一个大而功能多样的…家族Fad2红花的基因(Carthamus tinctoriusl .)

背景

植物油的应用和营养价值在很大程度上取决于其脂肪酸组成，特别是其两种主要脂肪酸油酸和亚油酸的相对比例。微粒体油酰磷脂酰胆碱去饱和酶由FAD2已知基因在磷脂酰胆碱上油酸的Δ12位置引入双键，并将其转化为亚油酸。已知的植物FAD2酶是由1-4个成员组成的小基因家族编码的。除了经典的油酸Δ12-desaturation活性外，在有限数量的植物物种中也报道了FAD2的功能变体，这些变体能够进行额外或替代酰基修饰。在这项研究中，我们的目标是确定FAD2红花基因，分析其差异表达谱和潜在的多样化功能。

结果

我们在这里报告了一个异常大的FAD2利用实时荧光定量PCR技术分析了红花基因家族的时空表达谱。一些功能多样的红花FAD2基因家族成员在酵母中异位表达，在酵母中瞬时表达烟草benthamiana叶子。CtFAD2-1和CtFAD2-10分别在发育中的种子和花头中特异性表达油酸去饱和酶，而CtFAD2-2似乎在整个植物中具有相对较低的油酸去饱和活性。CtFAD2-5和CtFAD2-8在根组织中特异性表达，而ctfad2 - 3,4,6,7主要表达于红花幼苗的子叶和下胚轴。CtFAD2-9在C16:1底物上编码一种新的去饱和酶。CtFAD2-11是一种三功能酶，能够在两者中引入碳双键独联体或反式构型，或在Δ12位置的碳三(乙炔)键。

结论

在这项研究中，我们分离出一个异常大的FAD2基因家族有11个成员来自红花。种子表达FAD2油酸Δ12去饱和酶基因将为调控红花籽油中油酸水平提供候选靶点。此外，具有新功能的不同FAD2酶可用于在转基因作物中生产稀有脂肪酸，如crepenyic酸，这些脂肪酸是具有重要经济意义的植物抗毒素和油脂化学产品的前体。

红花(Carthamus tinctorius(L.)是一种古老的油籽作物，目前因其高质量的食用油而被种植，用于烹饪、沙拉酱和人造黄油，并在较小程度上用作鸟籽。油的特性高度依赖于它们的脂肪酸组成。油酸(18:1^Δ9)和亚油酸(C18:2)^Δ9日12)是在红花籽油中发现的两种主要脂肪酸，加起来约占总脂肪酸的90%。传统红花油的特点是其亚油酸含量相对较高，约为其他油籽作物的70% [1]。在过去的60年里，育种者利用红花的自然遗传多样性来修改油酸/亚油酸的比例，以满足特定的最终用途。选择了许多油酸(75-84%)或亚油酸(71-89%)含量高的选育品系。这两种主要脂肪酸的相对比例决定了食用油的相关工艺和营养特性[2]。从营养上讲，油酸和亚油酸都能降低血清总胆固醇，但油酸比亚油酸具有更高的氧化稳定性，因为它含有的双键少一个。因此，以牺牲亚油酸为代价提高油酸含量已被确定为改进包括红花在内的许多油籽作物的重要研究目标，以提供高度稳定的烹调油，而不需要加氢，这一过程可能导致营养不良的形成反式脂肪酸[3.，4]。除了食品应用之外，高含油还具有重要的现有和潜在的工业用途，例如改进生物柴油，润滑剂和液压油，因为这些产品需要高氧化稳定性。纯化油酸也是一种有价值的工业化学原料，可以裂解形成衍生物，如壬二酸，可用于一系列工业产品和聚合物的配方[5- - - - - -7]。

在种子储存油和膜脂中发现的独特脂肪酸组成是一个复杂的代谢网络的结果，该网络通过原核和真核途径调节脂肪酸的生物合成和通量。8，9]。据了解，叶绿体Δ12-desaturase (FAD6)对于所有含有16:1-或18:1的叶绿体膜脂，包括磷脂酰甘油(PG)、单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)、双半乳糖基二酰基甘油(DGDG)和磺化鹅磺基二酰基甘油(SQDG)，将16:1和18:1脂肪酸降至16:2和18:2是必需的[9]。主要负责从种子储存脂质中的油酸合成亚油酸的酶是微粒体油酰磷脂酰胆碱去饱和酶(FAD2)，它在磷脂酰胆碱(PC)上油酸的Δ12位置引入一个双键，在内质网(ER)上形成亚油酸[10- - - - - -12]。FAD2酶的变体在脂肪酸修饰、催化羟基化方面也具有多种功能[13，14]，环氧化[15]和乙炔键的形成[15，16]和共轭双键[17- - - - - -20.]。一些功能分化的FAD2酶是多功能的，如双功能的羟化酶/去饱和酶Lesquerella fendleri［21]和三功能乙酰化酶Crepis阿尔，也可以催化两者的形成反式和独联体油酸Δ12位置的双键[22]。

膜的完整性和功能由结构和流动性决定，在很大程度上受植物中脂质组成和脂肪酸去饱和程度的影响[23]。由于FAD2酶是多不饱和脂肪酸积累的关键步骤，它在细胞膜的生物物理特性中起着至关重要的作用，并且经常在各种环境刺激(如极端温度)下被诱导[8]，高盐[24]和病原体攻击[25]。FAD2的表达导致多不饱和脂肪酸的产生，对特定的信号转导途径也很重要，例如茉莉酸途径，它是已知的植物防御系统和雄性生殖能力的关键因素[26- - - - - -28]。

自从克隆出第一株植物FAD2基因拟南芥［11]，它的同源DNA序列已从许多不同的植物中分离出来并进行了鉴定，包括大豆[29]，强奸[30.]，棉花[31- - - - - -34]，花生[35，36]和亚麻[37]。只有一个FAD2基因存在于拟南芥中，但在大多数其他植物物种中，FAD2是由小基因家族编码的。例如，FAD2是由大豆中三个不同的家族成员编码的[29，38]和四名棉衣成员[31- - - - - -34]。在这里，我们报告的发现，分离和特征的一个前所未有的大FAD2红花的基因家族。11个全长cdna的系统发育分析及其独特的基因组结构特征表明，它们是非等位基因的，可能是通过几个层次水平的基因复制进化而来的。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对不同红花组织进行分析，揭示了它们不同的表达模式。FAD2家族成员在酵母中的异源表达和在酵母中的瞬时表达探讨了FAD2家族成员的功能分化烟草benthamiana。

