栽培黄瓜1681个位点一致遗传图谱，包括67个NB-LRR抗性同源基因和10个基因位点

背景

黄瓜是一种重要的蔬菜作物，对多种病原菌敏感，但尚未克隆出抗病(R)基因。全基因组序列的可用性为系统识别和表征基因组中核苷酸结合和富亮氨酸重复序列(NB-LRR) R型基因同源物(RGH)序列提供了极好的机会。黄瓜的遗传基础非常狭窄，难以构建高密度的遗传图谱。通过综合来自多个分离种群的信息来开发共识图是增加标记密度的一种选择方法。因此，本研究的目的是识别和表征NB-LRR型RGHs，并开发一个以RGH位点为锚定的高密度黄瓜遗传-物理图谱。

结果

从Gy14草图基因组中，鉴定出70个含nb的RGHs并对其进行了表征。多数RGHs呈簇状分布，分布在7条染色体上不均匀。在网上分析表明，所有70个RGHs均有EST支持基因表达。系统发育分析将58个RGHs分为两个分支:CNL和TNL。比较分析发现，这些RGH成员在黄瓜和甜瓜基因组的染色体位置具有高度的同源性和共通性。

开发了54个分子标记，确定70个RGHs中的67个，并通过连锁分析将其整合到遗传图谱中。将3个成分图谱结合bin-mapping策略，在7个连锁群中构建了1681个位点的黄瓜共识图谱，包括10个基因位点，跨度730.0 cM。物理上，共有308个支架，193.2 Mbp的DNA序列被固定在这个共识图谱上，覆盖了367 Mbp黄瓜基因组的52.6%。

结论

C黄瓜含有相对较少的NB-LRR RGHs，这些RGHs聚集在基因组中，分布不均。所有的RGHs似乎都可以转录，并与瓜基因组具有显著的序列同源性和同构性，这表明这些RGHs在瓜的基因组中是守恒的Cucumis血统。本文开发的1681个位点一致的遗传物理图谱和鉴定的RGHs是很有价值的基因组资源，可用于定量性状位点鉴定、基于图谱的基因克隆、关联作图、标记辅助选择以及组装更完整的黄瓜基因组。

近十年来，许多植物抗病基因或数量性状位点(QTL)被克隆出来。已知的最大一类R基因编码具有中央核苷酸结合结构域(NB)和c端富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域的蛋白质[1］．根据氨基末端结构域的特征，NB-LRR蛋白可分为TNL (TIR-NB-LRR)和CNL (CC-NB-LRR)两类，其中R蛋白分别具有Toll/白介素-1受体(Toll/ il -1 Receptor, TIR)结构域和螺旋圈结构域[2］．NB结构域似乎具有ntp水解活性，可通过构象变化调节信号转导[2］．LRR结构域包含串联排列的重复序列，参与病原体效应因子的特异性识别[3.］．TIR和CC结构域都被认为参与蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导[4，5］．

由于全基因组序列的可用性，nb编码抗性基因同源体(RGH)序列已在许多植物物种中被注释和定位拟南芥［6，杨树(杨树trichocarpa) [7土豆(茄属植物tuberosum) [8，9，大米(栽培稻) [10高粱(高粱二色的) [11]，葡萄藤(葡萄) [12，咖啡树(Coffea阿拉比卡) [13),Medicago truncatula［14)和木瓜(番木瓜) [15］．虽然NB-LRR基因广泛分布于植物基因组中，但其数量在不同物种间差异很大。例如，木瓜和葡萄基因组包含55和535个NB-LRR RGHs，分别占其总基因的0.2%和1.8% [12，15］．缺乏最近的基因组复制被认为是木瓜NB-LRR基因数量总体较低的原因[16］．编码nb的基因在植物基因组中分布不均匀，主要以多基因簇的形式组织。假设r基因的聚类分布提供了一个遗传变异库，新的病原体特异性可通过基因复制、不平等交叉、异位重组或多样化选择进化而来[17，18］．此外，核苷酸多态性分析表明，NB-LRR基因的种间和种内变异水平极高，这可能是为了响应病原体种群的变化而迅速进化的[12，19］．然而，也观察到在系统发育相关物种中NB-LRR抗病基因的同源性保持[20.，21］．然而，不同物种之间的NB-LRR RGHs的全基因组保护程度和同向性还没有很好的文献记录。

