在没有真菌感染的情况下，烟草中葡萄藤PGIP1的过表达会导致叶片阿拉伯糖氧葡聚糖网络的成分变化

背景

的本构表达式葡萄聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白1 (Vvpgip1)已被证明可以保护烟草植物免受葡萄孢菌．有证据表明，除了经典的ePG抑制机制外，VvPGIP1在提供抗真菌感染保护方面还具有其他作用。在没有感染的情况下，先前获得的基因表达和生化数据表明，转基因VvPGIP1细胞壁，特别是木葡聚糖成分在真菌抗性中发挥作用。

结果

为了阐明壁相关过程在pgip衍生抗性预感染中的作用，利用高通量和分离技术对野生型和先前鉴定的转基因株系的健康叶片进行了壁谱分析。与野生型植株相比，转基因植株在发育过程中细胞壁结构发生了改变。免疫分析显示果胶和纤维素组分发生细微变化，半纤维素基质发生显著变化，表明表达VvPGIP1的转基因植株叶片结合减少。利用优化的阿拉伯糖木葡聚糖酶解低聚糖指纹图谱技术，我们发现xeg -可溶性结构域的多糖对某些低聚糖成分进行了相对丰度的修饰，尽管在野生型和转基因植物之间没有明显的离子谱差异。与野生型系相比，这些变化对植物形态或正常生长过程没有显著影响。

结论

因此，VvPGIP1过表达导致烟草细胞壁重塑和纤维素-木葡聚糖网络在潜在感染之前重组。

细胞壁是真菌病原体(坏死性或生物营养体)遇到的第一个植物隔室，需要突破细胞壁才能发生有效的感染[1]。真菌进化出了大量的细胞壁降解酶(CWDEs);这些酶包括聚半乳糖醛酸酶(PGs)、果胶甲基酯酶(PMEs)和果胶裂解酶，它们被用来攻击和定植潜在的宿主[2]。葡萄孢菌,是一种坏坏性植物病原体，宿主范围广泛，通过真菌分泌的内聚半乳糖醛酸酶(ePGs)感染富含果胶的肉质果实[3.，4]，对葡萄作物造成重大损害(葡萄属vinfera)，以及其他水果作物。葡萄孢属在植物寄主攻击期间释放大量代谢物和酶，如pg，这些代谢物和酶浸渍细胞壁的果胶成分，从而为真菌的生长和增殖提供了进入途径和营养来源。作为回应，植物共同进化出了对抗防御机制，通常具有高度的病原体特异性，包括一系列与细胞壁相关的反应(详细综述见[5- - - - - -8])和抑制cwde的蛋白质，如聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)和果胶甲基酯酶抑制剂(PMEIs) [2]。PGIPs是存在于植物细胞壁区域的细胞外富含亮氨酸重复序列(LRR)蛋白，对真菌ePGs具有识别和直接抑制能力[j]。9，10]。Cervone等。[1]提出，在感染过程中，PGIPs降低了epg介导的高半乳乳酮(HG)对低聚半乳乳酮(OGAs)的降解速度，从而改变了OGAs的寿命，以及OGA种群的平均分子长度和浓度，这反过来又引发了受感染植物的防御反应(参见[5，10，11])。最近，一种由胞外结构域组成的杂化激酶WALL-ASSOCIATED KINASE1（WAK1)和延伸因子Tu受体(EFR)激酶的细胞内结构域与OGAs结合并激活防御反应[12]。

PGIPs的主要作用机制被认为是通过直接抑制ePGs [13]。物理研究已经证明不同来源的PGIPs和ePGs之间存在直接的分子相互作用[14，15]。直到最近，已发表的关于PGIPs的文献只考虑它们的ePG抑制功能，并且大多数研究都是进行的在体外．然而，存在一些例子表明，一些PGIP-ePG对仅在在活的有机体内环境(16]，提供了强有力的支持，至少一些PGIP-ePG对需要其他组分才能形成功能抑制复合物。据推测，PGIP与果胶的结合可能是一种掩盖底物的手段，从而保护底物不被epg水解[16- - - - - -18]。

在正常的PGIP-ePG抑制场景之外的其他作用最近被报道。Veronico等。[19]显示了当地人的表达模式Pvpgip可能与豌豆植物对囊线虫感染的抗性程度有关。有趣的是，没有从囊肿线虫中获得ePG转录本，也没有发现PGIP与天然ePG表达之间的相关性，这再次表明PGIPs可能在经典的PGIP-ePG抑制假说之外的植物与病原体相互作用中发挥其他作用。同样，Kanai等人也发现了这一点。[20.),Atpgip1转录本通过影响种皮中果胶的降解来延长种子萌发，这强烈表明PGIPs可能具有多种功能在足底．

