qRT-PCR检测所有的表达Mal d 1isoallergen基因

背景

相当多的人患有对苹果的口腔过敏综合征(OAS)，导致避免食用苹果。苹果品种在致敏性方面差异很大，但对造成这种差异的原因的了解尚不完整。Mal - 1被认为是主要的苹果过敏原。对于Mal d1，存在广泛的等过敏原和变异体，它们由一个大的基因家族编码。为了鉴定可能与过敏有关的特定蛋白质/基因，我们开发了一种PCR检测方法来监测每个个体的表达Mal d 1基因。设计了基因特异性引物对，以利用不同品种间的序列差异Mal d 1基因。用两种方法验证了这些引物的特异性在网上和在体外技术。随后，该试验应用于两个栽培品种“Florina”和“Gala”的果皮和果肉。

结果

我们成功地开发了31个基因特异性引物对Mal d 1并将其纳入qRT-PCR检测。应用结果表明，有11个基因在果实中不表达。此外，还观察到细胞间的差异表达Mal d 1在果实中表达的基因。此外，表达水平与组织和品种有关。

结论

本研究中开发的分析促进了所有已知表达水平的首次表征Mal d 1基因以特定的方式存在。通过对不同水果组织和品种的实验，我们获得了有关基因与过敏原相关的知识。该研究为植物育种和免疫治疗的研究提供了新的视角。

越来越多的欧洲人对苹果过敏。在一项广泛的泛欧调查中，苹果是最常见的食物过敏之一，在24种食物中排名第四，在所有食物中排名第一蔷薇科水果(1]。因此，尽管苹果通常是人类饮食中健康的组成部分，但越来越多的人不能吃这种水果。不同苹果品种的致敏性差异很大[2，3.]，但对低致敏性和高致敏性的遗传基础的了解仍然不完整。

目前在苹果中发现的四类过敏原中，Mal d1被认为是中欧和北欧的主要过敏原[4，5]。在基因层面上，Mal d 1是一个复杂的基因家族，由31个不同的基因座组成，每个基因座编码不同的等过敏原[6]。此外，对于每个等过敏原基因，有一系列略有不同的等位基因可能编码等过敏原变异，这增加了Mal d1蛋白的可变性[6- - - - - -8]。越来越多的证据表明，等过敏原在致敏性方面可能存在很大差异，但目前尚不清楚这些蛋白质中哪一种与过敏有关。有几种方法用于量化Mal d1含量或基因表达;然而，这些研究都没有涵盖全部的Mal - 1等过敏原或Mal d 1基因。与betv1类似，Mal d1对胃蛋白酶的消化不稳定，并且在水果热处理后，IgE对Mal d1蛋白的反应性不存在[9]。Mal d1对高温和蛋白酶的敏感性阻碍了其蛋白质组学分析。此外，食物基质和污染物也可能影响蛋白质的提取。到目前为止，蛋白质组学主要用于量化苹果果实中Mal - 1含量的总量，而没有区分同种过敏原或变体，也没有在不完整的同种过敏原库中进行区分[10- - - - - -14]。目前，市面上只有少数从水果和蔬菜中提取的重组过敏原可用于免疫检测[15]，具有不同的抗体特异性[16]。

基于PCR的表达研究不受这些限制，特别是定量实时荧光定量PCR (qRT-PCR)是一种快速、高灵敏度和可重复性的基因表达研究技术。之前的一些研究Mal d 1基因显示了组织特异性和品种特异性的表达Mal d 1基因(17- - - - - -19]，以及环境条件的不同影响[20.，21研究人员已经报道了这些基因的转录。然而，这些研究并没有覆盖整个基因家族，也没有充分证明所使用的PCR引物对的基因特异性。

因此，有必要描述每个个体等过敏原的作用，以了解苹果过敏机制。因此，本研究的目的是通过实施qRT-PCR方法来检测这些基因的表达。一个全面的，稳健的，敏感的和负担得起的分析研究所有31个已知的表达Mal d 1基因单独发育。我们成功地使用这种方法生成了所有基因的完整表达谱Mal d 1两个品种果实中的等变应原基因。