红花多个成员的克隆与序列分析CtFAD2基因家族

两个不同的全长cdna，命名为CtFAD2-1和CtFAD2-2，从红花发育胚胎的λ cDNA文库中分离得到，利用拟南芥FAD2DNA序列作为探针。拟南芥的FAD2DNA序列也被用于“blast”搜索由Compositae Genome Project (CGP)生成的表达序列标签(est)数据库。http://compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php)。在我们搜索的总共41317个红花est中，至少有11个是不同的FAD2鉴定并指定cDNA序列。除了…之外CtFAD2-1和CtFAD2-2已从发育中的胚胎cDNA文库中分离出的9个部分cDNA被指定为CtFAD2-3通过对CtFAD2-11,分别。从每个部分cDNA序列中设计基因特异性引物，并通过3^”和5^”cDNA末端快速扩增技术(RACE)对红花叶片、根、下胚轴和花头等多种植物组织的rna进行反应。扩增片段被亚克隆到pGEM-Teasy载体上，并从两个方向进行测序。序列比较的3^”和5^”对应est的末端显示重叠区域，相互匹配。随后的全长cdna编码9个不同的部分FAD2将RACE产品与相应的ESTs组合得到ESTs。每个cDNA包含一个不间断的编码区，彼此具有广泛的序列同源性，并且是唯一的^”和3^”未翻译区域(UTR)序列。推测的多肽在372-388个氨基酸之间变化。这11个CtFAD2编码区在核苷酸和氨基酸水平上的序列相似性列于表中1。结果还表明，11CtFAD2这些基因与其他植物中同源的FAD2酶具有50%-65%的序列一致性。

目的:阐明红花的系统发育关系FAD2将得到的11条多肽序列与同源FAD2序列进行比对，并利用Vector NTI构建了相邻连接树。如图所示1CtFAD2-1和CtFAD2-10相邻排列，并与其他种子表达的fad2相邻排列，如向日葵的HaFAD2-1和棉花的GhFAD2-1。CtFAD2-2与其他组成型表达基因(如向日葵HaFAD2-2和HaFAD2-3)排列在一起。ctfad2 - 3,4,5,6和7形成了一个新的分支，很可能是最近才分化出来的。有趣的是，它深嵌在一个功能不同的FAD2脂肪酸修饰酶(如脂肪酸乙酰化酶和环氧化酶)的进化枝中。CtFAD2-11还与来自几种植物物种的脂肪酸乙酰化酶结合在一起，包括由真菌激发子诱导的向日葵vFAD2 [39]。

假定的CtFAD2s多肽序列与选定的植物同源物的比对在(附加文件)中给出1:图S1)。与其他植物FAD2类似，CtFAD2s的假定多肽在c端含有一个芳香氨基酸丰富的基序，这对于维持内质网的定位是必要和充分的[40]。与其他植物膜结合脂肪酸去饱和酶一致，推定多肽均来自11种红花CtFAD2cdna包含三个高度保守的富含组氨酸的基序，这些基序与生化催化中使用的二铁氧复合物的形成有关[41]。除CtFAD2- 2和CtFAD2 -6分别具有HDCGHH和HDLGHH外，大多数CtFAD2推定多肽序列的第一个组氨酸基序为HECGHH。在CtFAD-8 (HECGHQ)中，最后一个氨基酸His (H)转化为Gln (Q)。我们在55种植物FAD2酶中比较了这一基序，发现H - to - Q的取代也存在于从植物中分离出来的FAD2同源物中Lesquerella lindheimeri主要具有脂肪酸羟化酶活性[42]。第二个组氨酸基序在几个红花FAD2s中作为HRRHH高度保守，包括CtFAD2-1、2、8、9和10。值得注意的是，CtFAD2-11在基序的+3处发现了Asn (N)取代，这与许多功能分化的fad2一致，包括Crepis阿尔CREP1 (ABC00769),c .巴勒斯坦Cpal2 (CAA76156)和向日葵vFAD2 (AY166773.1);金盏花officinalisFAC2 (AF343064.1),黄雏菊属hirtaacetylenase (AY166776.1)。在CtFAD2-3、4、5、6和7的这个位置发现Ser (S)或Thr (T)取代。

在CtFAD2-1、2,9,10中，第一个组氨酸盒前面的氨基酸是Ala (A)，与其他植物FAD2 Δ12油酸去饱和酶一致。在CtFAD2-5中，Ala被Val (V)取代，而其他六种CtFAD2酶在这个位置上有Gly (G)。它是由Cahoon提出的et al。［39]，除了Δ12羟化酶外，在功能不同的FAD2酶中，在这个位置上发现了Ala的Gly取代。值得注意的是，只有CtFAD2-11具有DVTH基序，位于第三个组氨酸盒的-5至-2位置，这与所有植物乙酰化酶中出现的(D/N)VX(H/N)基序相吻合[43]。紧跟在ctfad2 - 1,2,10的第三个组氨酸盒后面的五个氨基酸与其他已知的植物FAD2 Δ12油酸去饱和酶一样，是LFSTM。相比之下，CtFAD2-9在这个位置上有一个LFSYI基序，在+4和+5位置上有两个氨基酸取代。在ctfad2 - 3,4和7中，+3位置的S被Pro (P)取代，Pro (P)也只存在于其他FAD2脂肪酸偶联物中，包括来自金盏花officinalis(FAC2, Genbank AAK26632)瓜蒌(基因库AAO37751)。

结果表明，大豆种子特异性GmFAD2-1序列的Serine-185在种子发育过程中被磷酸化[44]，作为其酶活性的调节机制。在11种红花FAD2酶中，只有种子特异性FAD2酶CtFAD2-1具有与大豆FAD2-1相对应的丝氨酸。这是诱人的预测相同的翻译后调控机制FAD2包括丝氨酸-185在内的靶点磷酸化表达可能在红花种子发育和油脂积累过程中调节微粒体Δ12油酸脱饱和中起重要作用。

