EcoTILLING在甜菜属揭示了基因的多态性方法例如基因BvFL1这与年代性和耐寒性有关

背景

甜菜(甜菜属ssp。寻常的L.)是温带地区重要的糖和生物质生产作物。目前甜菜是春季播种，秋季收获。种植一整年的秋播甜菜一直被认为是提高甜菜种植生产力的一种种植制度。然而，为了这些“冬季甜菜”的发展，需要足够的冬季抗寒性和一个控制抽苔的系统。两者都需要对潜在的遗传学及其自然变异有透彻的了解。

结果

我们筛选了一个由268人组成的多元化小组b .寻常的三个开花时间基因通过EcoTILLING的添加。该面板已在现场进行了螺栓性能和耐寒性测试。EcoTILLING在基因中鉴定出20个沉默SNP和1个非同义SNPBTC1，BvFL1和BvFT1产生55个单倍型。此外，我们检测到核苷酸多态性的关联BvFL1冬前抽苔，冬寒性好。

结论

这些数据提供了第一个基因指示的功能方法同族体BvFL1在甜菜。此外，这也首次证明了EcoTILLING是一种有效的基因多样性探索和等位基因挖掘方法b .寻常的。

EcoTILLING是一种快速简便的检测自然群体中靶基因中罕见snp或小缺陷的方法。它是对TILLING (Targeting Induced Local Lesion In Genomes)技术的改进，TILLING技术用于检测突变群体中的点突变[1]。在EcoTILLING中，像CEL I这样的内切酶被用来切割由不同基因型杂交形成的异双工DNA中的不匹配位点。这是一种成本有效的技术，因为测序仅限于单个基因型，每个基因型代表不同的单倍型。EcoTILLING已被用于遗传变异的表征拟南芥(泰利服)[2]，穆萨种类(各种香蕉)[3.]，杨树trichocarpa(黑棉)[4]，菜豆(普通豆)[5),而豇豆属辐射动物(绿豆)[6]。此外，它已被用于候选基因检测新的等位基因赋予抵抗生物和非生物胁迫大麦芽(大麦)[7]，栽培稻(大米)8，9]，茄属植物tuberosum(土豆)10]。Cucumis品种(包括黄瓜)[11),茄属植物lycopersicum(番茄)12]。甜菜的生态耕作尚未见报道(甜菜属ssp。寻常的L.)占世界白糖产量的22% [13]。

甜菜是一种草本双子叶植物，属于苋科(原藜科)。贝塔属被分为两个部分Corollinae和β，后者又可进一步分为栽培甜菜(B。寻常的ssp。寻常的)、野生海甜菜(B。寻常的ssp。maritima)和野生甜菜(B。寻常的ssp。adanensis) [14]。在B。寻常的ssp。寻常的在美国，可分为饲料用甜菜、叶用甜菜、园用甜菜和糖用甜菜四个栽培类群。叶用甜菜和园用甜菜表现出一年生或二年生的生命周期，而甜菜和饲料甜菜是二年生植物，在第一年停留在营养阶段，形成一个蔗糖浓度高达20%的储存根。春化和长日照都需要茎伸长(抽苔)和开花发生在生长的第二年。甜菜的春化是通过暴露在低温下10到14周来实现的。

目前，甜菜作为春播作物种植在凉爽的温带气候地区。4月播种，9月开始收获根。春季封闭叶冠层形成较晚被认为是限制甜菜产量的主要因素[15]。克服这一问题的一个策略是生产秋季播种的冬季甜菜，这种甜菜在春季早些时候形成封闭的树冠。然而，秋播冬用甜菜的育种需要足够的耐寒性以度过冬季，并需要一套抽苔控制系统，该系统允许在种子生产时抽苔，但在作物生产期间冬季后抑制抽苔[16]。有开花和抽苔的关键调控因子B。寻常的最近被确认的[17，18]，可以通过基因改造来控制抽苔，这一方面可以抑制冬季后种植甜菜的抽苔，但另一方面可以使抽苔用于制种[16]。