对齐的Mal d 1基因

共计380人Mal d 1从文献和数据库检索DNA和EST序列(附加文件)1)，涵盖所有已知的31项Mal d 1[6]。从不同的苹果品种中获得的许多序列已经被标注为Mal d 1等位基因。对于其他人，根据相似程度，可以识别已知基因的新等位基因。比对后，不同基因编码序列的相似性为53.1% ~ 97.7%，同一基因内不同等位基因的相似性为95% ~ 99.8%。在蛋白水平上，各异变原之间的序列一致性从37% (Mal d 1.08和Mal d 1.11A, 102个AA替换)到96% (Mal d 1.06A和Mal d 1.06D, 7个AA替换)不等。从“金冠”全基因组序列中检索到的31个编码序列比对(附加文件)2)生成表型树(图2)1)。这棵树有5个分支，其中4个以前被描述为亚科I-IV [7]和一个在本研究中首次被分类的进化支，V亚科。V亚家族的三个基因(11月11日，d 1.11B和Mal 1.12)是世界上最遥远的Mal d 1家庭。

引物设计

该试验的发展始于特定引物对的设计。31的对齐Mal d 1《金冠》中的片段(图2A)只突出一个基因特有的snp。使用“金冠”序列作为框架，在比对中的其他等位基因序列中检查了这些snp跨同一基因等位基因的稳健性。每个序列平均检测到4个基因分化snp，只有这些snp被用于引物设计。例如，反向引物为Mal 1.02位于一个SNP区分Mal 1.02基因从所有其他基因(图2A).所有等位基因序列的比对Mal 1.02(图2B)显示该区域未存在额外的等位基因分化snp;因此，该区域是引物开发的理想候选者。数字2B给出了一个反向引物的例子Mal 1.01。除了引物设计的基因分化SNP (SNP nr. 2)外，该引物在5 '端含有1个等位基因分化SNP (SNP nr. 6)。一般来说，只包含基因分化snp的区域是引物设计的首选区域;然而，这些区域并不总是可用的。因此，31对引物中有12对含有等位基因分化snp(表2)1)。为了确保这些snp不会影响PCR扩增，只有当等位基因分化snp位于两个引物中的一个的5 '端时才被接受。对31个引物分别进行引物选择Mal d 1基因(表1)。

引物验证及qRT-PCR优化

设计的引物对的基因特异性通过四种方式进行验证。首先,一个在网上通过将引物序列与已知参考序列进行比对验证，确保这些引物仅与目标基因对应的序列完全匹配(数据未显示)。只有产生完美匹配的引物在第二验证步骤中通过基因组DNA的端点PCR进行评估;只保留了产生单个清晰条带的引物对。第三，直接排序Mal d 1对10个苹果品种进行扩增，以确保只扩增特定的目标序列(附加文件3.)。由于与cDNA相比，gDNA的复杂性更高，因此对gDNA产生的扩增子进行了测序，这可以保证引物对所有基因的特异性Mal d 1成员，独立于他们的表达。在验证的最后一步中，仅对具有与目标基因对应的独特序列的引物进行评估。在某些情况下，在61-63°C范围内提高退火温度(Ta)和/或将最终引物浓度从100 nM降低到70 nM后，可以获得这种特异性。一些扩增子序列揭示了新的Mal d 1已知基因的等位基因(附加文件)3.)。第四，通过单峰熔化曲线验证扩增特异性(图2)3.)，表明不存在非特异性扩增或引物二聚体。选择符合最后一条标准的引物对进行qRT-PCR检测。这些引物的熔化温度(Tm)见表1。

意料之中的是，在不同的菌株中检测到PCR效率的显著差异Mal d 1扩增子(表1(最后一列的斜率)，这是由于引物与目标snp的强制位置以及PCR条件的变化，以确保特异性。然而，选择了“标准曲线法”来抵消这些效率差异。特别是，当通过绘制log输入与dCt (Ct)得到的曲线的斜率值时，必须使用此方法Mal d 1基因- Ct肌动蛋白)在−0.1至0.1范围之外[23]，如本研究的情况(表1)1)。标准曲线质量高，因为观察到输入DNA与标准样品(连续稀释)的Ct值之间存在线性关系，所有基因的平方回归系数接近1。此外，所有qRT-PCR反应均使用标准样品，便于评价实验间的可重复性和数据的整合。