基因组结构和进化研究CtFAD2红花基因家族

在阐明基因结构的背景下FAD2来自红花，位于5的内含子^”UTR的FAD2基因分离。从11朵红花中取出FAD2预测了该内含子的cDNA序列、典型剪接位点(AG:GT)，设计了PCR引物，用于从基因组DNA中扩增该内含子。预测的5^”从11个样本中有8个获得内含子CtFAD2基因,包括CtFAD2-1， -2， -3， -4， -5， -7， -10和-11年。这些主要的DNA序列的主要特征CtFAD2内含子汇总于表中2。内含子没有从CtFAD2-6 8和9，可能是因为5^”内含子所在的UTR在我们的克隆中是不完整的。所有8个内含子序列均位于5^”UTR，位于假定的起始密码子(第一个ATG)上游11至38 bp之间的位置。内含子长度在114 ~ 3090 bp之间变化，其中，基因型的内含子长度为1144 bpCtFAD2-1在大小上与在FAD2拟南芥信息资源;http://www.arabidopsis.org)、棉花[45]和芝麻(胡麻属indicum) [46]。5 .相对位置的变化和大小的巨大差异^”-UTR内含子是红花的结构差异FAD2基因，这在基因的差异表达中可能很重要。大内含子存在于5^”utr的FAD2基因可能在表达调控中发挥重要作用，因为有报道称它对芝麻中报告基因的表达有积极影响[46]。等效内含子也被证明是转录后基因沉默的有效靶标FAD2在大豆中[47]。

假设的剪接位点，在两个5^”外显子/内含子和3^”内含子/外显子在大多数情况下都以AG:GT的形式保守CtFAD2基因，除了5^”外显子/内含子(TG:GTCtFAD2-10和两个5^”外显子/内含子(AG:CT)^”内含子/外显子(TT:GTCtFAD2-11。然而，内含子序列本身都是高度发散的，它们之间没有明显的同源性。这些内含子序列富含AT, AT含量在61% ~ 75%之间，与其他双内含子序列一致。利用PLACE程序分析内含子序列(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)确定了几个假定的顺式调控要素。例如，一些通常存在于种子特异性启动子中的基序，如ABRE和SEF4，被定位在种子特异性启动子中CtFAD2-1。同样，一个ag基序通常存在于各种应激诱导的防御相关基因的启动子中，如损伤或激发子处理，位于CtFAD2-3在红花幼苗的下胚轴和子叶中特异表达的基因。

分析红花CtFAD2基因家族进行Southern blot分析

问题的复杂性FAD2通过低严格Southern blot分析红花FAD2基因家族，证实红花FAD2是由一个复杂的多基因家族编码的(图2)2)。由各种限制性内切酶衍生出的限制性内切片段模式与10种以上一致FAD2红花的基因。杂交信号强度的变化反映了与所用探针DNA序列相似性的相对水平。

的表达谱CtFAD2不同组织中的基因

确定各种组织的表达模式CtFAD2对SU基因型红花的子叶、下胚轴、幼苗的根和叶组织以及花组织和发育胚中提取的总RNA进行RT-PCR分析，在不加逆转录酶的对照反应中扩增40个循环后未检测到产物，说明RNA样品中不存在基因组DNA。

如图所示3.，CtFAD2-1在发育中的种子中特异表达，在被检测的体细胞组织中几乎没有表达。CtFAD2-2在种子和所有其他组织中表达水平很低。CtFAD2-4， -5， -6， -7， -8， -9在发育中的胚胎中不表达。低，但可检测的水平CtFAD2-10-11在发育中的种子中也有表达，尤其是在发育后期。CtFAD2-4， -6， -7， -9和-11年在幼苗子叶、下胚轴等组织中高表达。CtFAD2-5和8似乎是根特定的CtFAD2-10主要在花组织中表达，在其他组织中表达水平相对较低。

红花的表达CtFAD2基因在酿酒酵母

酵母中的表达(酿酒酵母)细胞已成功用于研究几种植物FAD2 Δ12油酸脂肪酸去饱和酶的功能特性[19，48，49因为它具有简单的脂肪酸谱，含有充足的油酸，可以作为FAD2酶的前体，并且缺乏内源性FAD2活性。如图所示4用空pYES2载体转化的对照酵母细胞不产生C16:2和C18:2等多不饱和脂肪酸。C16:2和C18:2脂肪酸甲酯(FAMEs)的保留时间分别为8.513 min和11.293 min，通过标准气相色谱分析，发现C18:2存在于表达酵母系中CtFAD2-1(图4 b)，CtFAD2-2(图4摄氏度)，CtFAD2-10(图4 eC16:2在酵母系中表达CtFAD2-9(图4 d),CtFAD2-10(图4 e)。结果表明，CtFAD2-1、CtFAD2-2和CtFAD2-10是将油酸转化为亚油酸的Δ12油酸去饱和酶。CtFAD2-9似乎是一种Δ12棕榈油酸去饱和酶，倾向于C16:1而不是C18:1底物，导致C16:2的特异性产生。如图所示4 f和图4 g的表达CtFAD2-11在停留时间分别为10.642 min和11.293 min时，形成了两个小而明显的峰。后一个峰对应于亚油酸的FAME (18:2)^{Δ9 (Z), 12 (Z)})，前一个峰被鉴定为其Δ12反式异构体(C18:2)的FAME^{Δ9 (Z), 12 (E)})和2,4-二甲基氯唑啉(DMOX)修饰(附加文件)1:图S2)。表达酵母细胞的脂肪酸组成CtFAD2-1， -2， -9， -10和-11年如表所示3.。如表所示3.的表达CtFAD2-9产1.6% C16:2，无C18:2。在表达的酵母细胞中未检测到新的峰CtFAD2-3,4,5,6,7，以及——8。