通过对VvPGIP1的研究，我们已经获得了重要的见解在活的有机体内PGIPs功能。的表达分析Vvpgip1基因表明，该基因在成熟开始时表达，此时已知果实细胞壁发生解体，浆果变得更容易受到病原体感染[21，22]。Vvpgip1在烟草(n .烟草)，感染后表现出有效耐药性b .灰质孢子由转化的细胞系[23]。这些烟草转基因品系的转录组学和代谢物谱分析提供了令人惊讶的结果，当转基因品系和未转化对照在没有感染的情况下进行比较时(即评估转基因品系的基线变化)Vvpgip1而不参与PGIP-ePG抑制相互作用)[24]。转基因品系的激素谱和木质素水平发生了显著变化。此外，这种分子分析方法证实了细胞壁在PGIP表型中的重要性，并首次证明了PGIPs在潜在的启动机制中影响细胞壁的组成和强化[24]。获得的转录组学数据和其他RT-PCR验证实验表明，木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶(XET/XTH)基因在Vvpgip1转基因系与野生型植物的比较[24]。已知XET/XTHs参与细胞壁木葡聚糖重塑(即拧紧和松动)，从而参与纤维素/木葡聚糖网络的重组[25]。进一步支持这一“XET/XTH下调”的数据显示，总XET酶活性在Vvpgip1与野生型比较的转化系[24]。这些数据指出木葡聚糖(可能还有相关的纤维素微原纤维)网络在细胞中的可能作用Vvpgip1观察抗性表型。此外，转录组学数据显示，CAD(肉桂醇脱氢酶)转录物的表达发生了变化，表明木质素代谢发生了改变;化学数据进一步支持了这一点，这些数据表明，在没有感染的情况下，转基因品系发生了木质化(因此壁加强)[24]。

因此，本文提出的工作重点是VvPGIP烟草转基因品系的细胞壁，以研究细胞壁的作用，特别是阿拉伯糖氧葡聚糖网络，在提供的抗性Vvpgip1表达式[16，23，24]。烟叶细胞壁谱分析方法(包括单糖组成分析、阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖指纹图谱和CoMPP分析)优化[26]被使用。利用化学和酶分离技术对VvPGIP1和对照材料中存在的阿拉伯糖氧葡聚糖网络进行了彻底的解剖和比较。我们从野生型和PGIP过表达系中获得了叶片位置(即叶片3到叶片6)的发育曲线。阿拉伯糖氧葡聚糖基质确实被发现在Vvpgip1烟草行。转化品系在发育过程中显示了叶片阿拉伯糖氧葡聚糖聚合物的重塑和低聚物组成(如低聚糖指纹图谱)的改变(与对照植物相比)。一个模型提出如何过度表达Vvpgip1烟草叶片的细胞壁结构和寡聚物组成发生了改变，从而增强了植物在感染前后对真菌病原体的抗性。

SR-1与转基因烟草系的碳水化合物微阵列聚合物谱分析

碳水化合物微阵列聚合物分析(CoMPP)分析被用作初步筛选方法，以提供本研究中使用的植物细胞壁多糖结构的概述。对提取的细胞壁多糖进行了CoMPP分析，并允许使用单克隆抗体(mab)和碳水化合物结合模块(CBMs)对细胞壁材料进行分析，这些单克隆抗体和碳水化合物结合模块显示出对植物细胞壁聚糖表位的特异性[27]。这种分析提供了提取物质中表位相对丰度的信息，而不是完全定量的数据，但与完全定量的生化技术相比，它可以提供多糖而不是单糖的信息。

对SR-1和VvPGIP1叶片材料制备的酒精不溶性残留物(AIR)进行CoMPP分析(有关转基因株系37和45的详细基因型和表型表征，参见[23，24])。当植株达到成熟的8片叶片阶段时收获叶片，以便将获得的数据与在相同生长状态下常规进行的整株叶片侵染试验相一致[23]。收集4片连续叶片(从3号叶片(最年轻)到6号叶片(最老))，快速冷冻，处理得到AIR [26]。

除了下面将讨论的一些显著差异外，全球CoMPP数据集在野生型和转基因叶片之间是相似的，这表明VvPGIP1过表达对整体细胞壁组成和发育模式没有显著影响。此外，由于结合的CoMPP模式在第37行和第45行之间高度相似，因此只显示了与野生型相比的第37行数据(图3)1）.生成的CoMPP数据集证实了先前的基线研究n .烟草SR-1 [26在烟叶细胞壁的一般组成方面。然而，本文提供的数据扩展了Nguema-Ona等人的评价。26]通过评估叶片位置对发育模式的影响(图2)1A).单克隆抗体LM5结合的持续减少被认为是叶龄的函数(位置3-6)，这表明烟草叶成熟过程中半乳聚糖的周转。在果胶(即单抗JIM7和LM18)、阿拉伯人(单抗LM6)和AGPs(单抗JIM8和JIM13)的数据集中，作为叶片位置(即从叶片3到叶片6)的函数，类似的结合逐渐减少是显而易见的。