最后，比较了《Florina》和《Gala》的基因表达肌动蛋白，哥伦比亚大学和GAPDH为本研究选择最合适的内参基因。肌动蛋白在组织和品种间的表达高度稳定(图2)4)，因此，它是本研究的最佳参考基因。

应用程序:Mal d 1苹果不同组织的表达谱

在这项研究中，我们将这种新的qRT-PCR方法应用于苹果品种‘Florina’和‘Gala’的果皮和果肉。选择这两个品种是因为它们在皮肤点刺试验中的致敏特性不同[24]。此外，这两个品种已被广泛用于培育新的苹果品种，并正在进行转基因研究，以提高“Gala”对苹果生产中主要病害真菌的抗性秦冠在没有抚养的情况下通过基因转移Mal d 1水平(25]。

在31人中Mal d 111个基因在果实组织中不表达。这些基因分别包括II亚家族的全部基因和III亚家族和IV亚家族的部分基因Mal d 1.06D,1.13摄氏度和- - - - - -1.14,和Mal d 1.03B,1.03 h,-1.03我,1.03 j,-1.09)(图5)。在这些果实中表达的20个基因分别包括I亚科和V亚科的全部基因和III亚科和IV亚科的部分基因Mal d 1.06A;-1.06 b,-1.06摄氏度,-1.13一个,-1.13 b,-1.13 d和- - - - - -1.03一个,-1.03摄氏度,-1.03 d,-1.03 e,-1.03 k,-1.03 f,-1.03克,-1.07,-1.08)。基因间、组织间和品种间转录本水平差异显著(P<0.0001)。

关于基因之间的表达差异，I亚家族的两个基因(Mal 1.01和- - - - - -1.02)的表达量最高，是其他品种的10 ~ 1万倍Mal d 1这些基因的RNA总和超过了所有其他基因的总和。Mal 1.01是表达最多的基因，在' Florina '的果皮中表达约60 A.U.。气温1.03℃是表达量最少的基因，转录物水平接近检测极限。

果实组织间基因表达差异明显，两个品种苹果果皮中基因表达量均显著高于果肉。V亚家族的基因是唯一的例外，如11月11日和- - - - - -1.11 b在果皮和果肉中显示出相似的表达水平，而且Mal 1.12在“Gala”水果中，果肉比果皮更能表现出来。

通过对两个品种的比较发现，‘Florina’总体上比‘Gala’表现出更高的表达水平，这与之前关于有限数量表达的研究结果一致Mal d基因(19]。具体来说，在20个基因中，有15个基因在“Florina”中表达更高，平均增加了60%。剩下的5个基因，Mal d 1.03A,1.03 k,1.06,1.06摄氏度和- - - - - -1.07，属于亚科III和IV，在“Gala”中比在“Florina”中表达得更多。

本文所描述的实验结果提供了个体等变应原在Mal - 1相关苹果过敏中的作用。该试验是基于一套完整的引物，适用于表达研究的每一个Mal d 1用qRT-PCR检测等过敏原基因。所有引物都通过了多次验证和优化评估，现在可以在广泛的实验中使用。这种方法可以相对较快地应用于其他过敏原基因已经定位、有参考基因组序列、对基因和等位基因多样性有一定了解的作物，如桃子Pru p 1基因(6，22，26]。

qRT-PCR检测

基因表达的研究是一种信息丰富的方法，这一试验的首次应用得到了证实Mal d 1作为一个异质基因家族，尽管具有高度相似的序列，但表现出不同的表达模式。对于单拷贝基因，qRT-PCR技术是一种高灵敏度和可重复性的技术，与微阵列方法相比，具有大的动态范围[23]，而不需要强大的生物信息学知识、昂贵的设备或特殊的专业知识。qRT-PCR也相对便宜，特别是当使用SYBR绿色化学时，如在本研究中，选择了初始准确的引物并采用了适当的方法。在这里，我们证明了qRT-PCR对一个大基因家族评估的适用性，由此我们通过使用序列多态性在3^”至少一个引物的末端和严格的PCR条件。