为了检验是否有任何CtFAD2具有脂肪酸羟化酶活性，从表达11种CtFAD2的酵母细胞中制备FAMEsCtFAD2基因与一种硅化试剂反应，这种试剂可以将羟基残基转化为tms -醚衍生物，从中可以检测质谱。然而，在任何表达的酵母细胞系中都没有检测到常见脂肪酸的羟基衍生物，例如由油酸合成的蓖麻油酸CtFAD2这表明CtFAD2酶中缺乏脂肪酸羟化酶活性。在半乳糖诱导的酵母培养物中添加游离亚油酸，进一步测试以亚油酸为底物的环氧酶和乙酰化酶活性。没有检测到代表环氧或乙炔脂肪酸的新峰(数据未提供)。

中的瞬态表达式n benthamiana叶子

CtFAD2-11的功能最初是通过在酿酒酵母，两种新型脂肪酸经GC-MS鉴定为18:2^{Δ9 (Z), 12 (Z)}和第18章第2节^{Δ9 (Z), 12 (E)}分别。与从酵母中获得的结果一致，CtFAD2-11由35S CaMV启动子驱动n benthamiana叶，共表达35 s: P19产生了一种新的产品，不存在于n benthamiana叶浸染时35 s: P19单(图5)。新产物甲酯的GC保留时间为8.642 Min，与甲基的GC保留时间为18:2相同^{Δ9 (Z), 12 (E)}(图5 b)。小说18:2^{Δ9 (Z), 12 (E)}占瞬时表达叶片脂肪酸的0.4%CtFAD2-11(表4)。此外，在保留时间为10.642 min时，检测到另一个在酵母培养物中未观察到的新峰(图2)5 b)。该新脂肪酸的总离子色谱和质谱与戊二酸(9-十八烯-12-癸酸)一致(另附文件)1:图S3)，表明CtFAD2-11多肽具有Δ12-acetylenase活性，这表明它与已知的Δ12脂肪酸乙酰化酶序列非常接近。如表所示4， crepenyic acid占总脂肪酸的0.5%n benthamiana叶子表达CtFAD2-11。

值得注意的是，的表达CtFAD2-11短暂地n benthamiana细胞导致饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸显著增加，而包括亚油酸和α-亚麻酸(ALA)在内的多不饱和脂肪酸则相对于未转化的对照(表1)4)。总的来说，酵母和n benthamiana表达实验表明，CtFAD2-11主要作为一种缺乏立体特异性的Δ12油酸去饱和酶，产生亚油酸及其反式-Δ12异构体。此外，它还可以进一步使亚油酸的Δ12双键去饱和，形成苯甲酸的乙炔键。

另外10个CtFAD2基因也在n benthamiana但与对照组相比，我们没有观察到任何额外的新型脂肪酸的产生(数据未提供)。

我们在这里报道了11种不同红花的克隆CtFAD2其中不包括至少三个部分严重截断的EST序列，这些序列也存在于CPG红花EST数据库中。此外，由于目前缺乏红花基因组学信息，尚不清楚是否存在其他未表达的FAD2成员。据我们所知，这是最大的一次FAD2在迄今为止所研究的任何物种的基因家族中。尽管它们对假定的氨基酸序列高度保守，个体CtFAD2基因有明显的区别特征，特别是在它们的N端和c端，5^”和3^”内含子的大小、位置和序列^”UTR。

FAD2是植物脂肪酸去饱和酶基因家族中研究最好的，在分子和生化研究方面。虽然在拟南芥中只发现了一个代表[11]，FAD2在目前研究的大多数其他植物基因组中，似乎存在复杂的基因家族。两个截然不同的FAD2大豆[29]，亚麻[50，51]和橄榄[49];向日葵的三个基因[52),亚麻荠漂白亚麻纤维卷［53];棉花中的四个基因[31- - - - - -34]。在两性四倍体中芸苔属植物显著4-6不同FAD2在每个二倍体亚基因组中已鉴定出基因[30.]。

虽然缺乏可比的研究，但红花似乎是不寻常的FAD2基因家族进化。红花是一种自花授粉的二倍体植物，与野生二倍体亲缘关系最为密切c . palaestinus广泛的基因组复制或重排在以前的红花中没有报道[54]。在缺乏基因组数据的情况下，尚不清楚FAD2基因拷贝数的显著扩增是否也发生在红花的其他基因家族中。然而，我们自己对其他红花脂质生物合成基因的有限观察并没有显示出这种扩展基因家族大小的证据(未发表的数据)。

复杂的FAD2家族不能归因于选择性剪接Fad2基因在编码区序列中不含内含子。相反，基因复制更有可能是造成FAD2红花的家族复杂性。基因树的拓扑结构表明，基因复制可能发生在几个层次上，即在进化的不同时期。例如，CtFAD2-3， -4， -5它们之间的亲缘关系比它们与其他红花之间的亲缘关系更密切吗FAD2序列，表明最近的基因复制是导致这一进化支出现的原因。目前还不知道有多少人FAD2基因是在红花物种形成后产生的，换句话说，是红花所特有的c . tinctorius物种。分析FAD2来自相近植物物种的基因，如来自属的基因矢车菊属也许可以更好地了解复制事件发生的确切时间。

遗传冗余是植物基因组的主要特征，在保留重要基因原始功能的同时，为其他不同功能的进化提供了机会。为了在长时间的进化中持续存在，新的基因复制必须得到积极的选择，否则它们可能会通过积累无义突变、帧移位甚至插入/删除事件而退化为假基因。一旦成为假基因，可能的命运是继续以最大的速度积累突变，并变得越来越分散。事实是所有的11CtFAD2基因被表达和翻译的证据表明，至少这些是复制的FAD2红花的基因是正向选择的。由于目前的研究主要集中在表达上FAD2基因，是有可能被别人复制的FAD2基因可能通过基因假原化或基因缺失而失去表达和功能。