有趣的是，尽管转基因系总体上保持了这种发育趋势，但一些表位在WT和转基因系之间表现出不同的结合(图2)1A).比较CoMPP数据中最显著的特征是NaOH提取物中mAb LM15的结合模式存在显著差异。该单抗针对罗望子木葡聚糖中木基化七糖[28]，与野生型植物相比，与转基因AIR (VvPGIP1系37和45)的结合较少;无论使用的叶片位置如何，这些样品之间的结合差异都是一致的(图2)1值得注意的是，当对AIR进行CoMPP分析时，首先用乙酸钠缓冲萃取剂(如26所示)进行预处理，以去除潜在的干扰物质，如果胶和其他提取的细胞壁蛋白，LM15的差异结合模式保持不变(图1)1B).在本分析中，壁结合酚类化合物作为干扰化合物的影响是可能的，但考虑到在CoMPP数据集中观察到的特定差异响应，可能可以忽略不计。mAb LM15识别的木葡聚糖表位可能嵌入在果胶基质中[28]，这一步是为了控制果胶和相关的缓冲可溶性成分(如细胞壁蛋白)可能阻止单抗接近其靶标的可能性，从而导致在不同种群中观察到的不同反应。检查经过此处理后获得的数据集，可以发现比从总AIR获得的数据矩阵简化得多(未显示的数据)，例如，大多数AGP表位已被删除(未显示的数据)。mAbs LM15的数据如图所示1(A和B)强烈支持这样的断言，即在转基因品系中，阿拉伯糖氧葡聚糖聚合物的可及性或丰度有所下降。

在转基因品系中观察到的其他变化包括(图2)1A):(i)转基因材料增强了单抗JIM7的相对结合量。这可能表明转基因植物比野生型具有更高的果胶酯化水平;(ii)同样，AGP单克隆抗体JIM8和JIM13显示出不同的结合模式，这可能表明转基因材料中AGP的组织发生了变化;(iii)在野生型和转基因植物之间，也观察到毛牛提取物中CBM3a的细微差异。mAb CBM3a与转基因材料的结合减少也表明VvPGIP1细胞系对阿拉伯糖葡聚糖-纤维素基质的可及性发生了改变(与mAb LM15的数据一致)。

野生型SR-1与转基因烟叶单糖组成分析

为了支持CoMPP数据，还使用了其他壁谱分析方法来评估叶片发育“年龄”(即叶片位置)对叶片细胞壁组成的影响。SR-1烟草群体的数据被用作比较转基因株系的基线。单糖组成分析用于评估总细胞壁组成(图2)2A)对烟叶3-6产生的AIR进行了分析，发现SR-1中的主要单糖是Gal和GalA, Ara、Rha、Xyl和Man的含量较少，证实了烟叶富含果胶的特性(如图[26])。Glc被有意地从数据集中移除(图2)2A)污染淀粉使解释复杂化。有趣的是，SR-1数据显示出明显的发育模式(图2)2A)其中Gal含量从叶片3的约25 mol%逐步下降到叶片6的约15 mol%，而GalA丰度则从叶片3的约40 mol%反向交错增加到约50 mol%。进一步用ePG处理AIR得到可溶部分(图2)2B)除了明显缺乏Xyl、Man和Ara外，与总AIR的组成相似。在ePG水解部分中，Gal和GalA的模式保持不变(图2)2B)，尽管Gal的交错减少/增加从约25 mol%到约10 mol%， GalA的交错减少/增加从约50 mol%到约70 mol%(图2)2A)。这一数据支持了这样一种观点，即半乳聚糖链的周转发生在果胶鼠李糖半乳聚糖I (RG-I)聚合物中，这与叶子从积极生长(扩张)到最终成熟的转变有关(见[29，30.])。用XEG处理SR-1的ePG不溶性残留物，得到富含Xyl、Glc、Rha和Ara的可溶部分(图2)2C)。Paenibacillus sp利用木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶XEG5 (PspXEG5)消化去果胶叶片AIR，用质谱法和高效阴离子交换色谱法分析释放的阿拉伯糖木葡聚糖低聚糖(优化方法为[26])。这个部分代表xeg可溶性部分结构域，是存在于细胞壁中的三个木葡聚糖结构域之一[31]，在生长的黄化豌豆组织中观察到，它受到显著的代谢转换的影响[32，33]。有趣的是，在SR-1叶片成熟过程中，该组分的Xyl含量明显略有下降(图2)2C)。从文献中得知，烟草木葡聚糖是阿拉伯糖基化的(即阿拉伯糖氧葡聚糖)，属于xxgg型，因此与豌豆中的xxgg型相比，其葡聚糖主链的木基取代程度较低[34]。在这个分数中没有看到明显的差异(图2)2C)其他单糖与SR-1叶片位置的关系。此外，在这些分析中，野生型和转基因材料之间的总体细胞壁谱没有明显差异(附加文件)1和附加文件2)，证实了我们对转基因细胞系的初步细胞壁组成分析，表明VvPGIP1过表达并未改变整体细胞壁组成[24]。

SR-1与转基因烟草系叶片阿拉伯糖氧葡聚糖低聚物的比较

此外，对SR-1植株叶片阿拉伯糖葡聚糖成分进行了详细的基线分析，为与转基因品系的比较分析做准备。从叶片3-6中分离出去果胶AIR，并进行酶寡糖指纹图谱(按叶片位置显示数据)[35，36]。酶处理产生了六个主峰，这些峰存在于从评估的四个叶片位置产生的所有色谱中(图2)3.）.阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖4(峰4)的浓度随叶片位置的变化而变化(图2)3.）.目视检查轨迹(图1)3.)和峰面积定量分析(图2)4A)表明，阿拉伯糖低聚糖4亚基在叶片3 ~ 5中增加，而在叶片5、6中减少，表明该阿拉伯糖低聚糖组分在叶片生长过程中受到发育控制。