校正方法会严重影响基于qRT-PCR的检测结果。“标准曲线法”解释了引物对间PCR效率的差异[23]，便于不同引物对和实验数据的比较和整合。唯一的缺点是每次qRT-PCR实验需要对包括内参基因在内的所有被测基因加入一系列标准样品，与其他方法相比，成本和时间略有增加。

阐明个体基因的作用

蛋白质序列的微小变化可能导致致敏特征的巨大差异。表位形成关键位置的单个氨基酸改变可能完全改变Mal d1蛋白的致敏性[27- - - - - -29]。对于Bet v 1，两种异变原之间7个氨基酸的差异导致其致敏性和免疫原性的巨大差异:Bet v 1.0101是强致敏剂，而Bet v 1.0401明显与较弱的IgE反应相关[30.]。类似的情况可能也存在于苹果中，这意味着存在天然的低致敏性Mal d1等过敏原，在过敏个体中不引起或轻微的IgE反应。目前，单个Mal - 1等变应原及其变体的致敏性尚未确定。以前的研究使用基因表达方法来获得该基因家族中差异表达的信息Mal 1.02作为表达最多的等过敏原基因[17- - - - - -20.]。然而，我们的分析是鉴定特异性候选基因过敏原的关键一步Mal d 1家庭通过评估的存在和不平等的分散所有Mal d 1苹果果实中的基因转录本，从而将不同品种间的致敏性差异与个体基因表达差异联系起来。

事实上，从第一次应用该试验得到的结果表明，31个中的11个Mal d 1这些基因在‘Florina’和‘Gala’果实中没有表达。因此，编码这些等过敏原的基因与“Florina”和“Gala”果实的致敏性无关，而与其他品种的致敏性有关，从而减少了有待进一步评估的候选品种的数量。这一结果与在桦树中进行的研究是一致的赌1比15个亚科中只有2个基因在花粉中表达[31]。

在表达的20个等变应原基因中，我们观察到组织、基因和品种之间的表达差异很大。我们检测到更高的Mal d 1果皮中的基因比果肉中的多。因此，我们有理由认为苹果果实去皮会去除大部分Mal d1蛋白。然而，削皮对一小部分苹果过敏人群是有帮助的[32，表明我们不能先天的仅根据其表达水平排除等过敏原基因。事实上，少量的高致敏性同种异构体可能由于高免疫反应性而引起过敏，而大量的低免疫反应性或无免疫反应性同种异构体可能不会引起过敏反应[14]。因此，等过敏原，如Mal d 1.11B;它们在果皮和果肉中的表达是一样的，应该得到充分的关注，尽管它们的表达量大约是它们的300倍Mal 1.01。然而，对于那些果皮有帮助的个体，我们可以进一步限制那些只在果皮中表达的潜在相关基因的数量。

根据口腔刺激和皮肤点刺试验，不同苹果品种的致敏性不同[2，3.]。目前的分析提高了我们对这些差异的理解，促进了跨表达谱的相关性Mal d 1基因对不同品种过敏反应的影响。“Florina”在整个水果的刺对刺试验中表现出较低的皮肤刺试验反应[24]。大部分的Mal d 1等过敏原基因在致敏性较低的品种“Florina”中表达更多，这表明这些基因在过敏中起次要作用，而在“Gala”中表达更多的基因可以优先进行进一步分析(即，Mal d 1.06A，- 1.06摄氏度，-1.03，-1.03 k和- 1.07)。的适应症Mal 1.06是特别有趣的，因为先前已经提出这种等过敏原的可能作用[8的等位基因组成之间的关系Mal d 1.06A以及一小部分苹果品种的致敏性水平。将我们的qRT-PCR检测扩展到具有已知过敏原的更广泛的品种，将进一步深入了解这一现象。我们目前正在将这种方法应用到苹果果实中，其中的表达范围很广Mal d 1基因被认为是沉默的[33，34]，并且可以获得口头挑衅的数据(未发表的观察结果)。即使蛋白质和转录物丰度之间存在普遍的良好相关性[35]，关于蛋白质含量的定量信息将是非常需要的。在蛋白质家族的情况下，分析特定的蛋白质异构体总是很困难的，特别是对于Mal d1，因为它们具有敏感的3D结构[9]。尽管如此，由于这项工作，将有可能将蛋白质研究的重点放在有趣的蛋白质上，试图开发Mal - 1等过敏原特异性IgE。