通过FAD2催化的Δ12去饱和反应生成亚油酸是生物膜系统、细胞信号传导、热适应和能量储存功能的核心[55]。当植物受到不利的环境条件时，细胞会发生各种各样的反应，包括膜脂肪酸不饱和水平的调整。由结构和流动性决定的植物膜的完整性和功能受到脂质组成，特别是脂肪酸去饱和程度的显著影响[23]。冷、热、干旱和盐等非生物环境胁迫都能引起脂肪酸组成的变化。的表达FAD2也受不利环境因素的调节，提示可能涉及FAD2植物对非生物胁迫的响应[j]24]。近年来，一些FAD2-在红花所属的其他菊科植物中发现了不同的基因，如万寿菊(金盏花officinalis)，Crepis阿尔向日葵(向日葵) [15，39，56]并与不同脂肪酸结构的合成有关，这种结构可能在抵抗生物压力方面发挥作用。例如，环氧化脂肪酸被发现是稻瘟病菌孢子萌发和扩大的有效抑制剂[57]。其他不寻常的脂肪酸，乙酰脂肪酸，参与聚乙炔的生物合成，在包括红花在内的许多菊科物种中作为植物抗菌素，因此在植物抗病方面起着重要作用[58- - - - - -60]。

令人好奇的是，分歧者是如何FAD2具有相似基本特性的基因家族成员执行特定的功能。内在特征各不相同FAD2以一些保守的基序为例，基因可能决定了它们独特的表达模式和对环境刺激的反应能力，以及多样化的功能。通过位点定向诱变已经证明，改变a的酶功能只需要很少的氨基酸改变FAD2基因。例如，FAD2脂肪酸去饱和酶只需改变4个氨基酸就能获得羟化酶活性，相反，替换6个氨基酸就能将脂肪酸羟化酶转化为脂肪酸去饱和酶[21]。Δ12乙酰酶来自Crepis阿尔在29个位置偏离Δ12去饱和酶[15]，但尚未确定需要多少这些更改来促进功能更改。这表明，从去饱和酶到乙酰化酶的转换可能涉及比脂肪酸去饱和酶和脂肪酸羟化酶之间交换所需的更广泛的序列变化。目前，从一级序列水平的比较来看，导致乙酰化酶和去饱和酶的特异性起源尚不明显，促进乙酰化酶活性的残基尚未确定。有趣的是，在所有已知的乙酰化酶中，与典型的脂肪酸去饱和酶或羟化酶不同，Gly取代了第一个His盒子前的氨基酸上的Ala。该残基可能通过提供底物口袋空间灵活性以允许“扭结”底物转化，从而减轻空间位阻，从而促进乙酰化酶的化学反应(独联体-烯)变成直链产物(乙炔)[61]。

我们已经确定了，虽然功能很大FAD2基因家族只存在于红花中FAD2-1在红花种子发育中有高表达。这一基因似乎在野生型(高亚油酸)红花种子储存油中产生非常高水平的亚油酸方面起着主要作用。FAD2-2，假定的管家微粒体Δ12油酸去饱和酶在整个植物中具有普遍的组成表达。有趣的是，在这项研究中，我们发现CtFAD2-2与所有其他红花组织相比，在幼苗的子叶组织中有显著更高的表达。虽然CtFAD2-2可能对红花营养组织中油酸去饱和酶的整体活性有贡献(Fad6在其中也起着重要作用)，但CtFAD2-2可能在种子油中亚油酸的产生中只起次要作用。

的表达式CtFAD2-9导致棕榈油酸(C16:2)的特殊合成^Δ9日12)，可能是由棕榈油酸去饱和产生的。已经确定的是，C16饱和脂肪酸棕榈酸的初始去饱和发生在质体中，通过硬脂酰acp Δ9-desaturase的作用形成棕榈油酸，棕榈油酸可以输出到细胞质中，并通过FAD2油酸盐结合到磷脂中进一步去饱和Δ12-desaturase [12]。据我们所知，红花CtFAD2-9是第一个被描述的专门生产棕榈油酸的FAD2酶。棕榈油酸通常不会在植物组织中大量积累，因为它在营养组织中会通过大量的Δ15-desaturase迅速转化为十六烷四烯酸(C16:3)，而在种子组织中，C16:1底物的可用性有限。在橄榄叶和中果皮组织中，观察到棕榈油酸的积累增加是对伤害的反应[62]。结果表明，受伤橄榄中果皮棕榈油酸的增加是由于叶绿体合成可作为前体的六烯三酸对底物的需求增加所致通过参与植物防御和伤害的信号分子脂氧合酶途径[j]63]。然而，与C18多不饱和脂肪酸相比，C16多不饱和脂肪酸在氧脂素生物合成中的作用较少。在红花中产生棕榈油酸的CtFAD2-9的具体进化驱动是什么还有待揭示。

其中有11种红花CtFAD2的基因,CtFAD2-10是第一个特征FAD2种子结实期前在红花头中优先表达的基因。然而，这与棉花的情况相似，在编码FAD2的四个不同基因中，分离出一个成员，ghFAD2-1,在发育中的花蕾和种子中都有特异性表达[33]。已知ALA衍生的茉莉酸作为控制雄蕊和花粉发育的化学信号，在拟南芥花粉发育和花药开裂的最后阶段起着重要的作用[28]。因此，作为ALA的前体，FAD2促进亚油酸的产生可能在花的发育中起重要作用。很可能是保留CtFAD2-1作为一种强大的Δ12-desaturase为合成储存种子脂质释放了复制CtFAD2-10为了多样化，形成一种特殊的花型。基因的进化修饰CtFAD2-10以牺牲种子表达为代价而有利于花表达的基因不太可能产生任何负面的适应性后果CtFAD2-1种子表达和种子脂质中油酸与亚油酸比值的适度变化对适合度的影响相对较小。

我们证明CtFAD2-11 Δ12乙酰化酶是一种三功能酶，可以使油酸和亚油酸脱饱和。它从酵母细胞中的油酸中产生C18:2的Δ12(Z)和(E)异构体的混合物。在植物细胞中，CtFAD2-11也能产生crepenyic acid (C18:2)^{Δ9 (Z)}从亚油酸中分离出-十八烯十二烯酸酯(-octadecen-12-ynoate)n benthamiana叶子。这样的多功能已经在Crepis阿尔CREP1可以同时产生这两种物质独联体和反式C18:2脂肪酸的异构体，除了在转基因拟南芥中产生戊二酸外[22]。当在酵母中表达时，CtFAD2-11产生更高水平的C18:2^{Δ9 (Z), 12 (E)}比亚油酸含量高，与拟南芥种子中CREP1的表达一致[22]。C18:2^{Δ9 (Z), 12 (E)}已被确定为明显的代谢死胡同，因为它不能进一步转化为戊二酸。的独联体和反式fad2介导的Δ12油酸脱饱和可能具有非常相似的催化机制，但在底物结合特性上有所不同。与正常的FAD2油酸盐相比独联体-Δ12去饱和酶，CtFAD2-11可能在活性位点改变了底物相互作用的几何形状。限制性较小的结合袋可以允许基板的小旋转并允许E/Z混合物的形成。之前已经证明了C18:2^{Δ9 (Z), 12 (Z)}是由C12和C13的前r氢抽离而产生的，而和C18:2^{Δ9 (Z), 12 (E)}是由(12R,13S)氢[22]。