鉴于阿拉伯糖氧葡聚糖组分对VvPGIP1烟草表型的重要性(如[24])，对来自野生型和转基因系的所有发育阶段(即叶片位置3-6)的AIR进行酶促低聚糖分析。从所有被测植物群体中产生了六种主要的低聚糖，并使用高性能阴离子交换色谱耦合脉冲安培检测对这些低聚糖进行了量化(图1)4）.寡糖4(即峰4)丰度在野生型中存在显著差异(图2)4A)与转基因叶片(图4B和C)，峰1和峰2也发现了不太明显但显著的差异。来自转基因品系的叶片3、4和5所含的这种阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖成分始终少于野生型叶片(图2)4）.然而，叶片3-5的发育趋势/模式在对照系和VvPGIP1系之间没有变化，这支持了VvPGIP1不影响正常生长发育的观点(在PGIP过表达系中没有观察到视觉表型改变的事实也支持了这一观点)。在叶子6(最老的收获叶)的情况下，聚合物中寡糖4的丰度已经恢复到接近野生型的水平，没有发现统计学上显著的差异(图2)4）.野生型和转基因阿拉伯糖氧葡聚糖衍生低聚糖4的丰度差异最显著的是叶片位置3(图3)4D);因此，所有进一步详细的聚合物分离和表征都只针对这个叶片位置。

来自野生型和转基因系3号叶位的阿拉伯糖氧葡聚糖聚合物的AIR分离和比较分析

为了确定转基因株系中是否发生了总体半纤维素含量的变化，采用了AIR标准化学分离方案，然后进行了重量分析。除了4 M KOH分离(富含阿拉伯糖氧葡聚糖聚合物)外，转基因叶片的丰度与野生型叶片相比似乎有小但统计学上显著的增加(附加文件)3.A)没有发现重大差异。这些细微的差异很难解释，可能表明不同测试线之间聚合物溶解度的变化。随后对每个馏分(热缓冲液- (A)，碳酸钠- (B)和4 M KOH (C)可溶性馏分)的单糖组成分析显示样品之间没有主要差异(附加文件)4）.使用PspXEG5对4 M KOH可溶性组分进行分析显示，不同植物群体之间没有成分差异(数据未显示)。从文献中我们知道，植物细胞壁是由酶“可接近的”和“不可接近的”结构域组成的[31]，使用不加区分地降解聚合物的化学萃取剂可能导致难以解释酶介导过程(如XET活性/作用)的数据集。为了解决这个问题，使用ePG和PspXEG5处理的酶解分离方案也用于来自叶片3样品的烟草空气(如Nguema-Ona等人概述和执行的)。26])。重量分析(附加文件3.B)显示了与化学处理大致相似的结果。使用单糖组成分析对xeg可溶性材料进行分析，发现GalA和Glc含量的变化可能表明该区域的聚合物溶解度发生了变化(图2)5A).进一步的成分分析采用酶低聚糖质谱法进行。

将PspXEG5促进的阿拉伯糖羟葡聚糖衍生物低聚糖混合物(先前从叶片3中获得)直接注射到高分辨率质谱仪中，并在阳性模式下通过ESI-MS进行分析(图3)5罪犯)。光谱中发现的几乎所有离子都是转化型和野生型系所共有的;包括m/z 791、923、1085;对应于海克斯_3.笔₂(XXG/ SGG)， Hex_3.笔_3.(SXG, XSG)十六进制₄笔_3.(SXGG, XSGG)低聚物，分别鉴定于Nguema-Ona等。[26]。与相邻的离子m/z 791和1085相比，在转化谱中观察到m/z 923离子的丰度相对降低。这似乎与本研究先前报道的低聚糖峰4 (HPAEC-PAD分析)的降低有关(见图2)4，以及附加文件5其中叶3中的HPAEC-PAD数据如图3所示4(与转基因品系直接比较)。需要进一步的工作来更充分地阐明这些成分的身份，这超出了当前分析研究的范围。最后，PspXEG5不溶性物质用4 M KOH进一步提取，中和，透析，冷冻干燥，悬浮在醋酸钠缓冲液中，然后用PspXEG5消化。PspXEG5的加入对于释放所有暴露的，即结合不紧密的木葡聚糖链是必要的，然后加入KOH来与紧密结合在纤维素微原纤维上的木葡聚糖组分的强氢键竞争，正如Ngeuma-Ona等人所做的那样。26，释放出来的链就容易受到酶的作用。用ESI-MS分析发现，野生型和转基因系释放的寡糖模式没有差异6)或HPAEC-PAD(附加文件7)，同样适用于释放物质的总单糖组成(附加文件)8)，为xeg不溶性部分。

诉酿酒用葡萄聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白1 (VvPGIP1)对真菌ePGs有活性，编码基因的组成性表达导致烟草对真菌ePGs的敏感性降低b .灰质［16，23]。当这些植物在没有感染的情况下进行基因表达和生化分析时，发现细胞壁调节活性发生了重要变化，特别是木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶(XTHs) [24]。本研究采用针对烟叶优化的高通量分离技术对VvPGIP1烟草群体细胞壁进行了进一步研究[26]。