黄瓜,Cucumis巨大成功L. (2n = 2x=14)是一种经济上重要的蔬菜作物，也是研究几种重要生物过程的首选系统[22］．近年来，新一代测序技术的应用使3个黄瓜品系(' 9930 '、' Gy14 '和' B10 ')的基因组草图得以释放[23- - - - - -25为理解黄瓜基因组中R基因的结构和组织提供了强有力的工具。在9930份基因组草案中，鉴定出61个含有nb的RGHs [23]，但没有给出这些RGH的细节，与9930基因组的改进注释(版本2.0)相比，RGH的数字似乎被低估了[26］．因此，本研究的一个目标是在Gy14基因组草案组装(版本1.0)中对NB-LRR型RGHs进行全基因组范围的识别和表征[27］．由于遗传距离与物理距离的比率在染色体上是不同的(例如，[28])， RGHs的遗传图位置信息，特别是在高密度参考遗传图上的遗传图位置信息，对于R基因的基于基因图克隆或通过候选基因方法进行关联映射非常有用。RGHs与候选抗病基因的关联已在许多作物中得到很好的证实，如甜瓜(Cucumis梅洛) [29，30.，小麦(小麦) [31，黄瓜[32，向日葵(向日葵) [33]和马铃薯[34］．RGHs的遗传和物理位置信息也允许基于地图快速克隆水稻中的几个R基因或QTL [35- - - - - -37，杨树[38]和青豆(菜豆) [39］．

栽培黄瓜的遗传基础非常狭窄[28，40，41使得开发高密度基因图谱变得困难。从整个基因组序列中，已经开发出数以万计的简单序列重复(SSR)标记[24，42］．在迄今构建的所有基于ssr的黄瓜遗传图谱中[27，28，42- - - - - -46，任的那本et al。［42]， 995个SSR位点标记密度最高。然而，该图谱是由有限的重组自交系(RILs)开发的，这些重组自交系来自Gy14和野生黄瓜(c .巨大成功var。hardwickiiPI 183967(以下为CSH-RIL地图)。在该作图群体中发现了较强的重组抑制，超过1 / 4的作图位点聚集在5条染色体(3,4,5,6,7)上，因此该图谱的总遗传距离仅为572.9 cM，比黄瓜基因组预期的~750 cM的图谱长度要短[27］．最新的栽培黄瓜品种内连锁图谱被开发为F₂Gy14 × 9930居群(下称CSS-F2图)包含735个标记位点，全长707.8 cM，可整合遗传和物理图谱，形成Gy14染色体水平的基因组草图(1.0版本)[27］．虽然与早期开发的基于AFLP或rapd的地图相比，这种地图是一个显著的改进，但对于许多基于分子标记的应用，如标记辅助育种、基于地图的基因克隆或组装更完整的黄瓜基因组，该地图上的标记密度仍远远不能令人满意。

对于像黄瓜这样遗传多样性有限的栽培作物，开发一个密集的共识图谱是增加标记密度的一种选择方法，这通常是通过综合来自不同遗传背景的多个分离群体的信息来实现的图谱集成。这使得比对大多数单杂交的更多的位点来饱和图谱，从而为QTL鉴定、基于图谱的基因克隆、遗传多样性评估、关联作图以及分子育种中的标记辅助选择提供了基因组框架[47］．共识图谱已在许多作物物种中建立，如生菜(摘要以) [48，葡萄藤[49，豇豆(豇豆属unguiculata) [50，红三叶草(三叶草pratense) [51，高粱[52]，大豆(大豆) [53，54，瓜[47和油菜，芸苔属植物显著［55］．在黄瓜中，将CSH-RIL图谱(Gy14 × PI 183967 RIL)和S94 × S06 RIL图谱整合，得到1369个位点的一致性图谱[44］．该共识图的一个主要缺点是重组抑制区域的标记顺序没有得到很好的解析，这极大地影响了位点顺序的准确性和生成的黄瓜综合图的质量。因此，本研究的第二个目标是通过整合多个单独的图谱来开发栽培黄瓜的高密度共识图谱，并将本文识别的所有NB-LRR型RGHs固定在该整合图谱上。

我们首先扫描了Gy14草图基因组，并对70个含有nb的RGH序列进行了生物信息学鉴定和表征。在网上研究了黄瓜和甜瓜基因组在转录组中的表达、序列同源性和共线性的守恒性。通过比较Gy14和9930草图基因组序列，我们发现了RGH所在区域的DNA多态性，并在Gy14 × 9930 F上绘制了这些RGH位点的基因图谱₂连锁图谱(CSS-F2图谱)[27］．通过整合3个组分图谱，我们构建了包含1681个位点的黄瓜共识图谱，其中67个RGH位点和10个黄瓜基因被锚定。

黄瓜Gy14基因组中含nb - R基因序列的研究

在黄瓜Gy14草稿基因组中鉴定出70个非冗余的nb编码RGHs。似乎黄瓜基因组中所有的RGH都是单拷贝的，因为BLAST比对Gy14草图基因组组装并没有发现每个RGH序列的任何伪序列。所有70个RGHs的核苷酸和肽序列在附加文件中提供1．根据C端和n端结构域特征，70个rgh可分为6个亚群[6]: N (NB)， CN (CC-NB)， NL (NB- lrr)， TN (TIR-NB)， TNL (TIR-NB- lrr)， CNL (CC-NB- lrr)，每一类分别有3、1、17、5、19、25个成员(表1)．所有70个RGHs的名称、蛋白质结构域特征、支架和Gy14草图基因组位置以及染色体位置均在附加文件中给出2:表S1。Gy14和9930 (Version2.0)中带注释的nb编码rgh [26基本一致。如附加文件所示2:表S1，在9930基因组中，只有两个RGHs在Gy14基因组中缺失，分别是Cucsa.237070和Cucsa.249360;而9930基因组中的Csa5P647620、Csa5P647590和Csa5P647550三个RGHs分别对应于Gy14中的两个RGHs，这表明两个基因组中这些序列的注释不同。