看起来Δ12反式-双键是由一种特殊的FAD2酶在红花和牡丹中产生的乙酰脂肪酸的副产物。的反式油酸脱饱和形成C18:2^{Δ9 (Z), 12 (E)}另一种功能不同的FAD2酶也证明了这一点，即来自tung (粉砂fordii)，其中显示反式-Δ12油酸去饱和酶活性，以及它的偶联酶活性[19]。a的生产反式双键，同时产生其他不寻常的脂肪酸，如月历酸(C18:3)^{8 (E), 10 (E), 12 (Z)})和二态胆酸(9OH-18:2)^{Δ10 (E), 12 (E)})Dimorphotheca弯弯曲曲的不同的FAD2脂肪酸修饰酶也有报道[20.，45，64]。

的瞬态表达式系统n benthamiana叶子，我们已经观察到表达CtFAD2-11以牺牲多不饱和脂肪酸为代价，增加了饱和脂肪酸和单烯脂肪酸的相对比例。这与先前在拟南芥和棉花中观察到的乙酰化酶和环氧化酶的表达一致[65，66]。产油酸，通过适度的种子特异性表达c .巴勒斯坦Δ12-epoxygenase (Cpal2与野生型种子相比，拟南芥和棉花种子中的亚油酸积累增加，而亚油酸积累减少。的后续共表达式c .巴勒斯坦Δ12去饱和酶(cpd),Cpal2显示恢复正常的油酸去饱和，因此进一步提高了羊油酸水平。这突出表明底物可利用性是控制FAD2去饱和酶活性发散的一个因素。亚油酸水平降低的潜在替代机制n benthamiana树叶表达CtFAD2-11基因可能包括一定程度的基于同源性的转录后沉默Δ12-desaturase成员FAD2或CtFAD2-11和FAD2 Δ12-desaturase蛋白之间可能形成的潜在无效的异源二聚体[67]。

根据序列比对，CtFAD2-11与向日葵vFAD2最密切相关，vFAD2是一种真菌诱导的Δ12脂肪酸乙酰化酶，在发育中的大豆体细胞胚中表达时可以产生crepenynate和(14Z)-脱氢crepenynate []39]。发散FAD2与向日葵具有相同催化功能的基因vFAD2也从许多植物物种中分离出来，包括EIl12源自parsley (Petroselinum crispuml。)，c . officinalis和英国常春藤(常春藤l .) [39]。虽然与vFAD2序列同源性高于c·阿尔CREP1，表达于n benthamianaCtFAD2-11被证明具有与CREP1相同的功能，它没有额外合成(14Z)-脱氢萜烯酸vFAD2例如基因。

在红花的各种组织中没有观察到乙炔脂肪酸或任何其他由不同形式的FAD2酶合成的不寻常脂肪酸的积累，这与之前的研究结果一致c·阿尔和h . annuus即使检测到基因表达，花组织[39，68]。识别这种不寻常脂肪酸的隐性表达的功能和控制机制是脂肪酸代谢的一个很少被探索的方面。很可能乙炔脂肪酸的合成量很低，并迅速代谢形成二级生物活性分子。crepenyic酸和脱氢crepenyic酸被认为是生物活性聚乙炔化合物生物合成途径的中间体，已知存在于红花以及其他一些菊科、蜂科和五缘科植物中[59，60，69，70]。然而，形成假定的抗真菌聚乙炔所需的许多基因需要被发现和研究在活的有机体内功能发散的FAD2(s)在聚乙炔途径中的功能仍有待确定。

除了上面提到的红花FAD2基因，另外六个CtFAD2基因,从CtFAD2-3通过对CtFAD2-8，在幼嫩红花幼苗的子叶、下胚轴和根等快速扩张的组织中高度表达。不清楚为什么是多重的FAD2基因会在红花幼苗组织中表达，尽管FAD2的表达增强和亚油酸的产量增加在向日葵的子叶中已经被观察到。52，71]。然而,这些CtFAD2考虑到它们的初级序列特征与功能上不同的FAD2同源物更密切相关，并且它们在酵母中表达时无法合成亚油酸，这些基因可能更有可能执行除油酸去饱和酶以外的反应。

11个全长的鉴定与初步表征FAD2cdna及其相应的结构基因提供了深入了解在红花籽油合成亚油酸的主要决定因素。这也为充分了解单一植物物种中FAD2蛋白的基本功能和多样性及其不同脂肪酸修饰提供了前所未有的机会。每种生物化学性质的表征FAD2吉恩将进一步深入了解他们的潜在角色。确定分散的FAD2酶的特定结构属性，控制其区域和化学选择性，将大大加快微粒体脂肪酸去饱和酶的结构功能表征的可用性，这是一个难以捉摸的目标，将对脂质代谢研究产生广泛的影响。通过RNAi下调各基因的表达来确定转基因植株的表型FAD2基因将有助于澄清FAD2成员归因的途径。最终，在基因工程作物中使用不同的FAD2酶来生产新型脂肪酸，如crepenyic酸，不仅可以为植物提供免受疾病或害虫侵害的机会，而且还可以合成具有经济价值的油脂化学产品。

植物材料和生长条件

野生型(高亚油酸)红花种子(Carthamus tinctoriusL.)来自澳大利亚的一家商业鸟食供应商，并被指定为基因型SU。SU红花植物从种子开始在温室中珍珠岩和砂壤土盆栽混合物中生长，在16小时(25°C)/8小时(22°C)的昼夜循环中生长。植物组织包括叶、根、子叶和下胚轴从萌芽的红花幼苗取样。在开花第一天获得花头，在种子发育的早、中、晚三个阶段收获发育胚。样品立即在液氮中冷冻，保存在-80°C，直到提取DNA和RNA。