为了避免过早地过渡到极冷敏感的生成阶段[19为了便于积累足够的繁殖资源，生长在温带的冬季一年生和二年生植物需要春化以诱导开花。栽培甜菜是二年生植物，而在野生甜菜种群中经常观察到不需要春化的一年生甜菜[20.，21]。二年生甜菜的春化反应是由开花地点（英国《金融时报》)同族体BvFT1，这与的促进作用形成对比英国《金融时报》在拟南芥中起抑制开花的作用[17]。类似于方法，BvFT1在漫长寒冷的冬季逐渐下调[17]。在一年生甜菜中，BvFT1即使在没有春化的情况下也不表达，并被证明受到伪反应调节基因的负调控螺栓连接时间控制（BTC1)，以前被称为BvBTC1［18]。该基因位于抽苔位点B是甜菜年生长习性的主要决定因素。占主导地位的BTC1等位基因促进一年生植物对长日照的响应，而二年生植物携带一个部分功能丧失的等位基因，如果没有提前春化，则不能介导长日照的促进作用[18]。所有的栽培(二年生)甜菜都携带相同的单倍型，而绝大多数野生海甜菜携带的单倍型与野生海甜菜的单倍型相似BTC1在年度参考资料中发现的等位基因[18]。

基于与拟南芥花过渡基因的同源性，已经鉴定出甜菜中的其他几个基因，包括拟南芥春化需求和反应的中央调控基因;开花地点c（方法) [22，23]。的FLC-LIKE 1基因BvFL1在持续光照下长时间暴露于寒冷环境中逐渐下调[24]。的本构表达式BvFL1在一个方法拟南芥零突变体显著延迟开花时间，表明拟南芥和拟南芥之间至少存在部分的功能进化守恒方法拟南芥和甜菜的同源物。

有趣的是，花期控制基因似乎也会影响耐寒性，而耐寒性是影响抗寒性的最重要因素[25- - - - - -27]。在低于10°C的非冻结温度下，植物可以通过在硬化过程中逐渐适应代谢来进一步提高其抗冻性。拟南芥的抗冻性受C-REPEAT BINDING FACTOR (CBF)转录因子家族调控，植株组成性过表达CBF显示抗冻性增加的基因[28和高水平的方法表达式[29]。邓等。[30.报道说方法在花期调控和冷胁迫响应中起双重作用。有趣的是，最近的一项研究表明，抑制染色质复合体的招募方法基因座涉及冷诱导的长链非编码RNA的表达，称为COLDAIR的内含子1方法［31]。

在本研究中，我们建立了EcoTILLINGB。寻常的调查大量栽培和野生甜菜春化需求和/或抗寒性调节候选基因的等位变异。该小组在冬季前(即在没有春化的情况下)发生抽苔的变异和冬季后的存活率方面进行了表型分析[32]。作为候选基因，我们选择了(i)BTC1和(2)BvFT1，因为它们在调节甜菜春化需求和反应中的已知功能，以及(iii)BvFL1，因为它的同源物具有调节作用方法在拟南芥春化和冷胁迫反应中我们发现单倍型变异在BvFL1基因座与冬前抽苔率和冬后成活率变异相关。这些数据提供了第一个基因指示的功能方法同族体BvFL1这些都与甜菜育种和我们对甜菜抽苔时间控制网络的理解有关。

表型和基于模型的群体结构分析

2009年秋季，在7月或8月在四个不同地点播种的268株中，有41株至少有一株在第一次霜冻之前开始抽苔。这些品种包括2个甜菜(2.2%)、4个园用甜菜(6.9%)、4个饲料甜菜(10.0%)、20个叶用甜菜(42.3%)和11个野生海甜菜(b .寻常的ssp。maritima)(31.4%)。在所有四个环境中，41个接点的螺栓连接率从0.05到0.75不等(图1)1）.Kirchhoff等人详细描述了2008/09年和2009/10年八种环境冬季后存活率的变化[32]，范围从0.07到0.66。平均而言，糖用甜菜表现最好(0.39)，饲料用甜菜和园用甜菜表现最差(分别为0.24和0.19)。存活率差异最大的是俗的p。maritima其次是叶甜菜，而甜菜的变化最小。利用268份材料中检测到的40个多态性aflp的基因型数据，采用基于模型的方法对群体结构进行分析。的独立计算k的每个值重复6次k从k= 1到k= 8。对数概率l（K)从k= 1到k= 3，但之后才慢慢地k= 3(附加文件1）.当k接近一个真值，L (K)停滞不前或继续略有增加[33]。因此，结构分析表明存在三个亚群(k= 3)，其中，第一组的甜菜数量最多(0.81)，第二组的饲料甜菜数量最多(0.61)，园用甜菜数量最多(0.86)，叶用甜菜和园用甜菜数量最多俗的p。maritima在第三组(图2）.进一步增强信心k值估计，我们计算ΔK，得到ΔK的最大值(60.04)k= 3(附加文件2）.