免疫疗法对呼吸道过敏有效，但对食物过敏的研究结果却相互矛盾。花粉与食物之间的苹果过敏交叉反应已被利用，但花粉过敏原免疫治疗对交叉反应食物过敏的有效性尚未得到证实[36]。口服脱敏治疗也首次进行了研究，使用不同品种的新鲜水果的混合物，结果很有希望[37]。我们的实验可能会促进免疫疗法的进一步发展，因为引起过敏的等过敏原可以在个体水平上识别，从而导致用于免疫治疗的个性化蛋白质。除了免疫治疗，我们的检测还可以为个性化诊断提供信息，并为特定品种的安全消费提供建议。

基因表达调控及Mal d1的生物学作用

的Mal d 1基因根据其基因组和氨基酸序列的相似性分为亚家族[6]。这种分组与这些基因表达谱的相似性是一致的。结果表明:i) II亚家族的所有基因在果实中不表达;ii) I亚家族的两个基因在果皮和果肉中均有高表达，iii) V亚家族的基因在果皮和果肉中均有相同表达，说明这些基因的启动子区域序列相似。

Mal d1蛋白在植物中的生物学作用尚不清楚。这些蛋白质在许多不同的非生物和生物胁迫下被激活[38，39]并在植物对病原体的防御反应中发挥假定的作用[17，40，41]。实际上，Mal d1蛋白也被称为10类发病相关蛋白(PR-10s) [41]。然而，具体的Mal d 1参与应激反应的基因尚未被确定，这些基因是否与过敏相关的基因相同仍然未知。因此，确定低致敏性的育种是否会对植物对病原体或非生物胁迫的易感性产生影响，以及对胁迫的高抗性是否会对致敏性产生影响，这一点至关重要。此外，与生长和贮藏条件有关的其他胁迫也会影响苹果中Mal - 1的含量[2，3.，42]。因此，利用我们的一组引物来研究不同收获前/收获后条件下或暴露于生物/非生物胁迫后基因表达的变化，可能有助于确定苹果生产的“低过敏性方案”，从而有利于减轻苹果过敏患者的症状。

迄今为止，苹果过敏患者都是通过躲避来应对这些情况的。为了促进含有苹果的健康饮食的基本成分的正常消耗，生产“对过敏无害”的水果将是有用的。为了实现这一目标，需要了解引起过敏的Mal - 1异变原的鉴定。在这项工作中描述的qRT-PCR测定有助于检查单个基因。该qRT-PCR检测的首次应用表明，只有一部分Mal d 1基因在果实中表达。不同组织和品种间表达基因差异较大。数据表明，特异性Mal d 1等过敏原的存在和数量决定了过敏原性，而不是Mal d 1的总含量。对于特定感兴趣的基因，该检测可能会进一步发展为等位基因(变异)特异性引物对，这反过来将促进低过敏性苹果基因型的育种，并支持特定的水果消费建议，从而减少水果过敏对患者生活的影响。

检索Mal d 1序列及其比对

为了开发基因特异性引物对，所有可用的序列信息为Mal d 1同时用于基因和等位基因水平。编码DNA序列(cds)从文献[6- - - - - -8，17，19]、“金冠”基因组序列[22，43]和在NCBI数据库中搜索BLASTN [44]使用关键词和Mal d 1序列作为输入。编码序列为31Mal d 1“金冠”基因组序列中的基因[6使用Lasergene v8.0, MegAlign软件包(DNASTAR, Madison, WI, USA)对齐，并在必要时手动调整。使用相同的软件生成了一棵遗传树，具有默认参数和邻居连接聚类算法(NJ)。单核苷酸多态性(snp)之间的差异Mal d 1鉴定了序列。随后，完成了所有可用的对齐Mal d 1生成序列，并鉴定基因和等位基因分化snp。