总RNA提取和cDNA合成

使用RNeasy®Plant Total RNA试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从100 mg冷冻红花组织中分离总RNA。采用NanoDrop™分光光度计ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia)测定RNA浓度，分析前将浓度平衡。用标准RNA甲醛琼脂糖凝胶(1%，w/v)观察质量和相对数量。然后用RQ1 RNase-free DNA酶(Qiagen, Hilden, Germany)处理总RNA以去除污染的基因组DNA。利用SuperScript III First-strand Synthesis System (Qiagen, Hilden, Germany)和oligo(dT)从400 ng无dna的总RNA合成第一链cDNA。_20.底漆，按照制造商的说明。

红花发育胚cDNA文库的构建与筛选

隔离FAD2利用红花发育胚构建了一个lambda cDNA文库。收集不同发育阶段的未成熟胚胎混合物，在液氮中研磨成粉末，并按照制造商的说明(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)使用TRIzol进行RNA提取。采用Qiagen mRNA纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)分离Poly(A)-containing RNA。根据生产商的说明书(Stratagen, La Jolla, CA, USA)，使用Stratagene cDNA合成试剂盒合成第一链寡核苷酸(dT)引物cDNA，并将其转化为双链。将钝端cDNA与生态RI适配器，磷酸化，并在Chroma自旋+TE-400色谱柱中通过凝胶过滤进行大小分级(Clontech, CA, USA)。重组体在细胞中繁殖大肠杆菌菌株XL-1 Blue MRF '使用Stratagene预消化的λZAP II/生态RI/CIAP克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

为了识别FAD2cDNA文库采用拟南芥编码区对应的DNA片段进行筛选FAD2遵循先前描述的协议[31]。通过连续两轮筛选纯化阳性斑块，纯化的噬菌体含有假定的FAD2按照Stratagene(美国)公司的说明书(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中概述的方法切除cDNA。序列分析FAD2序列由NCBI Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。利用向量NTI预测开放阅读框。

的全长和开放阅读框(ORF)的隔离FAD2非种子组织中表达的基因

我们还查询了红花的合成基因组计划(CGP)表达序列标签(EST)数据库(http://cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2。)，经Blast筛选与拟南芥相似FAD2序列(AT3G12120)。假定的红花FAD2比较EST序列，选择不同contigs中最强hit的最长EST克隆，通过执行3扩展到全长^”使用Bioline一步RT-PCR试剂盒按照制造商的说明(Bioline，伦敦，英国)快速扩增cDNA末端(RACE)。每个选择的ESTs都使用基因特异性引物(GSP)，并与带A的poly(dT)引物结合使用不我的位置是3^”结束。第二轮PCR使用嵌套GSP结合poly(dT)引物进行。3国的普惠制^”RACE在附加文件中列出1表S1。一步逆转录酶PCR反应以200 ng RNA为模板进行，首先在50°C条件下进行初始逆转录反应30分钟，然后在95°C条件下进行3分钟，然后在95°C条件下进行30秒，55°C条件下进行30秒，72°C条件下进行1分钟，最后在72°C条件下延长10分钟。5的克隆^”结束CtFAD2-6用5^”RACE系统套件(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)遵循制造商的说明。只有CtFAD2-6利用基因特异性引物GSP1将mRNA逆转录为cDNA, 5^”- acctaacgacagtcatgaacaag -3^”。基因特异性引物GSP2, 5^”- gtgaggaaagcggagtggacaac^”用于第一次PCR扩增。在加入聚合酶之前，在95°C热启动4分钟，在94°C变性45秒，在55°C退火1分钟，在72°C延伸2分钟，33个循环。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，纯化出预期大小的DNA片段，并将其亚克隆到载体pgm - teasy®(Promega, Madison, WI, USA)中，并使用ABI 373测序仪进行DNA测序确认。

的orfFAD2使用相同的一步RT-PCR试剂盒(Bioline，伦敦，英国)对来自几种红花植物组织的总rna和PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(Stratagen, La Jolla, CA, USA)进行扩增。引物(附加文件1:表S2)用于扩增的orf是根据位于5的DNA序列设计的^”和3^”每个基因的UTR。扩增的PCR产物被克隆到载体pGEM-Teasy®(Promega, Madison, WI, USA)上，并通过DNA测序进行验证。克隆的扩增产物用基因名进行标记FAD2后缀表示属的第一个字母(C代表。Carthamus)和物种(t代表)tinctorius)。

DNA分离及Southern blot分析

采用Paterson描述的方法，用CTAB缓冲液从红花完全展开的叶片中分离出基因型SU的基因组DNAet al。(1993)。如前所述，使用CsCl梯度进行进一步纯化[31]。用7种不同的限制性内切酶对10个左右的红花基因组DNA进行酶切Acc我,Bgl2Bam你好,生态RI,生态房车,欣dIII,Xba我和Xho我。

用每种限制性内切酶酶切的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳。凝胶在0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl中浸泡30分钟，然后在Hybond-N上进行印迹⁺尼龙膜(英国Amersham)。用α-P探测滤光片³²dCTP-labeled红花FAD2DNA片段。杂交在6倍SSPE, 10% Denhardt 's溶液，0.5% SDS, 100 ug/mL变性鲑鱼精子DNA中进行，在65℃下过夜。在50°C下用2x SSC/0.1% SDS短暂洗涤后，在50°C下用0.2 x SSC/0.1% SDS洗涤三次，每次洗涤20分钟，然后进行放射自显影。