我们将RGH簇定义为包含两个或两个以上RGH成员的小于1Mbp的基因组DNA区域。RGHs在黄瓜基因组中聚集现象明显。在70个rgh中，52个(74%)位于9个簇中，与Gy14支架一致。表中总结了这些集群的特征2，更多详情请见附加文件2:表S1。支架00894和支架02023的RGH位点最多，分别为11个和12个，而支架00919的RGH密度最高:每100 kb基因组DNA序列约有11个RGH位点2)．一些集群中的RGH成员在它们所属的类中似乎是异类的(附加文件2:表S1)。也就是说，除了脚手架02229中的集群外，没有其他集群包含在同一个类中注释的rgh。与RGHs的聚类一致，它们的染色体分布明显不均。黄瓜1 ~ 7号染色体中分别有4、24、11、6、16、2和7个RGHs3.:图S1)。

在网上利用BLAST对黄瓜自交系9930的10个组织中2.2亿个Illumina/GA reads的EST contig组装体进行RGH基因表达分析[26]，以及230万Roche/454的Gy14根和叶组织的原始reads (Wenget al。未发表的数据;程序集可在http://cucumber.vcru.wisc.edu/)．BLAST对齐结果汇总在附加文件中2:表S2。与Gy14叶和根转录组相比，9930 RNA-Seq数据集对黄瓜转录组的覆盖更深入，并显示出更多的BLAST hit和更好的查询序列覆盖。因此，虽然70个NB-LRR序列中有65个在Gy14叶和根转录组中被击中，但它们在9930 EST数据集中似乎都具有EST的表征。从Gy14叶和根EST集合的BLAST命中的读取数(附加文件2表S2)，不同RGHs的表达水平差异显著;部分RGH基因的组织特异性表达也非常明确。

提取每个预测NB抗性蛋白NB结构域的氨基酸序列(从P-loop基序到Kin3基序约120个氨基酸)，用于系统发育分析。NB结构域不完整的蛋白被排除在外。58个NB rgh的NB结构域序列2:表S1)进行对齐，得到的邻接系统发生树如图所示1．CC-NB-LRR (CNL)和TIR-NB-LRR (TNL)两个分支明显，分别包含34个和24个成员。所有CNL和CN类rgh归为CNL支，所有TNL和TN类rgh归为TNL支。同时，N型和NL型RGHs均分散在两组中(图1)．

黄瓜和甜瓜基因组NB-LRR - RGH序列的同源性和同步性

瓜类植物草图的注释基因组已被公布[56］．在此确定的70个黄瓜RGHs序列与瓜选秀基因组blast - alignment。在黄瓜和甜瓜中的染色体位置和草拟基因组支架位置的信息以及这些RGHs的对齐分数在附加文件中提出2:表S3。在70个黄瓜RGH序列中，2个(Cucsa.326910和Cucsa.017500)在瓜draft基因组中没有BLAST命中，4个对齐得分较低2表S3)。剩下的64个RGH序列在甜瓜基因组中都有一个匹配序列，其序列一致性至少为90%，序列覆盖长度的90%，表明这些NB-LRR型RGH在两个基因组之间具有高度的同源性。

Garcia-Maset al。［56]在甜瓜枯萎基因组中鉴定出81个NB-LRR型RGHs，其中37个(45%)位于6个类群中。这些RGH簇在黄瓜和甜瓜基因组中的位置和类别高度保守。根据支架位置和连接图位置，Gy14基因组中的5个RGH簇，脚手架00894 +脚手架01227 (Chr2)、脚手架03356 (Chr3)、脚手架00919 (Chr4)、脚手架02023 (Chr5)和脚手架01024 (Chr7)(表2)2)分别与甜瓜染色体V、IV、VII、IX和I中的五个RGH簇对应良好2表S3)。在相应的黄瓜和甜瓜簇中，RGHs的数量和类别基本一致2表S3)。同时，在黄瓜支架00245 (Chr2)、支架01037 (Chr2)和支架03356 (Chr3)的部分同源序列中，黄瓜RGHs在瓜基因组中未被注释为RGHs (Table2最后一栏)。相反，在黄瓜中唯一没有同源物的瓜类RGH簇是位于瓜IX染色体CM3.5_scaffold00079的第13簇(有4个RGH成员)[56］．

黄瓜和甜瓜染色体的共线关系已基本建立。56，57］．在与瓜基因组同源的65个黄瓜RGHs中，57个位于共tenic block(附加文件2表S3)。我们从甜瓜基因组中随机选取6个NB-LRR序列(MELO3C010346T1, MELO3C004289T1, MELO3C004292T1, MELO3C009694T1, MELO3C022146T1, MELO3C023579T1)，通过BLAST比对，验证它们在黄瓜和甜瓜基因组中的同源关系，它们在甜瓜或黄瓜基因组中均有单拷贝2表S3)。

