用，可减少病原菌的分生孢子萌发和附着胞形成[22］．槲皮素通过阻断环加氧酶和脂加氧酶途径保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡[24］．槲皮素具有抗氧化应激的保护功能，可减少H₂O₂治疗(25］．此外，富含槲皮素的植物提取物已作为一种有趣的资源应用于功能性食品和其他用于降低老年性黄斑变性风险的食品[25］．根据体外研究，橙皮苷是一种抗氧化剂，而且橙皮苷还提供强大的细胞抗氧化保护，以抵御应激引起的损伤作用[26］．薯蓣皂苷、橙皮苷和柚皮苷是天然存在于柑橘类水果中的类黄酮苷;它们具有多种特性，如抗氧化和清除自由基[27］．有趣的是，柚皮素和芦丁不仅参与应激反应，而且被认为是信号分子[23］．

HT诱导了果实对病原菌的抗性，提高了木质素含量

苯丙类化合物在植物防御中的功能包括从预先形成或诱导形成的物理和化学屏障来抵御感染[10］．防御功能并不局限于某一类苯丙类化合物，而是存在于单木质素的木质化过程中[28］．在本研究中，HT降低了木质素合成所需的前体(阿魏酸、辛酸、肉桂酸和咖啡酸)的水平，但增加了木质素含量(表2)3.,图5)．木质素是次生细胞壁的主要成分之一，为细胞提供机械支撑和隔离环境。在植物中，细胞可以感知细胞壁聚合物结构，从而激活跨质膜传感器蛋白，这可能引发一系列与其他途径交织的信号转导事件，这些信号转导事件可能通过激活或抑制特定转录因子以及影响基因表达和蛋白质功能的翻译后控制来调节细胞功能[29］．如果细胞壁受损，细胞会对入侵的疾病有机体做出一系列反应，这可能会对水果质量产生负面影响。HT诱导木质素的积累使细胞壁增厚，形成对病原体的有效物理屏障，延缓疾病生物的入侵。此外，HT增加了果实的硬度;这可能是HT诱导木质素使果实细胞壁增厚的结果。

HT降低了H的含量₂O₂

HT是提高柑橘贮藏性的有效方法。在储存过程中，水果会受到各种生物和非生物环境的胁迫。所有这些压力都可能导致活性氧(ROS)的产生。为了避免ROS的积累而导致细胞死亡，植物通过上调酶促和非酶促抗氧化剂来清除ROS，减轻其负面影响[30.］．本研究中，HT下调了H .₂O₂果皮含量，与HT对酵母细胞的作用一致。在应激反应中，HT酵母细胞比未处理的细胞积累较少的ROS [31］．

此外，异黄酮还原酶(IFR)作为一种抗氧化剂可能有重要作用[32］．IFR是一种参与异黄酮植物抗毒素产生的酶，它在应对致病性攻击、真菌激发子和生物应激时积累[33］．异黄酮类化合物是重要的次生代谢产物。金et al。［32]报道称，异黄酮还原酶样基因可能通过产生抗氧化化学物质来抑制ROS的升高。在这项研究中，与对照果皮相比，异黄酮还原酶(H10)在热处理果皮中表达上调1)，这可能是导致H降低的另一个因素₂O₂与对照果皮相比，热处理果皮对病原体的抗性水平更高。

抗坏血酸过氧化物酶清除H₂O₂在细胞的特定细胞器中[34］．此外，Cu/Zn-SOD是sod的主要细胞亚型，sod通过H . c歧化在抗氧化防御系统中发挥关键作用₂O₂［34］．这两者都可以防止ROS对细胞膜的破坏，并在生物暴露于氧化应激时作为主要的防御机制。这些蛋白质被认为是保护细胞免受氧化损伤的主要酶和非酶系统，并负责抗病性。在应对生物应激时，这些蛋白质也作为抵御病原体引起的氧化应激的主要防御机制，因此可以防止ROS对细胞膜的破坏。但是，与对照果皮相比，热处理果皮中POD和SOD的活性并没有升高，这可能是由较低的H引起的₂O₂热处理果皮中的含量。此外，与对照果皮相比，热处理果皮中其他参与清除ROS的蛋白，包括氧化还原酶(H11)、氧化还原酶(H12, 17)、多酚/酮还原酶(H13)、2-氧酸脱氢酶(H14)、超氧化物歧化酶(H16)均下调。这表明，HT通过降低果实H含量，诱导了一定程度的抗病性₂O₂含量和通过下调清除活性氧酶。

糖、有机酸和氨基酸在提高贮存性中的作用

在本研究中，初级代谢产物的谱图显示，在贮藏的早期阶段，HT诱导了糖的积累(表2)2)．可溶性糖，特别是蔗糖、葡萄糖和果糖，在水果受到胁迫时积累，积累的可溶性糖在水果对许多应激源的反应中起着明显的至关重要的作用[35］．可溶性糖不仅作为营养物质和代谢物，还作为信号物质参与氧化还原稳态的改变[36］．然而，关于其他糖，特别是阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和核糖，如何参与应激反应的信息却很少。