候选基因的扩增

对于三个候选基因BvFL1，BvFT1和BTC1我们设计了24对引物，其中5对引物通过了引物“碰撞试验”，适合EcoTILLING。的基因组序列BvFL1[GenBank: DQ189214.1和DQ189215.1]取自Reeves等人。]24的基因组序列BvFT1[GenBank: HM448909.1]BTC1[GenBank: HQ709091.1]取自Pin等。]17，18]。我们采用了Weil和Monde [34]在昂贵的标记引物合成之前，检测单个引物是否存在不必要的扩增。5对成功引物扩增得到的扩增子总长度为4234 bp(表2)1）.其余引物组合不适合EcoTILLING，因为引物碰撞试验显示引物缺失和单引物扩增(数据未显示)。

为BvFL1我们可以放大两个区域(图2)3.）.第一个扩增子(FL1a)覆盖了977 bp的启动子、外显子1(包括编码序列的5'-UTR和5'区域)和部分内含子1。第二个扩增子(FL1b)在外显子3和4以及中间的内含子中跨越632 bp的区域。选择这些区域是因为它们包含启动子区域，该区域编码MADS盒结构域以及与转录因子结合活性相关的TGTGAT序列基序(K盒)。因此，62%的BvFL1ORF已包括在内。此外，我们的目标是第一个内含子，已知它包括许多调控区域拟南芥［35]。为BvFT1我们扩增了一个916 bp的区域(' FT1a ')，该区域从5'-UTR延伸到外显子1的编码序列的5'区域。第二个扩增子(' FT1b ')全长713 bp，位于外显子4和3'-UTR(图2)3.）.这两个区域总共覆盖了92%的ORF，之所以被选中，是因为它们包含启动子和PEB结构域的部分(表2)1）.在BTC1我们扩增了保守响应调节器接收器(REC)区域的992 bp片段(' BTC1 ')(图2)3.)，占ORF的15%(表1)1）.

遗传多样性、SNP密度和单倍型频率

在5个扩增子(FL1a、FL1b、FT1a、FT1b和BTC1)中，通过LI-COR分析，在268个基因中共鉴定出21个snp。18个SNPs位于内含子，其余3个SNPs位于基因的外显子4BvFT1外显子3和外显子4BvFL1，后者的SNP是非同义的。多态性数量因基因而异，总密度为5.3 SNP/kb。SNP密度最低的是BTC1(2.01 SNP/kb)，而FL1b的SNP密度最高(9.82 SNP/kb)3.）.SNP分配和基因结构如图所示3.。目的:评价生态耕作的效果b .寻常的我们通过对四个入选的所有扩增子进行测序来估计假阴性率，假阴性率为5%。FT1a、FT1b、FL1a和BTC1的测序未发现LI-COR分析未发现的其他snp。对于扩增子FL1b，在单次测序后鉴定出一个额外的SNP。EcoTILLING在LI-COR上的268个序列中未检测到该SNP。

平均非参考核苷酸频率(NNFs;(5)材料和方法BvFL1(0.18)和BvFT1(0.17)在所有测试的材料中相似，但在个体之间存在差异b .寻常的形式，从花园甜菜的0.12英寸到0.23英寸不等俗的p。maritima为BvFT1从花园甜菜的0.04英寸到0.55英寸俗的p。maritima为BvFL1(附加文件4）.的平均NNFBTC1对所有b .寻常的品种为0.07，饲料甜菜品种为0.03 ~ 0.30俗的p。maritima。我们在所有五个扩增的候选区域中鉴定了55个单倍型。单倍型数量从扩增子BTC1的4个到扩增子FL1b的18个不等。60%的检测到的单倍型是罕见的，发生频率低于0.05。参考单倍型(H0)在每个扩增子中最常见，频率范围从FT1b_H0的0.49到BTC1_H0的0.87(图2)4）.不同扩增子的非参考单倍型频率(NHF)在0.01 ~ 0.38之间b .寻常的形式(图4）.NHF最高的是俗的p。maritima菜园用甜菜和甜菜的NHF最低。每个扩增子和每个品种群的基因多样性(Ht)在附加文件中显示5。Ht范围在扩增子FT1b中最低(0.16 ~ 0.30)，在扩增子FL1a中最高(0.02 ~ 0.51)。最高和最低的多样性b .寻常的在FL1a扩增子中观察到俗的p。maritima(0.51)和园用甜菜(0.02)。将88份研究甜菜材料细分为49份来自德国Strube GmbH & Co. KG (Söllingen, Germany)提供的优良育种材料(SBEBM)和其余39份甜菜种质材料(SBGP，主要由各种基因库材料组成)，发现扩增子FL1a、FL1b和BTC1的多样性呈降低趋势，而FT1a和FT1b的多样性呈增加趋势(附加文件)6）.