黄瓜RGH基因座的遗传定位

使用92 F₂植物Gy14 × 9930，杨et al。［27]开发了735个标记位点的栽培黄瓜高密度连锁图谱(CSS-F2图谱)。为了将本文识别的70个RGH固定在该遗传图谱上，我们开发了所有RGH或RGH簇的标记，并将其用于RGH位点的连锁定位。

对Gy14和9930(版本2.0)之间的70个RGHs的DNA序列进行比对，以识别多态性。18个rgh没有表现出多态性2:表S1)。对于这些rgh，开发了侧翼标记，成功锚定了15个rgh。三个rgh, Cucsa.189390、Cucsa.318890和Cucsa.328080(附加文件2:表S1)未能固定在遗传图谱上，因为它们所在的支架相对较短，且没有识别出多态的侧翼标记。对其余52个RGHs进行了单核苷酸、插入/删除(indel)或SSR多态性的鉴定。在可能的情况下，SSR标记优先于snp标记这些rgh。17个RGH在目标RGH序列中存在SNP或indel多态性。snp衍生的dCAPS或索引衍生的STS标记被开发为这17个RGHs的分子标记，而没有开发额外的侧翼标记(附加文件2:表S1)。由于在Gy14 × 9930 F上有多个SSR标记₂高密度地图[27]在物理上非常接近这35个空炮中的许多，新的标记只针对那些没有近侧翼标记的空炮开发。然而，对于一个有多个RGH成员的集群，只有集群侧翼的标记被开发。最终使用54个标记来分隔和锚定67个rgh，其中28个是本研究新开发的(附加文件2:表S1)和26来自杨et al。(2012) (27］．同时，在本研究的多态筛选阶段，开发了20个新标记(共48个)，但没有用于划分RGHs，因为这些标记与附加文件中列出的其他标记相比，更接近目标RGHs2:表S1。

在连锁分析中，来自92 F₂将CSS-F2群体的植株与之前测绘的735个标记的数据相结合[27］．由此得到的连锁图谱包含7个连锁组中的783个位点。该地图的简要统计情况见表3.如图所示2，其中54个分子标记位点划分了67个RGHs。所有RGHs的遗传图谱和物理支架位置高度一致2:表S1和附加文件2:表S4)表明映射数据可靠性高。48个新标记的加入使该高密度遗传图谱的长度略微缩短1.1 cM，为67个NB-LRR RGHs提供了路线图。所有标记的细节，它们在黄瓜基因组中的遗传和物理位置在附加文件中提出2:表S4。

已知，在黄瓜染色体的不同区域(如Li染色体)，遗传距离与物理距离的比例差异显著et al。［28])。在本研究的RGH聚类区域进一步证明了这一点。每个RGH簇的遗传覆盖率(cM)见表2，当与各自的物理跨度进行比较时，清楚地表明这些集群之间的重组率非常不同。因此，该基因作图工作提供了每个簇的基因重组的良好近似，这应该有助于黄瓜R基因的基于地图的克隆。

共识图构建

采用2个步骤对CSS-F2(783个位点和92个F₂植物Gy14 × 9930)(补充资料2:表S4和图2)、CSS-RIL(255个位点，148个RILs为9110Gt × 9930) [45]图谱，以及g14 × PI 183967的CSH-RIL亚种间图谱(995个位点，77个RILs) [42］．首先，识别常见标记，并比较每个链接组的顺序(附加文件3.:图S2)。CSS-F2图谱分别与CSS-RIL和CSH-RIL图谱共享72和185个标记(表2)3.)．在bin作图标记的选择上，3个标记SSR02693、SSR04454和SSR04905在CSS-F2和CSH-RIL的染色体位置不一致。SSR01981的地图位置在CSS-F2和CSS-RIL之间不一致。CSH-RIL和CSS-RIL图谱共有152个标记，其中4个染色体位置不一致(SSR01981、SSR19728、SSR21834和CMCT160a)。根据这些标记所关联的支架及其在不同遗传图谱上的位置，我们认为CSS-F2图谱上的SSR01981、SSR02693、SSR04454和SSR04905以及CSS-RIL图谱上的SSR19728、SSR21834(我们都称为CMCT160a)的染色体位置是正确的。这些和其他标记(见下文)的细节(图谱位置，支架信息等)在组成图谱中染色体位置的差异汇总在附加文件中2:表S5。

从CSH-RIL和CSS-F2图谱中分别筛选出419和387个标记进行bin定位;利用CSS-RIL地图上的所有255个标记进行地图集成。为了减少标记聚类对地图整合的影响，我们将CSH-RIL图第5和7号染色体的4个簇中的标记排除在bin mapping之外。

利用Spearman秩相关系数(r)对各连锁组中共享标记的顺序进行定量评价，结果见附加文件2:表S6。1、2、3、6号染色体上共有标记的顺序在每对图谱之间呈强正相关(平均r > 0.96)。而在第4、5和7号染色体上，CSH-RIL与其他两个图谱的标记顺序相关性较低，这主要是由于CSH-RIL图谱上标记的聚类。