Vvpgip1过表达导致烟叶细胞壁的细微重塑，改变阿拉伯糖氧葡聚糖-纤维素网络的可及性，而不影响一般细胞壁的生物合成和周转

CoMPP数据集没有指出转基因品系中生物合成成分的整体变化(图2)1）.后来的细胞壁成分分析数据集也证实了这一点(图2)2，3.，4）.未转化对照叶的细胞壁分析为与转基因株系的最终比较提供了有价值的叶片细胞壁发育和更新(作为叶龄的函数)的基线数据。果胶聚合物在叶片中的发育模式(即Gal和GalA水平)与果胶在果壁中的成熟相似。已知果胶在沉积/周转过程中的成熟涉及从甲基化果胶HGA到去酯化形式的转变，并与组织中钙“蛋盒”交联发生的平行硬化有关[37]。拉巴维奇和雷[29后来，西谷和增田[30.对含半乳糖的细胞壁多糖在延长的豌豆茎段和生长的红豆上胚轴上的周转进行了评论。各种研究表明，与RG-I果胶相关的β-1,4-半乳聚糖与细胞扩增有关[38，39];它也在细胞伸长开始时积累[40]，并在延伸/膨胀阶段及之后逐渐降解[41]。同样，我们的数据表明，在烟叶成熟过程中，Gal含量(可能代表与RG-1相关的取代半乳糖)降低，而游离未取代果胶HGA含量增加，然后钙离子结合并硬化。这种Gal和GalA水平(即果胶)的发育模式在转基因系中没有改变。

本研究报道的VvPGIP1转基因中木葡聚糖组成的调节，以及Alexandersson等人提供的数据。[24表明纤维素-木葡聚糖网络发生了有利于“强化”的重组。这一点得到了CoMPP数据的支持，特别是mAb LM15和mAb CBM3a，在较小程度上，在转基因系中观察到这些mAb的可及性降低。CoMPP数据集也显示细微的重塑发生，这反映在单克隆抗体JIM7、JIM8和JIM13的结合上。单抗JIM7的结合增强表明转基因系中果胶的酯化反应增加，这需要进一步对转基因系的果胶成分进行验证。果胶甲基酯化已被提出在植物与病原体的相互作用中发挥作用，主要是通过限制果胶被真菌酶降解的可及性[42]。植物表达果胶甲基酯酶抑制蛋白(PMEIs)被认为可以阻断或改变天然果胶甲基酯酶(PMEs)的作用。在足底从而调节果胶酯化的水平[42- - - - - -44]。由PMEIs表达介导的果胶甲基酯化水平反过来又与感染的减少相关葡萄孢菌［44]。当然，在我们的转基因品系中，果胶酯化水平的升高，与木葡聚糖-纤维素修饰相结合，是在试验感染期间观察到的抗性表型的原因。目前，关于果胶(一般)和酯化水平(特别是)的数据不足，无法支持这一结论，进一步的实验正在进行中，以详细分析转基因叶片中果胶的变化，以验证本研究中报道的CoMPP数据集。

VvPGIP1过表达最有可能导致阿拉伯糖羟葡聚糖xeg可溶性组成的改变在muro修改

植物细胞壁的机械抗性是植物与病原体相互作用中的一个重要因素，因为大多数病原体在感染过程中需要破坏细胞壁组织[7]。这种抗性取决于纤维素/半纤维素网络的完整性[31，45，46]。保利等。[31表明木葡聚糖网络被组织成三个不同的结构域:木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶(XEG)可提取域(XEG可溶域)，强碱可提取域(XEG不溶域)，最后是包裹在纤维素微原纤维内部或之间的第三个结构域。在VvPGIP1转化的植物中，发现xeg -可溶性结构域发生了改变(图2)4)，而这很可能已经发生在墙[参考译文]在木葡聚糖代谢过程中涉及两种类型的过程已被充分记录:第一种涉及木葡聚糖生物合成的变化[47]，第二个是the的变化在muro木葡聚糖的代谢[48]。在我们的案例中，木葡聚糖的生物合成不太可能发生变化，也没有证据表明这一点2，3.，4）.基础生物合成途径基因的突变已被研究并报道导致木葡聚糖聚合物组成在所有三个区域的差异;这种类型的大规模修饰也倾向于产生形态和/或生长表型的改变[36，49，50]，这与在这里研究的植物中观察到的情况不同。因此,在muro变化是对观察到的变化更可能的解释Vvpgip1过度表达行(图4和5）.这种类型的修饰已被证明仅限于聚合木葡聚糖的xeg可溶性结构域[32，33]，因为只有细胞壁修饰酶负责这一过程在muro修改后可以访问该域。结果表明，一些XET /次方基因在健康VvPGIP1烟草植株中下调，导致这些品系中XET/XTH总酶活性降低[24]。因此，在VvPGIP1转化的烟草品系中观察到的xeg可溶性结构域的组成变化很可能是修饰的结果在muro酶活性(即重塑)并没有发生在高尔基体。