BvFL1序列变异与抽苔和成活率有关

基于的Q矩阵k= 3，与抽苔率、成活率及以抽苔率为辅助因子的成活率的相关性均显著(PFL1a和FL1b的比值≤0.05)2）.Dunnet的比较揭示了这一点俗的p。maritima单倍型FL1a_H6、FL1b_H5和FL1b_H10的抽苔率显著高于前者，为55% (P< 0.0001)， 75% (P< 0.0001)和11% (P < 0.05)，而FL1a_H0为1%，FL1b_H0为2%(附加文件)6）.此外，带有FL1b_H6单倍型的园用甜菜在冬季前结苔率为6% (P< 0.0001)，而参考单倍型FL1b_H0为1%(图2)5）.Dunnet对存活率的比较表明俗的p。maritimaFL1a_H6单倍型品种的成活率较低，为13% (P= 0.015)，相比之下，参考单倍型为FL1a_H0(附加文件7）.而FL1b_H3单倍型叶用甜菜的成活率为37% (P= 0.012)，与19%的参考单倍型FL1b_H0相比(图2)6）.重要单倍型的DNA序列BvFL1显示在附加文件8。

这是EcoTILLING应用的第一个报告b .寻常的。我们基于代表野生和驯化基因库的268份材料建立了EcoTILLINGb .寻常的。在这个小组中，我们成功地筛选了三个基因的等位基因变异，这些基因是春化需求和/或冬季抗性调节的候选基因。因此，我们能够提供这些基因在物种范围内多样性的快照。此外，我们还发现了与冬季前抽苔率和成活率相关的单倍型，这可能对甜菜的抗寒性提高有用。结果表明，EcoTILLING是一种适合的、经济有效的等位基因挖掘方法b .寻常的。

在大多数EcoTILLING方案中，异双工DNA被纯化的细胞I内切酶消化。而不是纯化酶，Till等。[36]和Galeano等人。[5用芹菜汁从盐腌或透析的粗芹菜提取物中获得，用于生态耕作筛拟南芥和菜豆,分别。我们更进一步，使用未经进一步加工的粗芹菜提取物(CCE)，并观察到与商业CEL I酶测量器®(数据未显示)相比相同的活性。此外，CCE在4°C条件下也能保持数周的活性。由于使用CCE不需要特殊的酶纯化步骤，如色谱和专门的实验室设备，这提高了EcoTILLING的成本效率。我们进一步能够证明，一旦设计了合适的引物，EcoTILLING提供了一种高通量的方法来分析天然核苷酸多样性B。寻常的。此外，EcoTILLING是一种相当经济有效的方法。在评估LI-COR凝胶时，可以根据大小和模式对信号进行分组，每组只需要对有限数量的样品进行测序，以将检测到的变异分解到核苷酸水平。这大大降低了测序成本，在我们的例子中减少了1/3。如果只对对感兴趣表型有影响的snp /单倍型进行测序，成本可以进一步降低。然而，必须考虑到EcoTILLING容易出现假阴性检测，因为一些片段大小被背景“噪声”所掩盖，或者由于未启动，或者由于每个通道顶部的荧光较弱而底部的荧光“噪声”增加[3.，37，38]。在我们的案例中，假阴性率为5%，这与人类[39]和香蕉[3.EcoTILLING。