对4号染色体的三组分图谱进行可靠的图谱整合是一个困难的问题。在CSH-RIL图谱上，LG4中有144个位点被映射，但由于重组抑制和标记聚类，仅覆盖37.3 cM [42］．只有15个标记被放置在CSS-RIL地图上的LG4 [45]，地图长度为50.5 cM。CSS-F2图谱的LG4位点与上述两个图谱共有13个和2个标记。从3个个体图谱集成的4号染色体一致性图谱缩小到83.7 cM，与个体图谱和Gy14基因组装配草图上的顺序相比，许多标记的顺序出现了混乱(数据未显示)。此外，使用Gy14草图基因组组装(版本1.0)[27]作为参考，这一地图整合导致了4号染色体远端区域的一个无法解析的大反转。基于这些原因，我们使用CSS-F2(跨越107.4 cM的104个位点)和一个品种内的F₂由PI 249561 × PI 308915(42个标记在96.0 cM，下为CSS-PI-F2图谱)开发的遗传图谱[28］．为bin映射选择的所有标记都在附加文件中指明2:表S7(在“Bin”列中)。

得到的共识骨架图包含7个连锁组(染色体)中的487个仓(附加文件)3.:图S3)。接下来，所有剩余的标记，包括67个rgh在组成图上的所有分子标记，根据它们的原始bin位置分配到共识bin map。对于4号染色体，重新填充的标记不仅包括CSS-F2和CSS-PI-F2图谱上的残留标记，还包括来自cssh - ril和CSS-RIL图谱上的残留标记。在CSS-F2、CSS-RIL和CSH-RIL图谱中有33个染色体位置冲突的标记(列于附加文件中)2:表S5)。基于这些标记所关联的支架，以及来自同一支架的其他标记的染色体位置，本文构建的CSS-F2图谱上这33个标记的染色体位置被认为是正确的，并被分配到共识图谱(附加文件)2:表S7)。

最终的黄瓜共识图谱包含1681个标记位点，其中包括67个NB-LRR型RGHs标记和10个基因位点，这是迄今为止构建的最密集的黄瓜遗传图谱。在这些标记中，1640个来自黄瓜基因组，41个来自甜瓜基因组。几乎所有标记(1671个中的1656个)都是共显性ssr。这张共识图谱上的黄瓜基因包括bibitterfree,情事属实者对于抗结痂，cp对于紧凑的植物生长习惯，d对于暗沉的果皮，Fgynoecy,fr对于水果肋骨，H对于成熟果实的重网，米对于双性花，u对于均匀的未成熟果实颜色，和与它们翠绿的叶子[28，32，45，58］．黄瓜遗传图谱的详细信息见附加文件2:表S7，并在表中总结3.．7个连锁组(染色体1 ~ 7)的整体遗传长度为730 cM，相邻标记之间的平均距离为0.44 cM。平均而言，每条染色体有240个标记，其中3号染色体的标记数量最多，为316个。三个组分图和共识图之间的标记顺序比较表明，所有7条染色体的标记顺序高度一致，这从标记顺序的斯皮尔曼秩相关系数(r)中得到了证明(附加文件)2:表S6)。4号染色体一致性图谱在标记数和图谱长度上均明显优于单个图谱。

物理上，将308和275个Gy14和9930草图基因组组合支架分别固定在两个草图基因组序列的95% (193.2 Mb)和83% (202.4 Mb)的集成图谱上(表3.)．Gy14基因组组装草图1.0版本中所有一致性图谱上的定位位点在附加文件中提供2:表S7。在1681个标记中，只有102个没有在网上PCR产物或BLAST命中Gy14和/或9930草图基因组支架。共识连锁图谱上的位点顺序与它们在Gy14基因组装配草图中的物理位置基本一致，这表明该整合遗传图谱高度可靠(附加文件2:表S7)。

NB-LRR型RGHs在黄瓜基因组中的数量和分布

我们在Gy14基因组草案中鉴定了70个NB-LRR型RGHs2:表S1)。黄瓜基因组中NB-LRR型抗病基因的数量明显低于甘薯等品种拟南芥(212) (6]，稻米(535)[10]，葡萄藤(459)[12]和马铃薯(435)[8]，但与木瓜的相似(55)[16和瓜(81)[56］．木瓜的低数量被认为是由于在其基因组进化过程中缺乏全基因组复制(WGD) [16］．在未经历WGD的葡萄基因组中[59]，最近通过串联复制的扩展被认为是大量编码nbs基因的原因[12］．黄et al。［23]注意到脂氧合酶(LOX)基因家族在黄瓜基因组中显著扩大，并提出这可能是一种应对生物胁迫的补充机制。另一方面，虽然甜瓜基因组中有少量NB-LRR型RGHs，但包括RLK(受体样激酶)、KIN-GNK2(受体样激酶-银杏素-2结构域)、RLP(受体样蛋白)、Pto-like或MLO-like RGHs在内的抗性基因的总数并不显著少于拟南芥或葡萄藤[56］．因此，瓜类作物中NB-LRR型抗性基因较少的原因值得进一步研究。尽管如此，从本研究中得到的这些基因定位的NB-LRR RGHs在黄瓜基因组抗病基因的基于地图的克隆或关联定位研究中应该是有用的。例如，单一显性结痂(枝孢属法测定)抗性基因;情事属实者，已被精细映射[32与大的NB-LRR集群(在Gy14脚手架00894，附加文件。2:表S1)在黄瓜2号染色体短臂(图12)．