基因特异性引物设计和验证

使用Primer3软件设计基因特异性引物对[45];目标基因分化snp位于3^”两个引物中至少一个引物的末端(见表1)1)，以确保引物能够特异性地扩增目标基因，特别是该目标基因座的所有已知等位基因。引物设计的其他标准包括引物长度为18-24个核苷酸，鸟嘌呤-胞嘧啶含量为20-80%，RT-PCR扩增子长度为80-200个碱基对。使用Lasergene v8.0的PrimerSelect软件(默认设置)检测每个引物对是否形成同源和异源二聚体。

每个引物对的基因特异性通过四种方法验证。首先，对于在网上将引物序列与参考“金冠”苹果基因组和NCBI数据库进行比对。其次，为了验证引物的特异性，对基因组DNA进行终点PCR后的单个PCR产物进行了评估。PCR反应在17.5 μl体积中进行，其中含有10 ng DNA, 100 nM基因特异性引物，1X反应缓冲液，1.5 mM MgCl₂， 100 μM dNTPs和0.5 Unit AmpliTaq Gold®DNA聚合酶(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。反应包括在95°C下初始10分钟变性步骤，随后进行33个PCR循环(60°C 45秒，72°C 2分钟，95°C 30秒)，最后在72°C下延长7分钟。扩增子经1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色后，在Image Station 440 CF (Kodak, Rochester, n.y.， USA)上显示。当检测到非特异性条带时，优化PCR条件(引物浓度和退火温度)以获得单条带。第三，通过直接测序10个品种‘Florina’、‘Gala’、‘Santana’、‘Elstar’、‘Elise’、‘Golden Delicious’、‘Prima’、‘Jonathan’、‘Cox’和‘Ingrid Marie’的所有扩增子，验证引物的特异性。测序反应在Bio-Fab Research, pomenzia，意大利和Greenomics, Wageningen，荷兰进行。样本包括低致敏苹果品种(“Elise”和“Santana”)和高致敏苹果品种(“Golden Delicious”)的组织。[2，3.，46]，已用于其他有关苹果过敏原的研究，以及有关基因改造对过敏原基因表达的影响的研究(' Florina '和' Gala ') [24，25]。目前用于苹果育种的品种(' Cox '， ' Elstar '， ' Golden Delicious '， ' Jonathan '和' Prima ')也包括在这些评估中。随后，使用Chromas Lite v.2.01、BLAST和MegAlign对这些序列进行分析。第四，以熔化曲线形状为标准，通过qRT-PCR验证引物特异性。由于长度和核苷酸组成的变化，每个独特的产物预计有一个独特的熔化温度(Tm)，因此，一个独特的熔化(或解离)曲线。如果引物对产生单个扩增子，则熔化曲线的一阶导数图将包含单个尖峰。

植物材料、RNA提取及cDNA合成

将所建立的qRT-PCR方法应用于两个苹果品种(Florina和Gala)的果实。果实在博洛尼亚大学(意大利)的卡德里亚诺实验果园采集，处于生理成熟阶段。每个基因型分别取5个苹果的果皮和果肉，在液氮中冷冻，并在- 80°C保存至RNA提取。特别是，果皮被小心地从果肉中分离出来，只留下薄薄的一层肉附着在果皮上。从每个池中进行两次不同的RNA提取(生物重复)。cDNA是根据先前发表的方法合成的[19]。