我们有理由认为，XET/XTH酶活性的变化，以及作用于xeg可溶性部分的其他细胞壁外壁酶的作用，促进了我们在xeg可溶性部分的低聚糖组成中观察到的修饰(图2)4）.许多外质体酶协同作用并作用于xeg可溶性部分，并具有修饰木葡聚糖聚合物的潜力。具有XET活性的内切葡聚糖酶[51]， α-木糖苷酶[52]， β-半乳糖苷酶[53]和α-聚焦酶[54]可以对xeg可溶域的最终聚合物组成做出贡献。Xyloglucan修改在muro得到了很好的研究Arabidopsis和糖苷酶活性改变的突变体，如Atxyl1、Atbgal10和axy8突变体[52- - - - - -54]显示出xeg可溶性聚合物组成的显著变化。最近有研究表明，反式α-木糖苷酶和反式β-半乳糖苷酶可直接作用于木葡聚糖多糖引起修饰[55]。

Sampedro等。[52结果表明，除了AtXyl1突变体的聚合木葡聚糖发生了修饰外，两种木葡聚糖代谢中间体(XXXG和XXLG)在生长培养基中大量积累，可能在根周围的土壤中也有积累。在Atbgal10和axy8突变体中没有发现这种外质体、游离和扩散的木葡聚糖低聚糖的积累，它们分别缺乏参与木葡聚糖修饰的β-半乳糖苷酶和α-聚焦酶在muro．因此，考虑到在木葡聚糖组分中观察到的修饰，在我们的转化系中研究外质体木葡聚糖低聚糖的发生将是有兴趣的。

Vvpgip1过表达对细胞壁结构影响的模型

真菌菌株能够有效地降解富含果胶的基质，但它们在物理上渗透和浸渍增强的纤维素-木葡聚糖网络的速度可能会减慢[7]。最近的排序b .灰质基因组表明，其细胞壁降解酶(CWDEs)的武器库对半纤维素，如木葡聚糖，是非常有限的[56]。通过本研究提供的额外分析，现在可以产生一个工作假设(图1)6)总结了VvPGIP1过表达对烟草细胞壁相关过程和蛋白结构的已知影响(n .烟草）.VvPGIP1过表达能够诱导木质素积累(图2)6a - b;［24])，果胶修饰(单抗JIM7结合;这需要进一步证实)和阿拉伯糖氧葡聚糖-纤维素重组(图2)6C、D、E;CoMPP分析，阿拉伯糖氧葡聚糖分析和[24])。本研究明确的共识是，VvPGIP1过表达能够引起修饰和重组，从而导致细胞壁在感染前普遍加强/强化。一旦感染发生，PGIPs将与ePG形成抑制复合物，而改变(增强)的壁基质进一步阻止真菌的渗透。

我们的研究结果表明，与野生型对照相比，转基因VvPGIP1株系的细胞壁发育谱发生了改变。我们还发现，xeg可溶性结构域的多糖被修饰，导致从转基因材料中获得的酶衍生低聚糖谱的改变。与野生型系相比，这些变化对植物形态或正常生长过程没有显著影响。因此，VvPGIP1过表达导致烟草细胞壁重塑和纤维素-木葡聚糖网络在潜在感染前重组，并进一步证明了VvPGIP1过表达可能引起的启动效应和PGIPs的非epg相关功能在活的有机体内．

PGIPs可能是从具有植物防御之外作用的前体基因进化而来的，并且在进化过程中由于其独特的特性(即蛋白质和果胶结合)而被选择为防御蛋白。这也表明pgip基因可能还有许多其他的功能角色在足底，这是它们进化的结果，包括参与植物信号机制。我们的数据增加了最近确定的PGIPs的替代功能列表，并表明VvPGIP1在修改木葡聚糖组成中起作用在muro感染前。VvPGIP1在葡萄藤中的功能作用，其原生遗传背景，现在显然是感兴趣的。Vvpgip1主要在浆果中表达，在正常(健康)条件下，在vsamimaison(开始成熟时)表达达到峰值，在根中表达的程度较低(Joubert等人，2012年)。Vvpgip1受感染和损伤(所有器官)以及激素治疗和渗透应激诱导表达[22]。浆果成熟涉及大量的糖在其他物质中积累，这个过程在成熟开始时就开始了。因此，考虑到观察到的半纤维素-纤维素网络和VvPGIP1的重塑特性(本研究)，该蛋白可能通过加强/限制木聚糖承载基质来调节浆果的渗透调节，以应对成熟浆果的发育变化。解开的在足底VvPGIP1在植物-病原体相互作用和浆果发育中的功能作用仍然是一个高度优先考虑的问题，并得到了这种方法的支持，该方法将转基因表型置于各种分析技术中，这些分析技术已被证明是有价值的在足底PGIPs功能。

构建表达VvPGIP1的烟草转化系

改造后的烟草株系37和45的世代(背景)烟草(L. Petite Havana SR-1)组成表达葡萄pgip1（Vvpgip1)它们的表型和遗传特征先前在Joubert等人中有描述。[16，23]和Alexandersson等人。[24]。

植物生长和收获条件

以烟草SR-1为WT对照和2个转基因株系(37号和45号)为研究对象。生长条件如[26]。简单地说，对照和转基因烟草种子播种在固体MS培养基上[57]在皮氏培养皿中，在26°C的光照条件下培养16小时/ 8小时的黑暗光周期。幼苗转移到土壤中，在气候室(23°C;16小时光照(8小时暗光照)，直到植株完全成熟(8叶期)。每株分别收获四片完全展开的叶子(年轻的叶子编号为3号，年老的叶子编号为6号)，用液氮速冻，并在-80°C保存，以待下次使用。为了每个样品产生合理数量的酒精不溶性残留物(AIR)，在收获后将来自同一品系(和同一叶片位置)的三个单株植物的三个单株叶子汇集在一起，快速冷冻在一起并作为一个生物样品计算。为了统计目的，每个叶位(叶位3 ~ 6)和每株(对照SR-1、VvPGIP1系37和VvPGIP1系45)采集4 ~ 8份生物样品。