克隆的R基因表达研究在未受挑战的植物中检测到低水平的转录本(即构成表达)[60，61］．棕褐色et al。［62]分析了约170个NB-LRR及相关基因的表达谱拟南芥，并发现这些基因中的大多数在不同的组织特异性中以低水平表达。已知抗病是植物nb - lrr编码基因的主要功能[1]，但不应排除它们的其他生物学作用。在这项研究中，通过检查大量RNA-Seq数据，我们发现了黄瓜转录组中所有70个RGHs的EST表达;我们还发现其中一些基因的表达是组织特异性的(附加文件2:表S2)。这些观察结果可能表明，在这里识别的所有RGHs都可能在黄瓜基因组中表达。然而，还需要进一步的研究来了解这些RGHs的功能及其组织或器官特异性。

黄瓜和甜瓜基因组中NB-LRR RGHs的保存

先前的研究发现，NB-LRR基因表现出高度的种间和种内变异，这可能是为了响应病原体种群的变化而迅速进化的[12，19］．在茄科植物(番茄、马铃薯和辣椒)中发现了几个NB-LRR基因的序列保守和同源性[20.，63］．之间的nb - lrr编码基因的全基因组比较拟南芥而且答:lyrata发现这两个物种的NB-LRR基因数量相似[64］．在本研究中，在70个黄瓜RGHs中，65个具有同源性，57个位于瓜基因组的共tenic块中2表S3)。在黄瓜的9个RGH簇中，有6个也被注释为编码甜瓜基因组中的NB-LRR型RGHs，并且所有的RGHs都位于共tenic block (Table2，附加文件2表S3)。然而，在具有44个RGH成员的6个黄瓜簇的共纤区，只有32个RGH在瓜基因组中被注释(表2，附加文件2表S3)。看来，对瓜类基因组的注释需要在这些区域进行改进，以解决这些差异。然而，很明显，这些RGH在黄瓜和瓜的基因组中在序列同源性和染色体位置上都高度保守，这表明在这两个物种中，这些RGH的同源物在大约1000万年前分离出来，具有相似的进化历史[65］．

黄瓜高密度一致性图

利用3个群体的分离数据，构建了基于ssr的黄瓜综合遗传图谱。该图谱的目的是用在其他映射实验中已经映射的标记填补每个个体图谱上的较大空白，并解决CSH-RIL图谱上重组抑制区域的标记顺序。黄瓜共识图谱由1681个标记位点组成，其中大多数标记被固定在Gy14和/或9930草图基因组支架上2:表S7)。在迄今构建的黄瓜连锁图谱中，该综合图谱的标记密度最高。与CSS-F2地图相比(附加文件2:表S4，图2)，该共识图谱显著增加了标记位点的数量(从783增加到1681)，标记密度(0.96 cM增加到0.44 cM)，锚定了Gy14基因组草图序列(233个支架，173.1 Mbp对308个支架，193.4 Mbp)，以及总图谱长度(706.7 cM对730.0 cM)(表3.)．同样，这张综合地图也显示出了与张的黄瓜共识图相比的几个显著改进et al。［44]的数量(1681对1369个位点)、锚定基因组序列(193.4 Mbp对172.5 Mbp的9930基因组草案)和地图长度(730.0 cM对700.4 cM)。当前共识图上标记顺序的准确性也比之前的有所提高[44］．这对于染色体4、5和7中的标记尤其正确，这可以从一致图谱上的标记顺序和Gy14基因组组装草案中的标记顺序的比较中看到2:表S7)。考虑到栽培黄瓜的遗传基础非常狭窄，地图整合使我们能够在任何单个地图上放置更多的标记，从而获得更完整的黄瓜基因组覆盖。该图谱整合了67个NB-LRR RGH位点，在分子定位、基因克隆、QTL分析、标记辅助选择、比较基因组学以及全基因组组装研究等方面具有广泛的潜在应用价值。

C黄瓜含有相对较少的NB-LRR型RGHs，这些RGHs聚集在基因组中，分布不均。从它们在ESTs中的存在可以证明，所有的RGHs似乎都是转录的。这些NB-LRR型RGHs在核苷酸序列上具有显著的同源性，在染色体位置上具有高度的同步性，表明这些RGHs在基因组组织和功能上具有高度的保守性Cucumis血统。这张高质量的1681个基因位点一致图谱是迄今为止构建的最密集的黄瓜遗传图谱。所鉴定的RGHs和构建的高密度遗传物理图谱为黄瓜数量性状位点的定位、基于图谱的基因克隆、遗传多样性评估、关联作图以及分子育种中的标记辅助选择等分子标记基础研究提供了宝贵的基因组学资源。