5的隔离^”的内含子CtFAD2基因

为了分离位于5号染色体上的内含子的DNA序列^”UTR的CtFAD2预测了5个基因的典型剪接位点(AG:GT)^”每个UTRCtFAD2根据预测剪接位点的侧翼序列设计cDNA序列和PCR引物。引物在附加文件中列出1:表S3。以红花SU基因型的基因组DNA为模板。扩增在50 μL反应中完成，100 ng基因组DNA，每种引物20 pmol，由制造商提供的Hotstar (Qiagen, Hilden, Germany)。PCR温度循环方法如下:94°C 15 min 1个循环，94°C 30 s, 55°C 1 min, 72°C 2 min 35个循环;使用Kyratec超级摩托车SC200 (Kyratec，昆士兰，澳大利亚)，72°C加热10分钟。在DNA序列测定之前，按照制造商的说明将PCR产物克隆到pGEM-T Easy®(Promega, Madison, WI, USA)中。

实时定量PCR

采用BIORAD CFX96™Real-time PCR检测系统和iQTM SYBR®Green Supermix (BIORAD, Hercules, CA, USA)进行RT-qPCR分析基因表达。设计的引物Tm(熔融温度)约为65°C，长度为19-23 bp，用于基因特异性扩增产物约100-200 bp的片段(附加文件)1:表S4)。PCR反应在96孔板上进行。所有反应均为三次。反应混合物(每孔10 uL)含有1 × iQTM SYBR®Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)， 5 μM正向和反向引物，400 ng cDNA。热循环条件为95℃3 min，依次为95℃10 s、60℃30 s、68℃30 s，共40次循环。PCR最后一步以0.1°C/秒的速度从60°C到95°C，通过熔化曲线分析来监测PCR扩增的特异性。此外，PCR产物也通过琼脂糖凝胶电泳检测纯度，并通过测序确认。组成型表达β-酮酰基酰基载体蛋白(ACP)合成酶II (KASII)基因作为内源参比。casii负责C16:0-ACP到C18:0-ACP的延伸新创植物中脂肪酸的生物合成。红花的适宜性KASII基因作为内参基因在不同组织和发育阶段的高表达稳定性得到了验证(未发表数据)。数据相对于相应的基因表达水平进行校准^-△△Ct相对定量方法[72]。数据以在独立的96孔板上进行的三个反应的平均值±SD表示。

的表达CtFAD2基因在酿酒酵母

包含红花整个开放阅读框的DNA片段CtFAD2从pGEM-Teasy载体上切除cdna作为载体生态RI片段重新连接到载体pENTR11 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的相应位点，然后使用Gateway®克隆重组技术(Stratagen, La Jolla, CA, USA)克隆到目标表达载体pYES2-DEST52，该载体具有GAL1启动子用于诱导基因表达。这些质粒中的基因序列分别通过DNA序列测定进行验证。将得到的质粒和缺乏cDNA插入的pYES2-DEST52载体导入烘焙酵母(酿酒酵母醋酸锂介导的YPH499细胞转化。这些的表达式CtFAD2酵母细胞中有或没有外源脂肪酸底物喂养的基因基本上如前所述[73]。每个实验都做了三个重复。

的瞬态表达式CtFAD2在烟草benthamiana叶子

每一个CtFAD2ORFs在双CaMV-35S启动子和an之间的修饰pORE04二进制载体上进行了定向克隆根癌土壤杆菌含有多聚腺苷化信号序列的NOS终止子[74]。从彼得·沃特豪斯博士的实验室获得了一种表达病毒抑制蛋白P19的载体。先前的研究表明，P19的共表达可以显著增强转基因的表达，从而防止宿主转基因沉默n benthamiana叶片瞬态分析[16，75，76]。农菌株AGL1携带35 s: CtFAD2在添加了50 mg/L卡那霉素的LB肉汤中，28°C摇晃培养2天，然后在含有5 mM MES, 5 mM MgSO₄100 μM乙酰丁香酮，在28°C下振荡培养3小时。将每种培养物稀释10倍后，用浸润缓冲液稀释10倍，与等体积的35 s: P19文化又渗透到底面充分展开n benthamiana正如沃内所描述的那样et al。［16]。在24°C下继续生长5天后，切除浸润的叶片区域，立即进行脂肪酸分析。

脂肪酸分析

脂肪酸甲酯(FAME)是通过酵母细胞中总脂肪酸的酯交换反应制备的，培养物离心后得到细胞微球[73]，或n benthamiana在80℃条件下，加入750 μL的1 N MeOH-HCl (Supelco)浸泡至少2小时，再加入500 μL 0.9% NaCl。用300 μL己烷提取FAMEs，在30 m BPX70柱上用Agilent 7890A气相色谱分析，基本与前面所述[77]只是升温程序改变为初始温度为150°C，保温1分钟，升温3°C/min至210°C，升温50°C/min至240°C，最终保温2分钟。通过2,4-二甲基氯唑啉(DMOX)改性和GC-MS分析确认FAME中的双键位置与前面描述的相同[77]，但在30米BPX70色谱柱上使用岛津GC-MS QP2010 Plus除外。柱温设定为150°C初始温度1 min, 5°C/min升温至200°C，然后10°C/min升温至240°C，保温5 min。质谱采集并使用GCMS溶液软件(Shimadzu, Version 2.61)处理。游离脂肪酸和FAME标准品购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。

FAD2：

微粒体Δ12脂肪酸去饱和酶

CtFAD2:

Carthamus tinctoriusFAD2

呃:

内质网

美国东部时间:

表达序列标签

NCBI:

国家生物技术信息中心

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

RT-qPCR:

实时定量逆转录聚合酶链反应。

该研究项目由澳大利亚谷物研究与发展公司(GRDC)提供资金支持。曹世江感谢中国国家留学基金委为我提供赴澳留学奖学金。我们还要感谢Anu Mathew、Luch Hac、Amratha Ashwin出色的技术支持。

从属关系

1. 联邦科学和工业研究组织植物工业，1600，堪培拉，ACT 2601，澳大利亚

   曹世江，周雪荣，Craig C Wood, Allan G Green, Surinder P Singh，刘青

2. 东北师范大学生命科学学院，长春

   曹世江，刘丽霞

相应的作者

对应到历下刘或清刘。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SC参与实验设计，进行实验，分析数据，撰写论文。XRZ参与实验设计，进行实验，CCW, AGG, SPS也参与了实验设计和论文撰写，LL参与了论文准备和实验监督，QL参与了实验设计，进行实验，监督所有步骤，分析数据并撰写论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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