利用AFLP标记对种群结构进行分析b .寻常的加入内容可分为三组(k= 3)。考虑到面板的表型分类(基因库信息以及我们对植物习性的实地观察)，这三个类群可称为糖用甜菜类群，饲料用甜菜和园用甜菜类群，以及由叶用甜菜和野生海用甜菜组成的类群。这反映了β的进化史和在过去200年的甜菜育种中的选择强度。Jung等人也描述了类似的结构。[40和McGrath等人[41用完全不同的标记系统进行基因分型。两个研究小组都报告说，甜菜可以明显地与甜菜区分开来b .寻常的ssp。maritima。在我们的研究中，一些材料根据基因型(根据AFLP分析)和表型进行了不同的分类(见图2)2）.关于B.vulgaris党卫军p。maritima这可能暗示基因从栽培形式流入野生物质，要么是在它们的自然栖息地，要么是在基因库繁殖期间。同时，按表型分类有时是不明确的。例如，来自印度的“Patak”(PI 116809和PI 121838)，虽然经过栽培，但显示出一种植物习性，其分类为B.vulgaris党卫军p。maritima似乎比把它们归为栽培品种更合理。有趣的是，两种解释种群结构的方法都导致了相同扩增子的显著关联，这暗示了结果的稳健性。然而，为了解释基因分型错误作为假定的结构错误分类的来源，基因型异常值从数据集中删除，通过TASSEL进行进一步分析。这些异常值是甜菜、饲料甜菜和食用甜菜，估计非栽培甜菜基因组的部分大于50%B.vulgaris党卫军p。maritima估计栽培甜菜基因组部分大于50%的品种(见图2)2）.在此分析中，先前的关联仍然非常显著(数据未显示)。

比较这五个b .寻常的我们观察到所调查基因的遗传多样性最高的形式俗的p。maritima。这表明，平均NNF为0.36，而叶用甜菜为0.19，其次是饲料用甜菜(0.12)、甜菜(0.08)和庭院用甜菜(0.07)。在观察平均NHF和Ht时也观察到同样的趋势。我们的发现与Jung等人的研究结果一致。[40]和fsamnart等人。[42他们报告了更高的基因多样性俗的p。maritima和甜菜相比。由于自然选择导致了遗传多样性的丧失，所以自然选择中遗传多样性的增加并不奇怪俗的p。maritima似乎不仅比甜菜高，而且比所有四个品种组加起来都高。作物进化最好的理解是甜菜，它受到奠基者效应的影响，因为它来自一个单一的饲料甜菜种群，也受到遗传瓶颈的影响，因为来自有限数量的遗传资源的一系列性状渗入[43- - - - - -45]。这就解释了为什么甜菜和红表甜菜的多样性最低。

在我们的研究中，基于Ht的甜菜单扩增子遗传多样性范围为0.03 ~ 0.28，平均为0.17。这些估计可能是向上偏倚的，因为我们无法区分非参考核苷酸在杂合或纯合状态下的发生。然而，与Li等人相比，我们研究中的基因多样性较低。[46和McGrath等人。[41]。然而，与Li等人和McGrath等人不同的是，我们估计了可能处于选择压力下的三个基因的核苷酸多态性的遗传多样性。这对……尤其如此BvFL1我们估计FL1a和FL1b的Ht值分别为0.03和0.12BTC1(Ht = 0.06)。这可能是为了防止春播后晚霜引起的抽苔而选择抗抽苔的效果。将甜菜优良选育材料与甜菜种质资源进行比较，发现遗传多样性因选择而进一步降低BTC1和BvFL1(另见附加文件5）.同时BvFT1在SBEBM中表现出更大的多样性，表明该基因明显没有受到选择压力。这有点令人惊讶，因为BvFT1在非感应条件下对螺栓抑制起关键作用[17]。尽管如此，这些数据必须谨慎解释，因为样本量适中，SBEBM材料仅代表一家育种公司。

为BvFL1，我们能够检测到与螺栓连接的关联。该基因的4个单倍型(FL1a_H6、FL1b_H5、FL1b_H6和FL1b_H10)在冬前对抽苔率有显著影响俗的p。maritima和/或花园甜菜。尽管在方法已知会影响开花时间吗答:芥［47的角色方法就像基因一样十字花科不是很好理解[16的功能分析BvFL1在b .寻常的例如，通过突变或转基因方法，仍然缺乏。没有观察到所有植物对抽苔率的影响b .寻常的在某种程度上，这可能是由于缺乏影响抽苔率的不同的单倍型俗的p。maritima或者菜园里的甜菜。甜菜中这些单倍型的完全缺失可能反映了甜菜的育种历史，在这一历史中，育种者在春化之前强烈选择防止抽苔[48，49]。

作为BTC1已知是控制甜菜在没有提前春化的情况下抽苔的主要因素[18，我们期望的效果是BTC1冬季前螺栓连接的序列变化。然而，这里没有观察到这一点。这可能部分是由于我们的小组中年度BTC1等位基因的代表性不足，或者目前的分析仅限于相对较小的编码序列部分BTC1(15%;表格1)，并没有包括启动子。虽然BvFT1已知对春化有反应，并受到低温的下调，这反过来又能诱导开花[17]，我们也没有发现该基因的单倍型变异对抽苔率的影响。虽然不能排除其他原因，如讨论BvFL1和BTC1，也可以想象单倍型变异的可能的表型效应BvFT1在目前研究的环境条件下很难检测到。