黄瓜基因组NB-LRR型RGHs的鉴定与鉴定

本研究采用了Gy14 (Version 1.0)和9930 (Version 2.0)黄瓜草图基因组组装和注释[26，27Gy14注释可在http://www.phytozome.net/cucumber.php#A)．

NB-ARC蛋白结构域(登录号:PF00931)序列从Pfam数据库(http://pfam.sanger.ac.uk)作为种子，利用原始隐马尔可夫模型(HMM)，通过HMMER V.3提取Gy14草图基因组中的所有NB序列同源物[66］．共识别出80个候选序列，其中一个高质量的蛋白集(<1e-60)与Clustal X (V2.0)对齐[67]，并使用“hmmbuild”模块构建黄瓜特异性NB HMM，然后使用“hmmsearch”在较低的阈值(<1e-5)下鉴定黄瓜基因组中的蛋白质，得到70个蛋白质。

这些含有NB结构域的蛋白质被用于寻找植物R蛋白的特征结构域:n端区域的TIR或CC结构域和c端区域的LRR结构域。为了检测这些保守结构域，使用Pfam版本26.0对nb编码蛋白进行了表征。聪明的(http://smart.embl-heidelberg.de/)用于确认TIR和LRR域的身份。CC区域的预测使用了COIL程序(http://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)，使用默认设置，严格度为90%阈值。无TIR或LRR结构域的RGHs通过人工注释验证。从Gy14草图基因组支架中提取RGH DNA序列，包括额外的2000 bp上游和下游序列，并用Augustus (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)使用9930张光碟(版本2.0)[26]作为参考序列。使用Clustal X和默认参数对含有nb的蛋白质进行排列。随后，Jalview(版本2.0)[68]被用来修剪两端，以消除不对齐的区域。对于具有完整NB结构域的RGHs，提取每个NB结构域(从P-loop基序到Kin3基序约120 AA)的氨基酸序列，并用于进行系统发育分析。58个NB域序列(附加文件2:表S1)进行对齐，使用MEGA 5中的邻居连接方法构建系统发育树，自举1000次重复[69］．

为了描述RGH在基因组中的分布，RGH簇被宽泛地定义为具有两个或两个以上RGH的最大1Mbp序列的染色体区域。在网上利用BLAST比对两组黄瓜EST数据集，对NB-LRR RGHs进行表达分析。第一个是9930转录本组装(版本2.0)，来自来自黄瓜9930系10个不同组织的近2.2亿个Illumina测序reads [26];第二组包括230万Roche/454解读的Gy14叶和根组织http://cucumber.vcru.wisc.edu/)(翁et al。未公开的数据)。序列一致性95%、查询长度覆盖90%的BLAST命中被认为是EST支持RGH基因在基因组中表达的证据。

黄瓜和甜瓜基因组RGH序列同源性和染色体定位同源性的比较分析

从瓜的基因组序列草稿来看，Cucumis梅洛，鉴定出81个含nb的RGHs [56］．为了研究黄瓜和甜瓜之间RGH位点的序列保守性和共线性性，将70个黄瓜RGH序列与黄瓜和甜瓜的基因组组装进行BLAST比对。当序列识别率为>90%，覆盖率为>95%，且两者基因组中均无同源序列时，认为黄瓜RGH查询序列与甜瓜RGH查询序列是同源的。比较甜瓜和黄瓜中这些黄瓜RGHs染色体块的同源性与目前对甜瓜-黄瓜染色体同源性的认识[56，57］．

黄瓜基因组NB-LRR RGHs的遗传和物理定位

由于70个NB-LRR型RGHs所属的支架信息已知，将这些RGHs映射到Gy14草案基因组组装(1.0版本)中的物理位置相对直接[27］．三个RGHs Cucsa.189390、Cucsa.318890和Cucsa.3280802:表S1)没有固定在图上，因为它们相关的支架太小，这些支架上的标记没有被映射到黄瓜的高密度连锁图上。

对于RGHs的连锁定位，通过对Gy14和9930黄瓜系之间的RGHs及其周围DNA序列的DNA多态性(snp和Indels)进行比对，确定了RGHs及其周围DNA序列的多态性(snp和Indels) [27]及9930 [26起草基因组序列。从目标区域设计基于索引的STS、基于snp的dCAPS或SSR标记。如果RGH序列内没有多态性，则开发目标RGH位点的侧翼标记。在此之前，一个与92 F₂以Gy14 × 9930为材料，构建栽培黄瓜735个位点的高密度遗传图谱[27］．本研究利用该群体在遗传图谱上整合RGH位点。随后进行分子标记分析和连锁图谱构建et al。(2011) (57］．