细胞壁的分离和分离

从冷冻烟叶中提取细胞壁材料，按[26]。简单地说，将2克冷冻的叶子在液氮下用研钵和杵研磨成细粉。在80%乙醇中煮沸20分钟后，不溶性物质在甲醇:氯仿(1:1)中洗涤24小时，由于油脂含量高，用新鲜溶剂再洗涤24小时，之后残留物在甲醇中洗涤，然后风干。使用耐热α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶和普鲁兰酶(均来自Megazyme)的组合对称为醇不溶性残留物(AIR)的干燥物质进行脱淀粉。脱淀粉AIR是独立的，化学和酶分馏。

碳水化合物微阵列聚合物谱(CoMPP)分析细胞壁材料

AIR是用本文“细胞壁分离和分离”部分所述的冷冻烟叶制备的。为了进行CoMPP分析，将化学分馏过程简化为三个提取步骤。用CDTA(主要提取果胶类物质)和NaOH(主要提取半纤维素聚合物)从AIR中提取CoMPP分析。最后，采用牛牛萃取法对剩余的富含纤维素的残渣进行部分增溶。大约用了40毫克的材料进行CoMPP分析，如[27]。对每个样品称重约10mg后，根据每mg AIR提取溶液30 μl的比例调整萃取量。热图中的值为三次实验的斑点信号平均值，整个数据集中的最高信号设为100，其他数据均作相应调整。最低价是10。

单糖组成气相色谱分析

一种气液色谱法[58用]法测定细胞壁残基和组分的单糖含量。将约1 - 3 mg的壁渣或分离物水解(2 M TFA, 110°C, 2 h)，并使用1 M甲醇HCl在80°C下水解24 h，将释放的单糖转化为甲氧基糖。在80°C (20 min)下进行硅基化，生成溶解在环己烷中的三甲基硅基糖苷。衍生物在气相色谱仪(惠普5890系列II)中分离和分析，连接到火焰电离检测器，使用30 m × 0.25 mm (i.d)。HPS-MS列。烘箱温度程序在120°C稳定2分钟，然后从10°C/min升至160°C，然后从1.5°C/min升至220°C，最后从20°C/min升至280°C。内标为肌醇(0.5 μmol)。根据其保留时间对衍生物进行鉴定，并通过测定其峰面积对其进行量化。单糖(来自Sigma-Aldrich)作为标准，测定了植物细胞壁中发现的九种主要单糖的保留时间。糖组成用每个单糖的摩尔百分比表示。直方图中的误差条表示四个生物样本的平均值的标准差(SD)，每个生物样本有两个技术重复。

高效阴离子交换色谱法

采用高性能阴离子交换(HPAE)色谱法(Dionex Ultimate 3000)对xeg生成的阿拉伯糖氧葡聚糖进行分析，并用CarboPac PA-1色谱柱结合脉冲安培检测(PAD;Coulochem 111探测器)。样品(10 μL)在100 mM NaOH中以1 mL/min洗脱，乙酸钠梯度为:0-2.5 min: 100 mM NaOH, 2.5-3 min: 0-70 mM NaOAc线性梯度，3-29 min: 70-100 mM NaOAc线性梯度，29-29.1 min: 100 - 500 mM NaOAc线性梯度，29.1-38 min, 500 mM NaOAc, 38-47 min, 100 mM NaOH。

化学和顺序萃取脱淀粉空气的重量分析

三个化学和顺序提取的部分(50 mM醋酸钠热缓冲液，50 mM CDTA, 4 M KOH;也参见[26])在去离子水(8°C下48小时)下透析(3.5 kDa切断透析管)，冷冻干燥后进行重量和成分分析(见下文)。4 M KOH可溶馏分也用xeg消化得到xeg可溶馏分进行成分分析。有关分选过程和使用该方法提取的多糖的完整描述，请参阅Nguema-Ona等人。[26]。