除对抽苔率有显著影响外，FL1a_H6和FL1b_H3单倍型植株冬后成活率也有显著影响俗的p。maritima和叶甜菜。在此之前，也有类似的结果答:芥的内含子1中的一个SNP方法导致携带功能性基因型的冬季存活率增加1.6倍星期五等位基因(50]。作者认为，冬天过后的存活率与抽苔时间有关。同样，我们发现，与参考单倍型FL1_H0相比，具有FL1b_H3单倍型的真正二年生(需要春化)叶用甜菜的存活率更高(20%)(p = 0.006，数据未显示)。因此，从叶用甜菜中导入FL1b_H3基因可能会提高甜菜的耐寒性。有趣的是,俗的p。maritima携带FL1a_H6的种质存活率低于携带参考单倍型的种质，但抽苔率也有所提高。此外，去除后庸俗的;maritima在冬前脱销的品种中，单倍型FL1a_H6的影响不显著。因此，这种单倍型较低的存活率可能是冬季前抽苔的直接生理效应，因为处于繁殖期的植物对霜冻更为敏感[19]。然而，通过在进一步的TASSEL分析中使用锚固率作为辅助因素，我们可以排除在生成阶段增加的霜敏感性是关联的仅仅原因BvFL1由于这种关联，生存率一直很显著。有趣的是，Seo等人。[29研究人员报道，短暂的低温和CBFs的过度表达会导致CBFs的升高方法表达和延迟开花，暗示可能的作用方法在冷应激反应中答:芥并且，通过类比，对检测到的效应的一个可能的解释BvFL1单倍型对成活率的影响b .寻常的。两种单倍型对存活率的影响不能一致地观察到b .寻常的形式。这在一定程度上可能是由于在其他一些基因中缺少这两种单倍型b .寻常的表单(参见附加文件)7）.与抽苔率相似，单倍型缺失对某些品种的成活率也有影响b .寻常的形式也可能是由于存活率的多基因遗传。

在FL1a_H6、FL1b_H3、FL1b_H5、FL1b_H6和FL1b_H10单倍型的snp中，有两个位于外显子上。外显子3的SNP是同义的，而外显子4的SNP是非同义的，导致氨基酸从缬氨酸替换为异亮氨酸。其他的snp在BvFL1是沉默的，因为它们位于内含子中，包括内含子1。这些snp可能通过影响转录调控来影响基因功能BvFL1的内含子多态性方法在拟南芥中[51，52]。许某和成某[31]报道了调控非编码RNACOLDAIR由?的内含子1表达方法。最后，观察到冬季存活率增加的等位变异方法［50]也与内含子1的多态性有关。与一般的关联研究一样，不能排除所调查性状的功能多态性位于扩增基因区域之外，并且这里检测到的snp仅与这些多态性相关。

综上所述，我们的研究表明EcoTILLING可以成功地应用于b .寻常的调查大量的植物材料中不同候选基因的等位变异。我们的数据也提供了第一个基因指示方法同源性确实也可能影响一个只有远亲的物种的开花时间(和冬季生存)答:芥。以上所描述的面板多种多样b .寻常的形态是鉴定其他花期控制基因等位基因变异的极好资源BvFT2或农艺性状的候选基因，如应激反应和植物结构。通过EcoTILLING技术鉴定的等位变异可用于将新的遗传变异引入到优质甜菜育种材料中。

植物材料和表型数据

冬季前抽苔和冬季耐寒性的表型数据来自Kirchhoff等人最近的一项研究。[32]。简而言之，一个396人的小组b .寻常的2008/09和2009/10冬季，在德国和白俄罗斯5个不同地点的8个环境中进行了重复越冬大田试验，对遗传多样性范围广泛的材料进行了耐寒性测试。存活率是指某一种质的所有植株中存活个体的比例，取值范围为0 ~ 1，其中0表示没有植株存活，1表示一个种质的所有植株存活。在所有环境中，平均存活率被估计为最佳线性无偏预测因子(blops)。因此，在2009/10年环境下，冬季前的抽苔率确定为某一种质的所有植株中抽苔个体的比例，取值范围为0 ~ 1，其中0表示没有植株抽苔，1表示该种质的所有植株都抽苔。记录时间为首次霜冻之前(2009年12月2日)。为了避免数据不平衡，我们将数据集减少到在所有环境中测试的268个条目的子面板。这些品种包括饲料用甜菜(40)、叶用甜菜(47)、园用甜菜(58)和糖用甜菜(88)四个品种群，以及35个品种群俗的p。maritima登记入册。这88个甜菜可以进一步细分为49个由Strube GmbH & Co. KG (Söllingen，德国)提供的精英材料(甜菜精英育种材料，SBEBM)和39个主要来自不同来源的基因库材料(甜菜种质，SBGP)。