用于构建共识图谱的成分遗传图谱

本研究使用三个基于ssr的黄瓜连锁图谱进行共识图谱构建。以Gy14 × 9930 F的品种内杂交群体为研究对象，绘制了两幅图谱₂来自本研究的地图(CSS-F2地图，783个位点)(附加文件2:表S4，图2)和9110Gt × 9930 RIL图谱(248个SSR标记加上用148个RILs构建的7个基因，CSS-RIL图谱)[45］．第三个是Gy14 × PI 183967亚种间RIL图谱(995个SSR位点与77个RILs相对应，CSH-RIL图谱)[42］．这三个图谱共享了大量的SSR标记。为了定量评估这些共享标记的共线性，使用统计软件SAS 9.3中的PROC CORR程序计算成对地图间标记顺序的Spearman秩相关系数。使用Circos程序(http://circos.ca/) [70］．

黄瓜连锁图谱的建立

对于三张独立地图上的所有标记，在网上采用Gy14和9930草图基因组支架作为模板进行PCR，将标记分配到支架上，揭示两个亲本基因组之间的多态性，并估计预期PCR产物的拷贝数。这是使用一个自定义Perl脚本执行的，该脚本使用NCBI BLASTN程序作为搜索引擎[24］．如果没有在网上获得PCR产物后，利用每个标记的引物序列对两个草稿基因组进行BLAST搜索，以确定其支架位置。如果没有或有多个在网上PCR产物或BLAST命中，该标记在基因组中分别被标记为“无命中”或“多拷贝”。

对个别地图的原始制图数据的质量进行了双重检查。显示不可能的局部双交叉的标记被消除了。在地图集成之前，使用前面描述的程序为CSS-F2和CSH-RIL地图的每个连锁组生成特定人群的bin地图[55］．一个bin被定义为遗传图谱上一个或多个标记在1 cM遗传距离内的唯一位置。在每个bin中，选择一个或多个标记，以提供与其他特定人群地图(共享位点)的连接，或最大化信息内容。利用CSS-RIL地图上所有255个映射位点进行地图整合。使用JoinMap 3.0为每个连锁组所选的代表性位点集生成成对重组频率和LOD评分，然后将它们组合成导航树中的单个组节点。在JoinMap3.0中，“组合组用于地图集成”功能基于平均重组频率和组合LOD得分执行地图计算。

在CSH-RIL图谱上，10个聚类共有247个标记。第5号和第7号染色体中最大的4个簇标记的地图整合只在CSS-F2和CSS-RIL之间进行。对于第4染色体上的标记的图谱整合，CSS-F2图谱与另一个品种内黄瓜F₂由PI 249561 × PI 308915 (CSS-PI-F2图谱)开发的遗传图谱[28都被雇用了。4号染色体的Bin map构建过程与其他染色体相同。

构建共识bin map(骨架图)后，将包含70个RGH基因座的所有分子标记的单个图的每个原始bin中的残余标记重新引入并分配到整合图上各自的bin位置。此外，黄瓜的三个基因米双性花表达基因[58),cp紧凑植物的生长习性[28),而情事属实者［32对于结痂抗性的克隆或精细映射。根据支架的位置，他们被放置在这个一致的基因图谱上。最后，基于标记-支架的关联，将Gy14和9930草图基因组支架与共识遗传图谱对齐，形成完整的遗传-物理图谱。

妊娠:

扩增片段长度多态性

弧:

APAF-1, R蛋白和CED-4

爆炸:

基本的本地对齐搜索工具

答:

卷曲螺旋

dCAPS:

导出劈裂扩增多态序列

美国东部时间:

表达序列标记

鱼:

荧光原位杂交

Mbp:

百万碱基对

格林:

连杆组

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

NB-LRR:

核苷酸结合-富含亮氨酸的重复序列

RAPD:

随机扩增多态DNA

QTL:

数量性状位点

RGH:

抗性基因同源

瑞来斯:

重组自交系

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

STS:

序列标记的网站

行动:

Toll，白细胞介素-1和R蛋白

作者感谢Linda Crubaugh的技术帮助。本研究得到了美国科学与技术研究所(USDA-SCRI)的资助。2011-51181-30661);IS-4341-10从美国BARD -以色列两国农业研究与发展基金到YW。

作者指出

从属关系

1. 威斯康辛大学园艺系，美国威斯康星州麦迪逊53706

   杨鲁明，李大为，李玉红，翁益群

2. 西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100

   李大伟、李玉红

3. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100018

   顾杏芳、黄三文

4. 农业基因组学研究中心，西班牙巴塞罗那，贝拉特拉，08193

   乔迪Garcia-Mas

5. 美国农业研究署蔬菜作物研究小组，威斯康辛大学园艺系，威斯康辛州麦迪逊53706

   益翁

相应的作者

对应到益翁．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

LY对甜瓜和黄瓜的RGHs进行了高密度遗传定位、图谱整合和比较分析。DL对RGH基因座进行了识别、表征和映射。YL对黄瓜进行了基因定位。XF和SH为组件映射的集成提供映射数据。JG-M提供了甜瓜基因组序列，用于与黄瓜进行NB-LRR比较。YW构思了这项研究，设计了实验，进行了部分数据分析并撰写了手稿。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。

杨鲁鸣、李大为对这项工作都有贡献。

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