酶法和顺序萃取脱淀粉AIR的重量分析

为了对烟草阿拉伯糖氧葡聚糖(改编自[31])， AIR的处理方法如下:50 mg AIR首先用ePG (GH28)处理两次曲霉属真菌sp;Megazyme)在37°C (2 mg/U)下处理18小时，首先在50 mM AcNA缓冲液pH 4中处理，然后在50 mM乙酸铵，50 mM CDTA和0.5% NaN中处理_3.(参见[59])。可溶部分收集后，用去离子水洗涤残渣，95°C水浴处理20 min，以溶解残余果胶物质并灭活ePG活性，然后用去离子水洗涤2次。果胶的溶解量由干燥残余脱胶物料的重量推算。然后用PspXEG5在37℃下处理18小时;2 mg /U)得到PspXEG5馏分PspXEG5 F1。所得的剩余物质(xeg -不溶性物质)，用去离子水广泛洗涤，冷冻干燥，剩余干质量称重。用4 M KOH对XEG不溶性物质进行提取，以释放出一种XEG不溶性半纤维素物质，该物质富含与纤维素部分结合的阿拉伯糖氧葡聚糖在muro(见[31])。剩余的材料用去离子水洗涤两次并冷冻干燥。在进一步分析之前，将epg可溶性组分(3.5 kDa切断透析管)与去离子水(在8°C下48小时)进行透析，并冷冻干燥。xeg可溶性组分在HPAE色谱分析之前要么过滤(0.22 μm尼龙膜)，要么进一步脱盐和浓缩，如Packer等人所述。60]，采用石墨化固相萃取(UltraClean固相萃取柱;Altech，美国)柱和Visiprep真空歧管(Supelco，美国)。固相萃取柱以4 mL 90%水溶液(v/v)乙腈加0.1%水溶液(v/v)三氟乙酸(TFA)和4 mL蒸馏水为条件。取1ml萃取液于平衡柱上，吸附后用4ml去离子水洗涤。为了洗脱低聚糖，用4 mL 25%水溶液(v/v)乙腈和0.1% (v/v) TFA冲洗柱。最后将这些馏分冷冻干燥并重新悬浮在去离子水中，然后使用质谱法和气相液相色谱法进行进一步分析。

阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖的ESI-MS分析

xeg可溶性阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖(由PspXEG5消化脱脱物后产生)和xeg不溶性阿拉伯糖氧葡聚糖低聚糖(由PspXEG5消化xeg不溶性阿拉伯糖氧葡聚糖后产生)PspXEG5)脱盐浓缩，如[26]，最后采用Synapt G2高分辨率质谱仪进行电喷雾电离质谱分析(ESI-MS)。样品(1 μL)使用Waters UPLC直接注射到80%乙腈、0.1%甲酸的液中，流速为0.2 mL/min。离子源设置如下:源电喷雾正离子;毛细管电压3kv;锥压40v。以亮氨酸脑啡肽作为锁质。用甲酸钠对质谱仪进行标定。为了确定与检测到的主要离子对应的可能结构，使用MassLink软件进行了精确的质量测定。通过与现有文献的比较，我们推断出了释放的低聚糖的部分化学结构[26，59，61，62]。

统计分析

采用Microsoft Excel 2010统计软件包和Statistica 10软件进行描述性统计分析和方差分析(One - way ANOVA)。所有检验均以p = 0.05进行。在图和附加文件中指出了显著的差异。

空气:

酒精不溶性残留物

AXyG:

Arabinoxyloglucan

CBM:

碳水化合物结合模块

CoMPP:

综合微阵列聚合物分析

ePG:

Endopolygalacturonase

质:

电喷雾电离-质谱法

HG:

Homogalacturonan

HPAEC-PAD:

高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测

马伯:

单克隆抗体

简称OGA:

Oligogalacturonan

PspXEG5:

Paenibacillus sp木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶

鲁柏:

Rhamnogalacturonan

rt - pcr:

实时聚合酶链反应

XEG:

Xyloglucan-specific内切葡聚糖酶

XyG:

Xyloglucan

这项工作得到了南非鲜食葡萄产业(SATI)、葡萄酒产业专业知识和技术网络(Winetech)、南非工业技术和人力资源计划(THRIP)和克劳德·莱昂基金会的资助。感谢Stellenbosch大学中央分析设施(CAF)，特别是Marietjie Stander博士提供的技术支持，并感谢Emile van Zyl教授(Stellenbosch大学微生物学系)提供的HPAEC-PAD仪器。感谢马丁·基德教授(斯泰伦博斯大学统计分析中心)在统计分析方面的帮助。Jason Zhang也感谢他的技术援助。感谢法国鲁昂大学的Patrice Lerouge教授对手稿的批判性阅读和对研究的有益讨论。

作者指出

1. Eric Nguema-Ona

   现在的地址:实验室糖生物与细胞外基质vacei (Glyco-MEV)。上诺曼底大学，法国，法国，法国。鲁昂大学，圣艾尼昂山，法国Cedex, 76821

从属关系

1. Stellenbosch大学农业科学学院葡萄栽培与酿酒系葡萄酒生物技术研究所，南非Matieland 7602

   Eric Nguema-Ona, John P Moore和melanie A Vivier

2. 美国加州大学能源生物科学研究所，伯克利路2151号，加州伯克利，94720-5230

   Alexandra D Fagerström

3. 哥本哈根大学生命科学学院植物生物与生物技术系，丹麦，1001

   乔纳森·U·弗兰格和威廉·GT·威拉茨

4. Stellenbosch大学微生物系，南非Matieland, 7602

   Annatjie雨果

相应的作者

对应到梅拉尼娅·维维耶．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

MAV, JPM和ENO对研究进行了概念化并参与了实验布置。ENO负责采样、处理样本和随后的分析。医学部为HPAEC-PAD的分析提供了专家意见。AF、JUF和WGTW处理了用于COMPP分析的样品，并帮助解释数据和编制有关数字。JPM准备了图6。ENO、JPM和MAV起草了初稿和定稿。所有作者都参与了结果的讨论、审稿和审稿。

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