此外，初步代谢数据显示，在本研究中，HT降低了有机酸和氨基酸含量，特别是在处理后2小时。虽然有机酸和氨基酸在细胞和整个生物水平的能量和代谢中起着明显的中心作用，但在热处理的果皮中，似乎有一个从有机酸和氨基酸到糖的快速转换。然而，我们对在应激反应期间有机酸和氨基酸水平的下降知之甚少，需要进一步的研究来验证这种反应。

这项研究为蛋白质和代谢物的差异积累提供了一个广泛的图景，并为HT如何在随后的柑橘水果贮藏中增加水果抗逆性提供了新的见解。在代谢底物中，次生代谢产物的向上积累对提高果实应对胁迫的能力起着至关重要的作用。类黄酮直接参与对外部压力的反应。木质素升高，H降低₂O₂HT的含量可能增加了果实对外界胁迫的抗性。

样品收集

“龟井”萨摩国语(柑橘unshiuMarc.)的果实于2009年10月在中国湖北省宜昌市的一个果园收获，收获时已达到商业成熟期(果实颜色已完全变成橙色，可溶性固形物含量接近9%)。选择大小和颜色一致、没有明显损伤或瑕疵的水果进行实验。300公斤水果被分成两等份，150公斤用于高温处理，另外150公斤用于对照。处理后的果实存放在通风的仓库中(储存温度:12-16°C;相对湿度:90-95%)。分别于2 h及1、2、3、4、6、9、12、16、20、24、28、32、38、44、50、60 DAT采集样品。果皮沿每个果实的赤道面取样;选择30个水果作为一个样品，在液氮中研磨成粉末，然后在-80°C保存以供进一步分析。

热处理(HT)

经过热处理的水果在52°C的温水中浸泡2分钟，对照的水果在25°C的水浴中浸泡2分钟。处理后的水果在取样前被风干并储存在通风的仓库中。

水果品质测定

检查水果的体重减轻(%)，呼吸频率(mg kg¹h¹)和总可溶性固形物(TSS，%)在1、2、3、4、6、9、12、16、20、24、28、32、38、44、50和60 DAT。重量采用电子静压天平(型号:MP31001，上海赛龙科学仪器有限公司，中国上海)测量，精度为±0.01 g。采用红外气体分析仪(型号:GXH-305H，北京均方理化科学技术研究所，中国)测定果实呼吸速率。TSS用折光计(型号:Pocket PAL-1, Atago公司，东京，日本)根据制造商说明测定。

柑桔损伤果实中HT的抗真菌测定

蓝霉(青霉菌italicum)作为评价处理后果实对真菌感染抗性的指标。各处理150个果实接种真菌。用无菌钉在果实赤道处形成一个均匀的病变(3毫米深，4毫米宽)。10 μl悬液p . italicum在1×10⁵孢子毫升¹分别接种在每个伤口部位。真菌接种后的果实存放在相对湿度为95%的贮藏室中;在接种后1、2、3、4、5、6、7 d检测疾病发病率。根据以下公式记录疾病发病率和病变直径:

二维凝胶电泳和MAILDI-TOF/TOF

1、6、12和32 DAT的样品根据Isaacson描述的方法进行总蛋白提取et al。［37］．然后将沉淀物氮气干燥并溶解在含有8 M尿素、0.2% (w/v) Bio-Lyte、4% CHAPS、65 mM DTT的裂解缓冲液中。使用Bio-Rad蛋白检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories Inc.， Hercules, CA, USA)基于Bradford方法，以BSA为标准测定蛋白浓度。在云法的基础上进行二维凝胶电泳和凝胶染色et al。［38］．染色凝胶用UVP成像仪(Bio-Rad)在“反式白”模式下使用PDQuest 2d分析软件7.4版(Bio-Rad)成像。基于Yun方法完成蛋白斑点匹配和差异蛋白斑点分析et al。［38］．通过与标记物的比较，测定了蛋白质的等电点和分子量。

如Yun所述，使用4800蛋白组学分析仪MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行凝胶内消化和蛋白质鉴定et al。［38］．然后将MS/MS数据提交到MASCOT程序中，根据绿色植物数据库进行蛋白质鉴定。以下是搜索参数:胰蛋白酶酶，一个缺失的裂解，固定修饰的氨基甲基(C)，片段质量耐受±0.5 Da，可变修饰的氧化(Met)，肽耐受100ppm，肽电荷为1+。只有多肽的MS/MS结果P置信< 0.05被接受。

主要代谢图谱

在2小时、1、6和32天后收集的样品用于差异初级代谢谱分析。如Roessner-Tunali所述，300 mg样品在2700 μl甲醇中提取et al。［39］．300 μl 0.2 mg ml¹在水中加入瑞比醇作为定量内标。衍生化反应是根据张的方案进行的et al。［40几乎没有修改。提取液在50 μl或20 mg ml中孵育¹盐酸甲氧基胺在吡啶中50°C浸泡30 min，然后用50 μl BSTFA(含1% TMCS)在60°C浸泡40 min。每个样品(1 μl)通过熔融二氧化硅毛细管柱(30 m × 0.25 mm i.d, 0.25 μm) DB-5 MS固定相注入气相色谱系统。喷射器温度为250℃，载气流量1.0 ml min¹．柱温保持在100℃1 min;以每分钟3℃的速率增加到184℃¹，以0.5°C min的速率增加到190°C¹，在15°C min时增加到280°C¹．载气氦气(99.999%)的流速为1ml min¹．MS工作参数如下:电离电压，70 eV(电子撞击电离);离子源温度200℃;界面温度250℃。扫描模式下，TIC(总离子电流)谱记录在45-600原子质量单位的质量范围内。