DNA分离及多态性筛选

DNA是从冻干叶片样品中分离出来的，每次提取最多8株植物。这是用制造商在Tecan“Freedom Evo”机器人上推荐的NucleoSpin®96 Plant II试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, d ren，德国)完成的。通过Tecan Robot使用光度计和SYBR®Green (Invitrogen GmbH, Darmstadt, Germany)测量DNA浓度，用无DNA酶的水归一化至终浓度为10 ng/μl，总容积为160 μl。这268个DNA样本代表了268个B.vulgaris以二年生甜菜93161P的DNA为参比型，以1:1的比例混合，保存在96个孔板中。93161P是研究候选基因的近交系纯合子，由Saatzucht Dieckmann提供。

扩增基因保守结构域的寡核苷酸引物BvFT1，BvFL1和BTC1用FastPCR从基因组序列中设计[53]。基因组DNA序列经codle(密码子优化发现有害病变)分析后选择区域;http://www.proweb.org/coddle/）.在所谓的“碰撞测试”中，在标记之前对引物进行了预先筛选，该测试改编自Weil和Monde [34]。正向引物和反向引物分别用Dyomics荧光标记DY-681 (700 nm吸收)和DY-781 (800 nm吸收)进行末端染料标记。PCR扩增在20 μl体积中进行，体积中含有1 ng pooled DNA, 1 × Taq缓冲液，1.5 mM MgCl₂， 2 mM dNTPs (Invitrogen，达姆施塔特，德国)，0.2单位重组TAQ DNA聚合酶(Invitrogen，达姆施塔特，德国)和0.8 pmol引物(biomers.net，乌尔姆，德国)。根据Till等人的研究，dy681和dy781的引物标记比例分别为3:2和4:1。[qh]38]。PCR在DNA Engine DYAD热循环仪(MJ Research Inc.， Waltham, MA, USA)上进行。扩增的PCR步骤如下:在95°C下进行初始变性步骤，持续5分钟，然后在95°C下进行30秒变性步骤，在60°C下进行30秒退火，在72°C下进行60秒延伸。在72°C下延长5分钟结束PCR。芹菜粗提取物(CCE)的提取方法由Till等人描述。38稍加修改。我们没有按照建议透析和重新缓冲芹菜汁。相反，我们使用粗提取物进行酶错配切割，并对其进行商业产品测试。结果(数据未显示)与使用Surveyor®核酸内切酶获得的结果相同。对于SNP评估，我们只使用LI-COR 4300的700 nm通道，因为800 nm通道没有提供额外的信息。对于异双相形成，PCR产物在95°C下变性10 min，然后以2°C / s的速度冷却至85°C，再以0.5°C / s的速度冷却至25°C缓慢退火。再退火的PCR产物在42°C下消化15 min，每20 μl反应使用含有0.6 μl CCE和5.4 μl CCE缓冲液的粗芹菜提取物(CCE)。CCE缓冲液的制备方法参照Till等[38]。用4 μl 200 mM EDTA阻断反应。PCR产物经Sephadex酶切后纯化。

片段分析在LI-COR 4300 DNA分析仪上进行，使用6.5% KB⁺凝胶基质(LI-COR®，Bad Homburg, Germany)。凝胶在1500 V, 40 mA, 40 W下运行2小时30分钟。使用Gelbuddy软件对采集的数据进行可视化分析[54]。对于每次凝胶运行，根据图像质量和引物结合区附近可能发生的PCR错引伪影的缺失，手动选择小于目标扩增子大小的分析窗口[38]。为了考虑凝胶带作为消化片段，对700 nm通道内的条带进行评分，并生成一个二值矩阵，反映每个样品中所有不同片段大小的存在(1)或不存在(0)。