表达水平的绝对定量Mal d 1基因

的表达Mal d 1使用StepOne Plus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)进行qRT-PCR表征，并采用SYBR绿色检测。与所有其他插入染料类似，SYBR绿色可以与任何双链DNA结合;因此，我们仔细评估了引物的特异性。每次反应的总体积为10 μl，其中含有5 μl Power SYBR®Green Master Mix 2X，每个引物70-100 nM, 3 μl 1:9稀释的cDNA和pcr级水。反应在50°C下孵育2 min，在95°C下孵育5 min，然后在95°C下孵育15秒，60/63°C下孵育1 min，进行40个循环，每个退火步骤收集数据。反应进行了三次(技术重复)。为了确保扩增的特异性，根据Step One Plus仪器的默认设置(从60°C到95°C)，每个扩增反应之后都有一个熔化阶段，并评估每个熔化曲线是否存在单峰。qRT-PCR检测包括平板中每个靶基因的标准曲线。每个标准曲线由6个连续的1:10稀释的扩增子组成(一式两份)，扩增子使用基因特异性引物，从100 ng开始，从一定量的gDNA中获得。绘制荧光信号(以Ct值表示)与6个系列稀释样品中已知扩增量的曲线，并绘制回归线。 Each assay also included a negative control performed in duplicate. The shape of the melting curves obtained from the standard curve dilutions (gDNA) and the samples (cDNA) indicates whether the amplified products are homogeneous and the melting temperature provides confirmation that the correct product has been specifically amplified.

利用回归线斜率估计各引物对的扩增效率E，公式为:E=10^{(−1 /坡)}- 1 [47]。相对于内参基因，评估每个目标基因的相对PCR效率，以选择合适的方法来分析原始qRT-PCR数据。为获得基因表达结果，对原始数据采用“标准曲线法”进行转化[23]并报告为相对表达水平;成绩单的水平Mal d 1基因被正常化到转录水平肌动蛋白(引物序列源自[48])，并表示为任意单位(a.u)。肌动蛋白与其他两个可能的内参基因比较后，选择了该基因:(1)哥伦比亚大学(泛素缀合酶，MDP0000223660)，正向引物5^”-CGAATTTGTCCGAAGGCGT-3^”;反向处理剂:5^”-CAATGATTGTCACAGCAGCCA-3^”(2)GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶，MDP0000835914)，正向引物5^”-ATTGGCAGTGTGCGACGTT-3^”反向引物5^”-GGAGGAGTCAATGGTGGAGGA-3^”)。在‘Florina’和‘Gala’的果皮和果肉的两个生物重复中，对三个推测的内参基因进行了比较。使用两个生物重复计算平均规范化表达水平和平均值的标准误差(SEM)。采用方差分析(ANOVA)对平均值之间的差异进行单因素分析，显著性水平为0.05。

这项研究由ISAFRUIT项目通过欧洲委员会在主题优先5 - RTD第6框架计划的食品质量和安全(合同编号:No. 5)下的赠款提供资金支持。fp6 -食物- ct - 2006 - 016279)。本出版物中表达的观点和意见仅代表作者的观点和意见，在任何情况下都不反映欧洲委员会的官方立场。

作者指出

1. 罗伯塔巴黎

   现地址:意大利博洛尼亚，40128，博洛尼亚，意大利农业实验中心，意大利农业工业中心

从属关系

1. Wageningen UR植物育种，国际植物研究中心，Droevendaalsesteeg 1, Wageningen, PB, 6708，荷兰

   Giulia Pagliarani, Paul Arens, Marinus JM Smulders和Eric van de Weg

2. 博洛尼亚大学果树与木本植物科学系，意大利博洛尼亚，40127

   Giulia Pagliarani, Roberta Paris和Stefano Tartarini

3. 博洛尼亚大学儿科，Via Massarenti 11，博洛尼亚，40138，意大利

   Giampaolo里奇

相应的作者

对应到会Pagliarani。

作者的贡献

GP和RP:平等参与研究设计，进行分子遗传学研究，参与序列比对，进行统计分析，撰写稿件。PA和ST:参与研究的设计，批判性地阅读稿件。GR:参与设计和协调工作。批判性地阅读手稿。WEW:参与了工作的设计和协调，并帮助起草了稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

朱利亚·帕格里亚尼和罗伯塔·帕里斯对这项工作也做出了同样的贡献。

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