二级代谢分析

2 h、1、6和32 DAT的样品使用HPLC-MS进行二级代谢谱分析。用甲醇提取300 mg干粉，混合物经0.22 mm聚四氟乙烯膜过滤器过滤。

代谢物分析使用QTOF 6520质谱仪(安捷伦科技公司，帕洛阿尔托，加州，美国)与Page描述的1200系列快速分辨HPLC系统耦合进行et al。［41］．取2 μl样品提取物装入Zorbax Eclipse Plus C18 1.8 μm, 2.1 × 100 mm反相分析柱(Agilent Technologies)。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈水溶液。采用以下梯度:0 min ~ 10% B;20 min-95% B;22 min-95% B;22.1 min-10% B;B.流速为0.3 ml min¹柱温保持在35℃。电喷雾电离源条件为:气体温度350℃，干燥气体流量10 l min¹雾化器压力为40psig。正离子模式和负离子模式下毛细管电压均为3.5 kV。破碎器电压为135v，撇渣器电压为65v。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性测定

分别于1、6、12和32 DAT采集的样品用于酶活性测定。将5 g样品均质于25 ml 0.05 M硼酸钠缓冲液(PAL的pH为8.8，含有5 mM β-巯基乙醇)和25 ml冰水100 mM磷酸钠(POD和SOD的pH为7.8，含有0.5 g聚氯乙烯聚吡啶烷酮)中。PAL活性是通过在30°C下测定肉桂酸在290 nm处30分钟内的吸光度来确定的[42］．以愈创木酚为底物，分析POD活性[43］．采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，以硝基蓝四唑为超氧自由基产生指标[44］．

测定H₂O₂在果皮上

根据Patrick和Wagner的方法，在2小时、1、6和32天后收集的样品用于测量过氧化氢水平[45作了一些修改。简单地说，剥皮组织(0.5 g)在液氮中研磨，并在5毫升生理盐水中均质。然后将样品置于超声浴中15分钟，并在6,000 g下离心20分钟。上清液(50 μl)加入0.5 ml溶液I中，37°C水浴加热10 min，再加入0.5 ml溶液II。测定了混合物在405 nm处的吸光度，并测定了H₂O₂在每个样品中通过与标准校准曲线的比较来计算。

水果硬度的测定

分别于2 h、1、6、32 DAT采集样品，测定果实硬度。测量了18个水果，每个水果都在赤道平面周围的三个不同位置测量。硬度用直径4 mm的水果硬度计(GY-B，吉林，中国)测量，用N cm表示²去除3个最大和3个最小的测量值后，使用每个水果的平均值进行进一步分析;使用学生t检验对每个样本进行12个重复的比较统计分析(P< 0.05)。

果皮中木质素的测定

分别于2 h、1、6、32 DAT分别测定果实木质素含量。用Lei描述的方法测定木质素水平et al。［46］．

统计分析

实验设计完全随机化，重复次数超过3次。2-DE、GC-MS、HPLC-MS、H₂O₂含量、木质素含量及酶活性测定。12个重复完成，以测量体重减轻、呼吸速率、总可溶性固形物和果实硬度。使用学生t检验对每个样本的数据进行统计分析(P< 0.05)。

二:

双向凝胶电泳

气相:

气相色谱-质谱联用

HSP:

热休克蛋白

HT:

热处理

仪表:

异黄酮还原酶

LC-QTOF-MS:

液相色谱四极杆飞行时间质谱法

MALDI-TOF女士:

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间串联质谱

NCBI:

国家生物技术信息中心

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyase

圆荚体:

Peroxidise

公关:

Pathogenesis-related

ROS:

活性氧

SOD:

超氧化物歧化酶

TSS:

总可溶性固形物。

感谢华中农业大学邝汉辉教授对稿件的修改。华中农业大学科技自主创新基金、国家自然科学基金(NSFC No. 31271968)、教育部重大专项(311029)、国家现代农业(柑橘)技术体系(cnt)资助。CARS-27)。

作者指出

从属关系

1. 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉430070

   云泽，高慧军，刘萍，刘淑珍，罗涛，金帅，徐强，徐娟，程云江，邓秀新

相应的作者

对应到Yunjiang程．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

ZY, HJG和YJC构思了这项研究，设计了所有的实验，并进行了硅和生化分析。SZL进行初级代谢物检测和统计分析。SJ进行次生代谢物检测和统计分析。ZY、HJG、TL、QX、JX、YJC、XXD对实验数据进行解读并参与稿件撰写。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

云泽、高慧君对这项工作也有同样的贡献。

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