多态性和单倍型分析

为了简化起见，在丙烯酰胺凝胶电泳后看到的每个独特片段都被认为是一个SNP，尽管片段也可能是由小的indels引起的。SNP密度计算为多态性SNP位点数除以筛选序列的总长度(kb)。计算每个SNP位点的非参考核苷酸频率(Non-reference nucleotide frequency, NNFs)，即该SNP等位基因偏离93161P参考等位基因的接入数除以筛选的接入数。每个SNP的平均杂合度Ht(即基因多样性)通过遗传距离和系统发育分析包DISPAN计算[55]。

具有相同SNP模式的材料被分配到同一单倍型。在LI-COR凝胶上没有限制性带的材料被分配到参考单倍型H0 (93161P)。频率低于5%的单倍型被认为是罕见的。计算每个单倍型的非参考单倍型频率(Non-reference haplotype frequency, NHF)，即单倍型偏离参考单倍型(FT1a_H0、FT1b_H0、FL1a_H0、FL1b_H0或BTC1_H0)的加入数除以每次筛选的总加入数b .寻常的的形式。

选择与抽苔率和成活率相关的单倍型显著的材料，采用Sanger测序对其引物组合进行测序。为了预测这些单倍型的snp特征对功能的影响，基于网络的工具PARSESNP [56]及SIFT [57]被使用。

AFLP分析和种群结构分析

268 .人口结构b .寻常的使用AFLP(扩增片段长度多态性)技术分析，基本上与Vos等人描述的一样。[58]。采用以下修饰方法:用PstI而不是EcoRI。

在进行AFLP标记分析后，使用structure 2.3.4版软件包计算种群结构[33，59]。人口的最佳数量(k)是在6次独立运行之后选择的，每个值分别经过5万次迭代和10万次迭代k(测试k= 1到k= 8)。选择具有相关等位基因频率模型的无外加剂模型作为整个面板调查的程序参数。最可能的值k是根据以下标准确定的:(1)值的比较L (K)每一个k;(2)五次运行分组模式的稳定性;(3)基于似然的二阶变化率计算的ΔK值(ΔK = m(|L’(K)|)/s[L(K)]) [60]通过STRUCTURE HARVESTER基于web的界面[61]。

统计分析

关联映射使用TASSEL v. 3.0中的一般线性模型(GLM)进行[62]。在实验α水平为0.05 (Bonferroni校正)的情况下，已知扩增子与结箍率、存活率或存活率与结箍率作为辅助因子存在关联。如果一个特定的扩增子与成栓率或存活率有显著的关联，则称为邓尼特扩增子事后进行所有单倍型与参考单倍型H0的多重比较检验。使用统计软件R [63]分别为每一个b .寻常的的形式。

作者感谢Michaela Jahn出色的技术支持，Monika Bruisch和Erwin Danklefsen在田间和温室工作中提供的大量帮助和支持。该项目由联邦教育和研究部(BMBF)在GABI计划(FKZ: 0315052C和0315058A)中提供资金支持。我们感谢来自Strube Research GmbH & Co.KG的Axel Schechert博士提供的种子材料，以及Gretel Schulze-Buxloh和Sebastian Vogt提供的BvFT1。感谢结构生物系动物研究所的Sonja Hollmer为我们制备芹菜粗提取物，感谢Mario Hassler博士为我们提供统计分析方面的支持。我们也感谢四位未知审稿人的有益评论。

从属关系

1. christian - albrecht - Kiel大学植物育种研究所，Olshausenstr. 40, Kiel, 24098

   Sebastian LM Frerichmann, Martin Kirchhoff, Andreas E m ller, Christian Jung和Friedrich J Kopisch-Obuch

2. Nordsaat Saatzucht GmbH, Böhnshauser Straße, Langenstein, 38895，德国

   马丁·基尔霍夫

3. 气动研究有限公司，德国Hauptstr. 1, Söllingen, 38387

   Andreas E . m勒

4. 德国基尔，christian - albrecht - university of Kiel，动物研究所，结构生物系，德国基尔，24118

   Axel J Scheidig

相应的作者

对应到Friedrich J Kopisch-Obuch。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SLMF计划、实施和分析EcoTILLING试验，进行群体遗传分析和与TASSEL的关联试验，并起草和撰写稿件。MK策划并进行了现场实验，用R进行了统计分析，撰写了部分表型和统计数据分析的稿件，并进行了少量的介绍和讨论。AEM提供序列信息，参与数据分析并修改稿件。AJS提供了CCE并修改了稿件。CJ参与了研究的设计并修改了稿件。FJK构思了这项研究，参与了它的设计、协调和分析，并帮助起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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